Журнал аналитической химии, 2022, T. 77, № 11, стр. 1016-1031

ВЫБОР ИСХОДНЫХ ДАННЫХ И ПОДГОТОВКА ПРОБ К АНАЛИЗУ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)

Общая характеристика четырех рассматриваемых примеров. Для исключения поиска и сравнения информации из недостаточно систематизированных источников разного времени издания сведения о составе проявителей для черно-белых негативных фотоматериалов (пример 1) заимствованы из руководства [10], относящегося к периоду большого разнообразия как самих негативных фотоматериалов, так и рецептов растворов для их обработки (1964 г.). В качестве источника сведений о режимах газохроматографического анализа с программированием температуры для пяти аналитов (нитробензол, бензонитрил, 2‑хлорфенол, 1,4-диметоксибензол и 1,3,5-трихлорбензол) выбрана база данных Национального института стандартов и технологии (NIST, США) (сайт http://webbook.nist.gov) [11], содержащая подробные сведения обо всех соединениях, индексы удерживания которых в нее включены (пример 2). Выбранные параметры включают начальную температуру (Т₀, °С), продолжительность начального изотермического участка (t(T₀), мин) и скорость нагрева (r, град/мин). Данные о токсичности (величины LD₅₀, пример 3) 1-алканолов С₃–С₁₂ заимствованы из различных литературных источников [12–18]. Многие из них содержат дублирующие друг друга значения LD₅₀, выявление и отбраковку которых не проводили. И, наконец, описания процедур подготовки проб лекарственных препаратов (51 соединение различной химической природы) резюмированы на основании оригинальных публикаций и данных, полученных в ЗАО “Биокад” (см. ниже) (пример 4). Экспериментальные данные, соответствующие каждому из рассматриваемых примеров, и необходимые ссылки приведены в табл. 1–4, номера которых согласованы с номерами примеров. Значения факторов гидрофобности (lgP) и степени связывания лекарственных препаратов с белками указаны на сайте Drugbank [62].

Подготовка проб к анализу. Данные табл. 4, соответствующей последнему рассматриваемому примеру и содержащей сведения об операциях подготовки проб плазмы крови для ВЭЖХ-определения лекарственных препаратов, дополнены информацией для нескольких препаратов, методики анализа которых разработаны в ЗАО “Биокад” (Санкт-Петербург). Их стандартные растворы с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением навесок анализируемых субстанций в подвижной фазе (состав растворителей соответствовал начальным составам элюентов в режимах градиентного элюирования). В качестве матрицы для приготовления модельных растворов использовали плазму крови здоровых добровольцев, хранившуюся в замороженном виде при температуре не выше –70°С.

Образцы для ВЭЖХ-анализа готовили по одной из следующих схем. 1). Жидкостно-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) проводили путем добавления к аликвотам образцов экстрагента (1 : 3), полученные растворы перемешивали, центрифугировали, органические экстракты упаривали в токе азота, сухие остатки вновь растворяли в подвижной фазе. 2). Для осаждения белков плазмы крови в качестве осадителя использовали ацетонитрил в соотношении 1 : 3; полученные растворы перемешивали, центрифугировали, надосадочные слои переносили в виалы для хроматографического анализа. 3) Твердофазную экстракцию (ТФЭ) проводили с использованием картриджей (Oasis, Waters, США); наносили на них пробы и пропускали через картриджи различные растворители для элюирования примесей и целевых аналитов по отдельности. 4) Для фильтрации белков плазмы использовали центрифужные ультрафильтры Amicon® Ultra 3K (Millipore, США). В пробирки с фильтрами вносили заданные объемы образцов, центрифугировали; прошедшие через мембраны количества растворов отбирали для хроматографического анализа.

Во всех перечисленных примерах исходная информация отличалась значительной вариабельностью, а разброс числовых данных настолько велик, что какая-либо коррекция единичных значений в подобных массивах (выявление выбросов) [63] представляется невозможной. Для статистической обработки исходных данных и построения графиков использовали ПО ORIGIN (версии 4.1 и 8.1). Именно значительная вариабельность исходных данных ограничивает применение более сложных методов их интерпретации (факторный или кластерный анализ). Кроме того, во всех примерах число доступных значений недостаточно для корректного применения таких методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности компонентного состава метол-гидрохиноновых проявителей для негативных черно-белых фотоматериалов. Начать рассмотрение совокупностей данных с большим разбросом целесообразно с одномерных массивов, для которых применима обычная статистическая обработка. По современным представлениям наилучшие результаты обработки фотоматериалов обеспечивает строгое воспроизведение условий, в том числе состава растворов, продолжительности обработки и ее температурного режима (максимальная стандартизация). Однако 50–60 лет назад ситуация была принципиально иной: для многочисленных негативных фотоматериалов (с разной спектральной чувствительностью) использовали большое число проявителей различного назначения, в том числе нормальных (стандартных), мелкозернистых, контрастных, для снижения контраста, для увеличения светочувствительности, для передержанных фотоматериалов, для высоких температур обработки и т.д. Все такие проявители различались сочетаниями компонентов и их содержанием. Если ограничиться только метол-гидрохиноновыми проявителями²² для негативных фотоматериалов, то содержание компонентов в 19 из них по данным руководства [10] приведено в табл. 1.

Назначение такого многообразия составов в том, чтобы в зависимости от особенностей конкретного фотоматериала или условий съемки выбрать оптимальный вариант его обработки. Однако можно представить иную вполне реальную ситуацию: тип фотоматериала, особенности его экспозиции и, следовательно, априорные требования к обработке неизвестны. Иными словами, здесь мы имеем дело с иной формулировкой исходной гипотезы. В подобных случаях выбор конкретной рецептуры проявителя из числа ранее известных явно нерационален, и, следовательно, требуется изменение логической схемы действий. Из неопределенности формулировки задачи следует предпочтительное использование рецептуры, состав которой соответствует усредненным количествам всех компонентов (средние арифметические значения приведены в последней строке табл. 1).

Вариации содержания отдельных компонентов (размах) весьма велики и составляют 0–14 (метол), 0–45 (гидрохинон), 40–250 (сульфит натрия), 0–90 (карбонат натрия) и 0–20 г/л (бромид калия). Неудивительно, что для некоторых из них (гидрохинон, карбонат натрия и бромид калия) формальное вычисление стандартных отклонений приводит к величинам, превышающим их средние арифметические значения. Для двух остальных компонентов относительные стандартные отклонения (коэффициенты вариации) составляют 80% (метол) и 58% (сульфит натрия). Если стандартное отклонение некоторой величины больше ее среднего значения, то в практике математической обработки результатов измерений [64] это означает, что такая величина статистически незначима, и ее можно полагать равной нулю. Однако применительно к рассматриваемой задаче подобная интерпретация неприемлема и должна быть изменена: это подтверждает возможность отсутствия такого компонента в составе проявителя в отдельных случаях.

Если рассматриваемые наборы данных {x_i} очевидно асимметричны (как в данном случае), то они могут быть охарактеризованы фактором асимметрии (А). Один из способов оценки этого параметра подразумевает независимое вычисление двух стандартных отклонений. Первое характеризует данные, превышающие среднее арифметическое значение, s(+), а второе соответственно меньшие, s(–). Их отношение А = s(+)/s(–) и является характеристикой асимметрии [65]. В нашем случае все значения А (указаны в последней строке табл. 1) значительно превышают единицу (от 1.5 до 3.5). Это типично для всех массивов данных, ограниченных “снизу” нулем, тогда как “сверху” таких ограничений нет.

Подобный разброс данных по составу проявителей заслуживает комментариев. Прежде всего, он соответствует некоторой среднестатистической рецептуре. Если рассмотреть 11 перечисленных в табл. 1 конкретных составов, то вычисленные средние значения лучше всего соответствуют проявителям НП-3 и “для выравнивания контраста изображения”. Кроме того, небезынтересно заметить, что если оценить точность задания требуемых количеств ингредиентов “на глаз” приблизительно как ±50 отн. %, то стандартные отклонения полученных средних значений превышают эту величину. Это означает, что при приготовлении подобных проявителей вполне можно исключить такую операцию, как взятие точных навесок компонентов, что тем не менее обеспечивает вполне приемлемый уровень качества обработки фотоматериалов.

Как отмечено выше, аналогичные примеры статистической обработки данных, характеризующихся заметным разбросом, встречаются при вычислении масс-спектров ионных серий [7], что определяется характером выбранной гипотезы (решение задач групповой масс-спектрометрической идентификации органических соединений).

Сравнение температурных режимов газохроматографического анализа различных органических соединений. Следующий по сложности пример совокупностей данных, характеризующихся большим разбросом, может быть представлен и как одномерный, и как двумерный массив. Это – параметры газохроматографического разделения различных аналитов с программированием температуры, а именно начальная температура (Т₀, °С), продолжительность начального изотермического участка (t(T₀), мин) и скорость нагрева (r, град/мин). Подобные сведения из разных источников информации доступны на сайте Национального института стандартов и технологии (NIST, США) (http://webbook.nist.gov) [11], где они приведены для всех соединений, охарактеризованных индексами удерживания. Для иллюстрации особенностей такой информации можно выбрать любые соединения, однако для сокращения объема обсуждения ограничимся пятью аналитами: нитробензолом, бензонитрилом, 2-хлорфенолом, 1,4-диметоксибензолом и 1,3,5-трихлорбензолом. Некоторые из значений Т₀, t(T₀) и r для них приведены в табл. 2.

Как и в предыдущем примере, обращают на себя внимание заметные вариации всех характеристик режимов программирования. При этом стандартные отклонения параметров Т₀ и r не превышают соответствующих средних величин, чего нельзя сказать о продолжительности начального изотермического участка (r). Из общих положений можно было бы полагать, что начальные температуры T₀ могли бы быть как-то связаны с химической природой аналитов, например, со значениями их индексов удерживания. Однако проверка зависимости RI−T₀ показывает, что эти параметры слабо коррелируют между собой (рис. 1) и речь может идти всего лишь о некоторой слабо выраженной тенденции увеличения начальных температур режимов программирования для аналитов с большими индексами удерживания. Особенно это заметно, если предварительно не усреднять значения Т₀, t(T₀) и r для каждого соединения (рис. 1а), а нанести на график точки, соответствующие всем значениям этих параметров (рис. 1б). Коэффициент корреляции (R) в случае (б) составляет всего 0.075, что подтверждает отсутствие линейной связи переменных.

Рис. 1.

График, иллюстрирующий отсутствие линейной зависимости индексов удерживания (RI) некоторых аналитов от выбранных для их газохроматографического разделения начальных температур режима программирования (Т₀); (а) – для средних значений Т₀, (б) – по всем данным табл. 2. Параметры линейной регрессии RI = aT₀ + b: a = 0.18 ± ± 0.45, b = 1047 ± 28, R = 0.053, S₀ = 73.

Если так, то вместо средних значений Т₀, t(T₀) и r для каждого из аналитов вполне можно вычислять и использовать общие средние значения и стандартные отклонения этих аналитических параметров, приведенные в последней строке табл. 2. Поскольку в интервалы ±2s_RI должно попадать приблизительно 95% значений выборки, то эти данные соответствуют интервалу Т₀ от 10 до 100°С (нет выбросов), t(T₀) до 8 мин (один выброс, 10 мин) и r до 11 град/мин (нет выбросов). Коэффициенты асимметрии (А) всех указанных параметров по той же причине, как и в предыдущем случае составляет от 1.6 до 3.5 (последняя строка табл. 2). Из этого следует достаточно неожиданный вывод: при выборе режимов программирования температуры для различных соединений величины Т₀, t(T₀) и r можно задавать в широких интервалах, что не сказывается на разделении аналитов. Наибольшее, на что может повлиять неоптимальный выбор условий разделения (например, слишком малые значения T₀, большие t(T₀) и малые r) – это неоправданное увеличение продолжительности анализа. Иногда применительно к выбору режимов разделения можно встретить употребление выражения “разработка методики” (хроматографического анализа или, точнее, разделения). Однако с учетом сделанного вывода относительно больших вариаций параметров Т₀, t(T₀) и r следует признать, что правильнее было бы говорить о выборе некоторых значений из допустимых диапазонов.

Характеристика токсичности (LD₅₀) гомологов на примере 1-алканолов С₃–С₁₂. Следующий пример также может рассматриваться и как одномерная, и как двумерная совокупность данных. Для значений LD₅₀ конкретных соединений обычная статистическая обработка формально возможна (если это согласуется с принятой гипотезой), а сравнение таких данных для нескольких гомологов превращает массив в двумерный, когда для вычисления параметров регрессионных уравнений необходимо применение метода наименьших квадратов. Токсичность различных химических соединений представляют собой одну из их важнейших характеристик, однако ее определение (особенно in vivo) представляет собой весьма длительную, трудоемкую и дорогостоящую операцию. Известны многочисленные попытки теоретической оценки параметров токсичности (LC₅₀ или LD₅₀), однако поскольку это не является предметом рассмотрения настоящей работы, ограничимся лишь несколькими ссылками [66–70]. При этом важно заметить, что расчетные методы, так или иначе, базируются на экспериментальных данных, но если их разброс велик, то из этого неизбежно следует низкая точность всех получаемых оценок [63].

В табл. 3 приведены некоторые данные по токсичности (LD₅₀, мг/кг, перорально) 1-алканолов С₃–С₁₂ для различных теплокровных животных (крыса, кролик, мышь, хомяк, собака, (без уточнения породы), птица (то же) и одно значение для человека (1-пропанол)). И здесь обращает на себя внимание значительный разброс данных. Если попытаться усреднить значения LD₅₀ для спиртов С₃–С₆ (охарактеризованы наиболее подробно) по отдельности, то получаем оценки, для которых коэффициенты вариации составляют 45–80% (указаны в табл. 3). Кроме того, примечательно, что выборки данных для спиртов С₄ и С₅ практически симметричны: значения фактора асимметрии для них близки к единице и составляют 0.90 и 0.97 соответственно. Если ограничиться только одним видом животных (подробнее всего представлены крысы), то ситуация с разбросом данных принципиально не изменяется. По этой причине в дальнейшем можно рассматривать всю совокупность объектов без какого-либо дополнительного подразделения. При цитировании литературных источников в табл. 3 использован тот же принцип, что и в публикации [71]: указаны ссылки на конкретные работы, но иногда упомянуты доступные в Интернете SDS-страницы компаний, выпускающих те или иные химические реактивы.

Этот пример позволяет проиллюстрировать, к каким парадоксам может приводить интерпретация данных, характеризуемых высокой вариабельностью. Если вычислить средние арифметические значения LD₅₀ для каждого из спиртов С₃‒С₁₂, то на графике им соответствует гладкая синусоидальная кривая с двумя экстремумами (рис. 2а). Если же рассматривать всю совокупность данных без предварительной обработки (рис. 2б), то их графическое представление иллюстрирует значительный разброс. Авторы не могут не отметить тот факт, что мнения специалистов относительно возможности и невозможности характеристики токсичности гомологов средними значениями разделяются приблизительно в равной пропорции. Однако здесь важно подчеркнуть, что этот выбор также является следствием той или иной исходной гипотезы. Если учесть, что исходные значения LD₅₀ для каждого из спиртов получены для разных животных, то их усреднение недопустимо. Если же пренебречь такой информацией, то приемлемо не только усреднение данных для каждого из гомологов, но и для всей их совокупности. В таком случае весь набор значений LD₅₀ можно охарактеризовать общим средним значением и его стандартным отклонением: (2600 ± 1600) мг/кг и на основании этого заключить, что имеющиеся данные не подтверждают зависимость токсичности 1-алканолов C₃–C₁₂ от числа атомов углерода в молекуле. Этот вывод имеет общий характер: если для линейной регрессии y = ax + b стандартное отклонение коэффициента “а” превышает его абсолютную величину, s_a > ∣a∣, то следует предпочесть обычное усреднение данных.

Рис. 2.

(а): Графическая иллюстрация зависимости средних арифметических значений LD₅₀ каждого спирта от числа атомов углерода в молекуле 1-алканола; (б): то же для всех исходных данных табл. 3: параметры линейной регрессии (линия тренда) LD₅₀ = an_C + b: a = 78 ± 73, b = 2200 ± 400, R = 0.10, S₀ = 1600.

Выбор операций подготовки проб при определении лекарственных препаратов в плазме крови в зависимости от их гидрофобно-гидрофильных свойств. Последний рассматриваемый пример обработки и интерпретации данных, характеризующихся большим разбросом, наиболее сложен. Во-первых, он относится к двумерным массивам, причем одну из переменных необходимо выбрать искусственно (ввести ранги операций подготовки проб). Второй фактор – актуальность рассматриваемой проблемы. Определение лекарственных препаратов в биологических жидкостях представляет собой весьма трудоемкую задачу, прежде всего, из-за сложности матрицы и, как следствие, стадии подготовки проб. Поскольку предпочтительным аналитическим методом при решении подобных задач является обращенно-фазовая ВЭЖХ, то на этой стадии необходимо обеспечить не только концентрирование целевых аналитов, но и удаление мешающих компонентов, в первую очередь – белков. Подготовка проб чаще всего включает следующие операции: жидкостно-жидкостную и твердофазную экстракцию, осаждение белковых компонентов, в том числе ультрафильтрацию, ионный обмен и, реже, другие. Выбор и оптимизацию операций подготовки проб (или их сочетаний) до настоящего времени проводят на основании общих представлений о природе определяемых соединений. Это приводит к большим затратам времени, которые можно было бы минимизировать, если бы удалось связать характер операций подготовки проб с физико-химическими характеристиками аналитов.

Из таких характеристик в первую очередь заслуживают внимания факторы гидрофобности, lgP. Однако экспериментальные значения lgP известны не для всех характеризуемых соединений. Их можно заменить расчетными оценками, в нашем случае вычисленными с использованием ПО ChemAxon [62]. При получении таких оценок из рассмотрения можно исключить значения lgP(ChemAxon) < –2, так как примеров применения ЖЖЭ для столь гидрофильных соединений нет. Проверка эквивалентности расчетных (указаны в табл. 4 для некоторых препаратов) и экспериментальных величин (13 пар значений), которую иллюстрирует рис. 3, показывает, что коэффициент “а” линейной регрессии lgP(эксп) = algP(ChemAxon) + b лишь незначительно меньше единицы (0.89 ± 0.09), а коэффициент “b” – статистически незначим (0.27 ± 0.31). Следовательно, экспериментальные и расчетные значения lgP в некотором приближении можно полагать эквивалентными. Однако средняя точность получаемых оценок невелика, так как значение S₀ для представленной на рис. 3 линейной регрессии составляет 0.69. Кроме того, при использовании расчетных значений lgP нежелательно использовать значения lgP, вычисленные другими способами (например, с использованием ПО ACD).

Рис. 3.

Корреляция экспериментальных и вычисленных (ChemAxon) значений lgP. Параметры линейной регрессии lgP(эксп) = algP(ChemAxon) + b: a = 0.89 ± ± 0.09, b = 0.28 ± 0.31, R = 0.944, S₀ = 0.69.

В табл. 4 сопоставлены важнейшие условия подготовки проб 51 лекарственного препарата, для каждого из которых указаны молекулярная масса, CAS №, значение lgP (ChemAxon) и доля препарата, связывающаяся с белками плазмы. Для каждого варианта подготовки проб приведена ссылка на оригинальную публикацию; отсутствие ссылки (10 препаратов) означает, что методика была разработана и валидирована в ЗАО “Биокад”.

Прежде всего, прокомментируем такую характеристику, как доли аналитов, связываемые с белками плазмы (варьируют от 2 до 99%), что непосредственно влияет на их пределы обнаружения. Проверка возможной взаимосвязи этой характеристики с такой операцией подготовки проб, как осаждение белков показывает, что значимой корреляции здесь не наблюдается. Среднее значение связываемой доли аналита при использовании осаждения составляет (89 ± 16)% , а при отсутствии этой операции – (70 ± 33)% (по данным табл. 4). Таким образом, речь идет лишь о слабо выраженной тенденции, которую можно не принимать во внимание.

Для последующей интерпретации данных различным операциям подготовки проб необходимо присвоить некоторые условные коды (ранги), что позволит применить метод, в некоторой степени сходный с ранговой корреляцией Спирмена. Условно нулевое значение цифрового кода можно приписать операции осаждения белков, так как она по своей сути менее всего имеет отношение к гидрофобно-гидрофильным свойствам целевых аналитов. Для концентрирования наиболее гидрофобных соединений используют ТФЭ (код +2), а в случае менее гидрофобных, когда допустимо использование ЖЖЭ (возможно варьирование растворителей), код можно приравнять +1. Такая операция, как ионный обмен применима только к соединениям, существующим в ионной форме (наиболее гидрофильные, код –2). Тогда процедура ультрафильтрации получает код (–1). Таким образом, получаем следующий набор переменных для ранговой корреляции:

Как и в предыдущих примерах, результаты проверки возможной связи значений lgP и предлагаемых цифровых кодов нагляднее всего представлять графически (рис. 4). Из рис. 4 следует, во-первых, что два варианта экстракции (ЖЖЭ и ТФЭ) – значительно более популярные способы подготовки проб по сравнению с остальными, что, правда, обусловлено преимущественно гидрофобными свойствами характеризуемых лекарственных препаратов. Однако даже при таком неравномерном распределении точек, как на рис. 4, можно заключить, что при значениях lgP > –1 примеров применения ультрафильтрации и ионного обмена нет или (альтернативная формулировка) на стадии подготовки проб используют только ЖЖЭ или ТФЭ. Операции ЖЖЭ и ТФЭ принципиально неразделимы и выбор между ними определяется, прежде всего, доступностью соответствующего оборудования, материалов и растворителей. Следует отметить, что ЖЖЭ при lgP < 0 принципиально возможна, но существенно сложнее, а примеров применения такой экстракции в области lgP < –1 среди рассматриваемых лекарственных препаратов нет.

Рис. 4.

Графическая иллюстрация корреляции цифровых кодов основных операций подготовки проб при определении следов лекарственных препаратов в плазме крови со значениями lgP (ChemAxon).

* * *

Таким образом, примеры массивов данных, отличающихся большим разбросом, распространены достаточно широко. Самыми сложными представляются примеры вариабельности, обусловленной различиями в природе самих объектов. В таких случаях интерпретация данных осложняется влиянием характера принимаемых аналитических гипотез. Подобные массивы данных с высокими степенями неопределенности нередко исключают из рассмотрения, что не всегда оправданно. Обработке таких данных присущи свои особенности. Одномерные совокупности {x_i}, как правило, отличаются высокой асимметрией. Большие значения относительных стандартных отклонений δ_i = s_x/〈x〉 могут быть проинтерпретированы как отсутствие необходимости точного контроля значений переменных “х”, который можно заменить выбором из широких диапазонов их возможных значений. Условие s_x > (〈x〉), в отличие от правил обычной статистической обработки, означает не равенство нулю средней величины 〈x〉, а то, что некоторые из значений {x_i} выборки могут быть равными нулю. Если в результате обработки некоторых массивов данных методом наименьших квадратов для линейной регрессии y = ax + b стандартное отклонение коэффициента “а” превышает его величину (s_a > ∣a∣), то следует предпочесть обычное усреднение данных с оценкой 〈x〉 ± s_x. Вероятностный характер выводов, основанных на данных с высокими степенями неопределенности, как правило, выше, чем для данных с “нормальной” воспроизводимостью. При этом важные заключения могут быть получены даже из самих фактов высокой вариабельности переменных. Так, например, при характеристике зависимости индексов удерживания аналитов в обращенно-фазовой ВЭЖХ от содержания метанола в элюенте, dRI/dc [72], установлено, что эти параметры, в отличие от самих индексов удерживания, не коррелируют со значениями lgP, что позволяет в дальнейшем исключить подобную корреляцию из рассмотрения.