Журнал аналитической химии, 2022, T. 77, № 3, стр. 227-247

СОВРЕМЕННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Лабораторная спектроскопия. Оптическая спектроскопия была исторически ориентирована на лабораторные измерения предварительно отобранных проб разнообразного состава и развивалась как универсальное аналитическое решение, поэтому она оказалась не вполне приспособленной к современным аналитическим задачам, таким как экспресс-анализ, мониторинг процессов и полевые исследования. Ограниченная пропускная способность лабораторной спектроскопии не отвечает непрерывно растущему числу требующих анализа образцов и объектов [5].

Развитие аналитической спектроскопии традиционно шло по пути технического совершенствования приборов. Универсальность и эффективность оптического анализатора для количественного и качественного анализа до сих пор ассоциируется с расширением спектрального и динамического диапазонов, повышением разрешающей способности, с автоматизацией измерения. Эти и другие качества обусловливают постоянное техническое усложнение спектрометра, а значит рост его габаритов и стоимости. Конструкционная сложность серийно производимых спектрометров связана также с их стандартизацией – обеспечением идентичности данных для одних и тех же образцов. Неудивительно, что спектроскопия прочно ассоциируется с наукоемким лабораторным анализом, стационарным оборудованием и выскоквалифицированным персоналом. Централизованный пробоотборный подход уже не справляется с растущими объемами образцов и контролируемых параметров в различных областях деятельности, таких как контроль качества производимой продукции, экологический мониторинг и медицина, а также с появлением новых областей и форм анализа – полевого и экспресс-анализа. В качестве ответа на эти вызовы было предложено использовать принципиально новый – мультисенсорный – подход к оптическому спектральному анализу [8], активно развивающийся в последнее десятилетие, в том числе усилиями российских ученых.

Децентрализация и персонализация анализа. Монополия централизованного лабораторного анализа серьезно пошатнулась из-за развития методов аналитического контроля технологических процессов (АКТП; англ. process analytical technology, PAT) и его закрепления в нормативных документах американского Агентства по пищевым и лекарственным продуктам (англ. Food and Drug Adminstration, FDA) в 2004 г. [1, 2]. Оптическая спектроскопия по сути является флагманским методом АКТП, в котором главное место принадлежит процесс-анализатору, способному проводить непрерывные онлайн-измерения. При этом результат анализа вместо химика-аналитика получает оператор процесса, причем на месте, без отправки образцов в лабораторию [9].

Возникшая на производстве тенденция к децентрализации анализа проникает в другие сферы деятельности. Оптическая спектроскопия по-прежнему сохраняет свою важную роль в анализе пищевых продуктов, лекарств и медицинских образцов. Однако наряду с традиционными приложениями появляются новые, социальная и экономическая необходимость которых может быть существенно ниже. Иными словами, химический анализ начинает применяться там, где раньше обходились без него. Эта тенденция находится пока в самом начале своего развития. Существует множество возможных задач и приложений, которые еще не охвачены при господствующей сегодня методологии химического анализа [5].

Сегодня все чаще возникает потребность в анализе различных обобщенных показателей химического состава, таких как питательная ценность [10] и минерализация [11] сельскохозяйственной продукции, аутентичность и наличие подделок в пищевом [12, 13] и фармацевтическом производстве [14] и многих других [15]. Оптический анализ начинает применяться в новых областях, таких как диагностика биоткани [16], сортировка материалов [17], удаленный анализ при помощи спектральных изображений [18] и т.д.

Расширение круга анализируемых объектов происходит за счет удешевления анализа, миниатюризации и автономизации приборов. Примеры таких устройств уже имеются в сфере персональной диагностики, например оптические пульсоксиметры [19]. Ведется работа по созданию и усовершенствованию индивидуальных неинвазивных глюкометров [20]. В целом можно констатировать постепенный переход химического анализа из экспертной области к широкому, а в перспективе и к массовому использованию.

Персонализация анализа облегчается широкой доступностью мобильных телефонов и других устройств, оснащенных мощным процессором и даже оптическим детектором – встроенной камерой. Cозданный в Санкт-Петербургском государственном университете (СПбГУ) прототип миниатюрного анализатора креатинина в моче [21] – убедительная иллюстрация реализации оптического анализатора на основе смартфона. Существуют и другие примеры подобных устройств, обзор которых сделан в работе [22].

Промышленное производство персональных анализаторов связано с неизбежным компромиссом между ценой и качеством. В этой связи все большее значение приобретает развитие научных подходов к разработке мультисенсорных систем и анализу полученных с их помощью данных.

Материалы, технические решения и методы исследования. Современное состояние оптической спектроскопии непосредственно связано с созданием новых оптоволоконных материалов, зондов, источников света и детекторов, а также с развитием методов получения и обработки данных. Ниже приведено несколько примеров.

Погружной зонд Lighthouse Probe^TM (LHP) разработан для непрерывного спектрального анализа процессов в ультрафиолетовой (УФ), видимой (Вид) и ближней ИК (БИК)-областях [23]. Он изготовлен из сертифицированных в фармацевтическом и пищевом производстве материалов и позволяет получать онлайн-спектры диффузного отражения порошкообразных и сыпучих материалов, таких как гранулят и пеллеты¹¹, включая процессы их изготовления и переработки. Высокая информативность спектров обеспечивается полным (на 360°) обзором среды через семь оптических окон, расположенных по окружности зонда. Каждое из окон одновременно служит для облучения среды и для приема диффузно отраженного света, передаваемого на удаленный детектор с помощью оптоволоконного кабеля. Система автоматической очистки LHP периодически удаляет налипший материал процесса (рис. 1).

Рис. 1.

Принцип работы зонда LHP: измерение (а), очистка и последующая сушка (б) и калибровка (в).

Рабочая спектральная область световодов расширяется, благодаря новым светопроводящим материалам. Современные оптоволокна покрывают практически весь оптический диапазон, в том числе традиционно “непрозрачные” ИК-области. Изобретенные в России халькогенидные ИК (ХИК)-волокна на основе сульфида мышьяка (As₂S₃) имеют достаточно высокое пропускание в интервале 1.5–6 мкм [24], а бескислородные поликристаллические ИК (ПИК)-волокна из твердых растворов галогенидов серебра AgCl_{1 −x}Br_x (0 < x < 1) [25] обладают необходимой прозрачностью в области “отпечатков пальцев” (3–18 мкм), несущей химическую информацию от многих функциональных групп.

Благодаря новым оптоволоконным материалам в АКТП все больше применяются ИК-зонды, использующие эффект нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО; англ. attenuated total reflection, ATR) для анализа различных сред. Оптический путь НПВО-измерения составляет 0.5–2 мкм и определяется глубиной проникновения переменного поля затухающих колебаний (англ. evanescent field) используемого кристалла НПВО-элемента, помноженной на определяемое его геометрией число внутренних отражений. Относительно малая длина оптического пути часто выгодна, учитывая более высокие (чем, например, в БИК) коэффициенты экстинкции веществ в ИК-области. Наиболее используемые НПВО-элементы производятся из кристаллов ZrO₂, ZnSe, Ge, Si и алмаза. Их форма – конус, призма, полусфера, многогранник и т.д. – подбирается в зависимости от природы образца [26] и используемой области спектра. В последние 20 лет был разработан ряд НПВО-зондов для ИК-анализа на основе ХИК- и ПИК-волокон. Эти зонды в комплектации c ИК-спектрометрами были успешно опробованы при решении многих аналитических задач, включая мониторинг процессов и анализ биотканей [27–32].

Настоящий прорыв в области источников света связан с существенным удешевлением и увеличением возможностей светодиодов, которые теперь охватывают практически всю оптическую спектральную область от УФ до ИК и имеют интенсивности до десятков Ватт (в импульсном режиме). Благодаря этому, они все чаще применяются в оптическом анализе [33]. Будучи близкими по спектральным свойствам к монохроматическим источникам излучения, мощные светодиоды могут заменять лазеры для возбуждения флуоресценции [34, С. 342] и даже эффекта комбинационного рассеяния (КР) [35]. Время службы светодиодов может исчисляться тысячами часов, причем с сохранением стабильного спектра и интенсивности излучения. Это делает их гораздо более практичными, чем традиционно используемые в спектроскопии лампы. Новаторской областью спектроскопического анализа является применение в качестве источника набора светодиодов на разных рабочих длинах волн вместо традиционного белого света, что освобождает спектрометр от наиболее дорогостоящих комплектующих. Однако при использовании такого подхода возникает ряд проблем, в частности, достаточно широкие спектры излучения светодиодов, их вариабельность и нестабильность и т.д. Первые примеры исследовательских устройств, использующих светодиоды для спектрального анализа [36–38], показали их преимущества в качестве источников света для спектроскопии по сравнению с привычными лампами. Светодиоды обладают высоким коэффициентом полезного действия и способны давать гораздо более высокую яркость. Однако разработка и широкое применение светодиодных анализаторов пока ограничены из-за неполноты научных исследований и недостатка практического опыта.

Следует отметить успехи в разработке малобюджетных пироэлектрических детекторов и миниатюрных спектрометров высокого разрешения на их основе [39–41]. Пироэлектрические детекторы основаны на светочувствительных элементах, покрытых пленкой пироэлектрического материала – цирконата-титаната свинца, генерирующих сигнал напряжения при изменении температуры. Пироэлектрические детекторы предназначены для анализа на достаточно узких спектральных участках в БИК- и ИК-областях. Типичным примером микроспектрометра является настраиваемый интерферометрический сенсор (НИС) Фабри-Перо (франц. Fabry-Pérot), регулируемый на относительно узкие спектральные интервалы с использованием технологии микроэлектромеханических систем (МЭМС; англ. microelectromechanical systems, MEMS) [42]. Примером является НИС фирмы “InfraTec GmbH” (Дрезден, ФРГ) [43], который состоит из движущегося и неподвижного зеркал, нанесенных на пленку толщиной 300 мкм. На задние стороны обоих зеркал нанесены противоотражательные слои, оптимизированные для определенного спектрального интервала, например 8–10 мкм. Спектральное пропускание такого оптического фильтра характеризуется узковолновой резонансной кривой. Максимальное пропускание на резонансной длине волны может быть настроено электростатически путем изменения расстояния между зеркалами. Качество зеркал, их отражающая способность и потери из-за поглощения определяют разрешающую способность НИС. Так, при 50%-ном пропускании фильтра она составляет порядка 200 нм.

Развивается производство мини- и микроспектрометров для УФ-Вид и БИК-спектральных диапазонов, снижается их стоимость. Это позволяет разрабатывать ОМС на их основе. Микроспектрометры Qmini (Германия) [44], продукция Spectral Engines (Финляндия) [45], а также MicroNIR PAT-U фирмы “VIAVI Solutions” (Италия) [46] являются типичными примерами. Благодаря достижениям технологий микромашиностроения возникают новые области применения спектроскопии среднего и ближнего ИК в промышленных и полевых приложениях.

Подходы к спектральному анализу также претерпевают изменения. Заметной тенденцией становится сочетание двух и более различных методов спектроскопии в одном анализаторе. Комбинации методов используют для того, чтобы охватить различные аспекты процесса в АКТП [47–49] или улучшить классификацию биологических тканей, в том числе в онкологической диагностике [50–52]. Такое сочетание называют комплементарным. Если соединение в одной модели разнородных спектральных данных приводит к улучшению аналитических возможностей, например точности определения компонента, говорят о синергетическом эффекте (когда комбинация работает лучше, чем каждый метод в отдельности). Пока не предложено общепринятого теоретического обоснования синергии при мультиспектральном анализе, которое позволило бы получать предсказуемый результат.

В хемометрике разработан ряд эффективных алгоритмов для анализа объединенных данных, которые могут включать блоки разных методов или стадий технологического процесса [53–55]. Частным случаем комбинированных (или дополненных) данных являются трехмодальные (англ. three-way) и данные более высокой модальности. Они получаются, например, при использовании двумерной флуоресцентной спектроскопии [56], пространственно-разрешенных измерений (как в спектральных изображениях [57]) и комбинированных методов [58]. К последним относятся высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детектированием и термогравиметрический анализ с ИК-анализатором продуктов. Для анализа трехмодальных данных требуются специальные алгоритмы, такие как метод развертывания, преобразующий трехмерный массив данных в двумерный путем состыковки составляющих его матриц в одну [59]. Трехмодальные данные успешно используют для разработки ОМС [3].

Анализ данных. В реальных спектральных данных содержится масса полезной химической информации. Ее извлечение математическими методами осложнено наложением аналитических сигналов, рассеянием, шумом, приборными артефактами и другими факторами. Поэтому анализ сложных образцов не обходится без применения хемометрики, которая стала практически обязательной составляющей современных аналитических методов на основе оптической спектроскопии [7].

Эволюция приборной базы и методов анализа данных оптической спектроскопии тесно взаимосвязаны. Обычно изобретение новых аналитических методов и устройств стимулирует развитие соответствующего математического аппарата и программного обеспечения (ПО). Блестящим примером обратного влияния служит прорыв в развитии БИК-спектроскопии, во многом связанный с появлением алгоритма проекции на латентные структуры (ПЛС, англ. partial least-squares, PLS) – ныне широко используемого метода регрессионного анализа. Публикация ПЛС-алгоритма в 1982 г. [60] и последующее широкое использование в прикладных исследованиях [61], в особенности для многомерной градуировки на спектральных данных, превратили БИК-спектроскопию в один из наиболее востребованных инструментов количественного анализа, как лабораторного, так и в АКТП. Ранее этот метод мало использовался на практике из-за наложения полос и интенсивного фонового сигнала.

Алгоритмы регрессионного анализа, такие как ПЛС и множественная линейная регрессия (МЛР), необходимы для создания градуировочных моделей в количественном анализе. Важную роль играют также методы разведочного анализа данных, такие как метод главных компонент (МГК; англ. principal component analysis, PCA) [62] и сходные проекционные методы, направленные на углубленное изучение внутренней структуры данных в факторном пространстве. В отношении образцов это состоит в выявлении группировок и выбросов, анализе взаимосвязей (например, кривой развития во времени), анализе статистической влиятельности. Те же свойства могут быть изучены в отношении переменных. В последнем случае наибольший интерес представляет поиск наиболее влиятельных переменных и скрытых спектральных откликов [63]. В конечном счете результатом такого разведочного анализа данных является улучшенное понимание исследуемых объектов и аналитического метода как такового. Для одних и тех же данных можно создать бесконечное число различных факторных пространств, используя известные или изобретая новые проекционные преобразования. Эффективность факторного пространства в конечном счете определяется его практичностью для анализа конкретных данных [4].

Предварительная обработка (предобработка) спектров, т.е. их модификация перед анализом, проводится для улучшения качества и информативности данных. В терминах статистики информация – это дисперсия переменных. Целью предобработки является улучшение точности анализа данных за счет удаления нерелевантной информации – шума, фонового сигнала (базовой линии), неинформативных областей спектра при максимальном сохранении полезной информации. Предобработка может также служить улучшению визуализации полезной информации, например при использовании дифференцирования или функций преобразования данных, таких как линеаризация. Наиболее часто используемые методы предобработки данных представлены в табл. 1.

Рассмотренные методы часто используются в ходе разработки ОМС для предобработки исходных полных спектральных данных. Однако возможности модификации данных самих ОМС сильно ограничены в силу их особенностей. Так, из-за малого числа переменных и неравномерности шага к ним могут быть применены лишь методы взвешивания, нормировки и коррекции рассеяния (табл. 1), причем методы СНВ и МКР имеют смысл лишь при числе каналов не менее трех. Для двухканальной ОМС доступны лишь арифметические действия со значениями на разных каналах, полученными в одном измерении, или независимое преобразование переменных в каждом из каналов, например взвешивание методом автошкалирования – делением каждого значения переменной на ее стандартное отклонение. Отбор наиболее качественных и информативных данных (как объектов, так и переменных) составляет отдельную группу методов предобработки. Отбор переменных особенно важен при разработке мультисенсорных систем, а отбор объектов – для анализа данных действующих ОМС.

Данные ОМС обладают рядом особенностей, отличающих их от традиционных спектров. К ним относятся: малое количество переменных, их неравномерное распределение вдоль спектральной оси, недостаточная стандартизация и потенциально большой объем измерений. Это накладывает определенные ограничения на использование распространенных в спектроскопии алгоритмов анализа данных и создает потребность в разработке новых подходов.

Малое число переменных в матрице данных и ожидаемое благодаря оптимизации отсутствие существенных корреляций между ними роднит данные ОМС с неспектральными аналитическими данными, в которых число переменных также может быть существенно сокращено без значимых потерь для результата анализа [73, 74]. Уменьшение числа переменных в данных не влияет на применимость ПЛС-регрессии и большинства других алгоритмов многомерной градуировки, но создает предпосылки для использования классического метода множественной линейной регрессии, широко применявшегося до появления проекционных методов [64, С. 125]. Множественная линейня регрессия не использует факторную проекцию, решая регрессионное уравнение напрямую из матрицы данных и вектора концентраций. По имеющимся данным, МЛР на предварительно отобранных спектральных переменных дает отличные результаты [75, 76], а преимуществами метода являются простота и меньшая расчетная нагрузка, что может иметь важное значение для автономных сенсоров, использующих облегченные варианты компьютеров. Из-за невысокого числа переменных построение градуировочных моделей на данных ОМС и последующий прогноз занимают меньше времени. Это может быть существенным фактором при анализе “больших данных” и онлайн-мониторинге быстрых процессов.

ОПТИЧЕСКИЕ МУЛЬТИСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ

Определение оптических мультисенсорных системы и их отличительные особенности. В работах автора [3, 8] систематически введен термин “оптическая мультисенсорная система”. Благодаря своим отличительным особенностям, охарактеризованным ниже, ОМС следует выделить в отдельный класс спектрометрических устройств.

В работе [8] дается следующее определение: “ОМС – это аналитическое устройство, включающее набор из двух и более оптических сенсоров (сенсорных каналов), оптимизированных под определенное приложение.” Термин “сенсор” здесь означает химический сенсор в соответствии с номенклатурой ИЮПАК [77]. Информационные каналы ОМС представляют собой интегральные оптические сигналы на выбранных спектральных интервалах.

Термин мультисенсорная система впервые появился в электрохимии для описания анализаторов типа “электронный нос” [78] и прочно закрепился в работах группы “электронного языка” СПбГУ под руководством Ю.Г. Власова [5, 79]. “Электронный язык” также основан на оптимизации массива неспецифических сенсоров (в данном случае – потенциометрических), имеющих разную (перекрестную) чувствительность к определяемым компонентам [80]. Очевидно концептуальное сходство “электронного языка” с ОМС, а различия заключаются в физическом принципе действия используемых сенсоров, что и обосновывает общность терминологии.

Введение терминологически нового спектрометрического устройства обусловлено концептуальными различиями ОМС и традиционной спектроскопии. Наиболее важные отличительные особенности ОМС перечислены ниже:

В противовес универсальным спектрометрам ОМС является специализированным анализатором, оптимизированным для решения определенной аналитической задачи. Эта особенность существенно меняет область практического применения, открывая возможности полевого, экспресс- и онлайн-измерения. Оптимизация ОМС состоит в использовании минимально необходимого числа оптических каналов на выбранных с учетом приложения диапазонах длин волн.

В отличие от спектрометров, призванных обеспечить высокую разрешающую способность [34, С. 91], оптические каналы ОМС в общем случае широки. Они могут отстоять далеко друг друга или, напротив, сильно перекрываться, так что сам термин “разрешающая способность” для них не всегда применим. То есть проявление селективности от составляющих ОМС сенсоров в общем случае не ожидается, и такая цель не ставится при создании анализатора, хотя высокая избирательность каналов к отдельным компонентам образца возможна. Использование только самых информативных участков спектра позволяет избегать информационно “пустых” участков и нерелевантных откликов. Положительный эффект интегрирования на широких спектральных интервалах проявляется в снижении уровня шума, что также благоприятно сказывается на точности анализа.

Низкая селективность каналов ОМС подразумевает применение методов многомерного анализа данных, например ПЛС-градуировки. Как показано в работах [81, 82], грамотное использование хемометрики как на стадии оптимизации каналов, так и при построении прогностической модели может полностью скомпенсировать потерю точности анализа при переходе от лабораторного спектрометра к мультисенсорным системам. И напротив, так называемый экспертный подход аналитика на основании его опыта и знаний к заданию количества, рабочих длин волн и спектральных интервалов каналов ОМС часто оказывается далеко не оптимальным из-за высокого числа влияющих на результат параметров [83].

Существует и менее строгие характеристики ОМС, отличающие их от традиционных спектрометров. Так, скорость измерения у процесс-спектрометров и ОМС как правило высока и составляет несколько милли- или даже микросекунд, как в поштучной сортировке зерен злаковых культур “на лету” [84]. Измерения ОМС-анализаторов, даже однотипных, могут различаться. Недостаток стандартизации решается использованием методов переноса модели [85–87], вносящих поправки либо в сами данные, измеренные на стандартном наборе образцов, либо в прогностическую модель, что тоже является одной из задач хемометрики. Конструкционное упрощение ОМС дает многократное снижение габаритов и стоимости анализатора в десятки и сотни раз и создает предпосылки для создания портативных и автономных устройств. Доступность и миниатюрность ОМС-анализаторов позволяют создавать распределенные сенсорные сети, обеспечивающие более полный контроль территорий (как в экологии) и сложных объектов. При массовом использовании ОМС целесообразным становится использование универсальных (называемых также глобальными) градуировочных моделей [88–90], хранящихся “в облаке”, как альтернатива множеству собственных локальных. Хемометрические модели традиционного спектрометра обычно предоставляются программным обеспечением, расположенным на соединенном с прибором компьютере. Оптические мультисенсорные системы, напротив, ориентируются на использование встроенной микрокомпьютерной техники, которая рассчитывает и выдает результаты измерения. Немаловажной характеристикой ОМС является высокая аппаратная адаптивность под новое приложение через техническую перенастройку оптических каналов системы. Возможность модульного построения ОМС позволяет парадоксально сочетать узкую специализацию системы с универсальностью.

Уникальным природным примером ОМС является глаз. Воспринимаемое им множество цветовых оттенков порождается сигналами лишь трех низкоселективных перекрестно-чувствительных оптических сенсоров [91]. Оптимизация спектров чувствительности отдельных сенсоров глаза под среду обитания происходила в результате эволюции, поэтому восприятие цвета человека и у различных видов животных не одинаково [92].

С точки зрения предложенной терминологии ОМС является “электронным глазом”.

Оптические мультисенсорные системы и одноканальные сенсоры. Одноканальные (или простые) фотометрические сенсоры широко используются на практике. К примеру, окрашенный компонент истинного раствора можно определить по поглощению в видимой спектральной области, а взвешенный компонент коллоидной системы – по светорассеянию, как в нефелометрии и турбидиметрии [34, С. 186]. В приведенных примерах обычно используется одна длина волны, обладающая избирательностью к определяемому веществу. Для повышения селективности можно использовать физическое разделение или химическую модификацию образца, например перевод аналита в окрашенный комплекс. Такие лабораторные методы пробоподготовки облегчают фотометрический анализ и часто используются на практике. Однако они могут быть трудоемки и не всегда точны, особенно в анализе сложных смесей.

Оптическая информация, получаемая единственным сенсорным каналом, может быть недостаточной для анализа сложных образцов. Этот главный недостаток фотометрии устраняется добавлением дополнительных информационных каналов, т.е. переходом от фотометрии к спектрофотометрии. Схематическая модель на рис. 2 иллюстрирует преимущество двухканального измерения для дискриминации двух классов объектов. Линейная дискриминационная модель различает две группы объектов на плоскости, хотя на каждом из отдельных каналов полного разделения нет (рис. 2a). В более сложном случае на рис. 2б можно использовать нелинейную дискриминацию.

Рис. 2.

Схематическая иллюстрация дискриминантного анализа данных двухканальной мультисенсорной системы: линейное (а) и нелинейное (б) разделение классов на плоскости, составленной измерениями двух информационных каналов.

Хорошим практическим примером, иллюстрирующим преимущества многоканального измерения, является разработанный оптический сенсор на содержание воды в порошкообразных материалах [93]. Его работа основана на интенсивном поглощении воды в области 1940 нм. В качестве источника использован светодиод, испускающий излучение на этой длине волны, а диффузно отраженный порошком свет улавливается зондом и передается по оптоволоконному кабелю на фотометрический детектор. Градуировочная модель для определения воды по показаниям сенсора будет иметь довольно низкую точность из-за случайных колебаний интенсивности регистрируемого сигнала, связанных с морфологической неоднородностью поверхности порошка (эффект рассеяния) [94]. Так как интенсивность рассеяния относительно большими частицами в БИК-области практически не зависит от длины волны, ее перепады можно скомпенсировать использованием второго светодиодного канала на 1300 нм. Детектируя сигналы попеременно работающих источников и вычитая второй сигнал из первого, можно нивелировать эффект рассеяния, используя второй канал как внутреннее эталонное измерение (безэталонный метод). Для дальнейшего объяснения принципов разработки ОМС представим, что на полосу воды наложено поглощение другого компонента смеси, имеющего переменную концентрацию. Для компенсации этого фактора в сенсорную систему необходимо ввести еще один светодиод. Если мешающий компонент неизвестен, необходимые оптические параметры третьего канала (длину волны и другие параметры излучения третьего светодиода) следует определить экспериментально. Это можно сделать без полного разделения смеси, используя полноспектральные данные спланированного соответствующим образом набора образцов. Но даже имея чистые спектры компонентов исследуемой смеси, едва ли возможно подобрать наилучшие для создаваемой мультисенсорной системы светодиоды умозрительно. Определение их числа и оптических характеристик должно быть предметом математической оптимизации, подходы к решению которой рассмотрены в работах автора [3, 8].

Использование трех и более информационных каналов в ОМС открывает возможности для применения многих алгоритмов хемометрики, включая предобработку данных и построение прогностических моделей. Важно, что сложность ОМС определяется именно числом информационных каналов, т.е. независимыми источниками информации в выходных данных, которые в дальнейшем используются для математического анализа. Техническое присутствие множества оптических сенсоров не определяет число каналов ОМС. К примеру, из всех оптических сенсоров системы может использоваться только один, если другие сенсоры отключены или их отклики усредняются. В этом случае анализатор будет все равно одноканальным независимо от его технического воплощения. Даже спектрометр высокого разрешения может использоваться как простой фотометрический сенсор, если он отградуирован на определение концентрации по единичной длине волны или интегралу пика поглощения.

Архитектура и принцип работы оптических мультисенсорных систем. Мультисенсорную систему можно описать в терминах информационного потока – как устройство для сбора, передачи и преобразования информации [8]. Представленная на рис. 3 схема подходит любому методу спектроскопии. Она особенно удобна для иллюстрации различных аспектов разработки и использования ОМС.

Рис. 3.

Схема информационного потока оптических мультисенсорных систем (“*” обозначает преобразование).

Исходным носителем информации является электромагнитное излучение оптического спектра, испускаемое одним или несколькими источниками. К источникам могут относиться устройства, преобразующие белый свет в монохроматический, например оптические фильтры или монохроматор, или изначально испускающие свет в узком волновом диапазоне. В ходе анализа источник может работать в непрерывном или импульсном режиме.

Аналитическая информация появляется при взаимодействии света с образцом, в результате которого меняется спектральный состав излучения. Важную роль в обеспечении сбора релевантной информации об образце играет интерфейс измерения. Это набор оптико-механических приспособлений, который служит для преобразования светового потока до и после образца, а также для придания необходимой формы самому образцу в момент анализа. Интерфейсы измерения бывают стандартными или специально конструируются под определенную аналитическую задачу. Интерфейс определяет геометрию измерения – длину оптического пути, расстояние до объекта, угол измерения и другие параметры, влияющие на распространение света в образце, а также способ доставки измененного светового потока на детектор. Часто используемыми интерфейсами измерения являются, зонд, кювета, пропускная ячейка и оптическое окно [95]. К более специфическим относятся гониометр (устройство для изменения угла наблюдения), фотометрический шар Ульбрихта и гораздо более сложные устройства, такие как спектральная камера и конфокальный микроскоп. Анализ может проходить как при контакте образца с элементами измерительного интерфейса, так и на расстоянии.

К стандартным элементам интерфейсов измерения относятся защитные окна, линзы, зеркала, НПВО-кристаллы и оптические фильтры. Фильтр может быть установлен перед образцом или после него (перед детектором) для отсечения ненужных спектральных областей или сигналов, таких как пик эмиссии возбуждающего лазера при КР-спектроскопическом или люминесцентном анализе [34, С. 88].

После детектора носитель информации меняется. Свет преобразуется сначала в аналоговый электрический сигнал, который затем оцифровывается. На рис. 3 аналогово-цифровой преобразователь условно отнесен детектору. Вышедшие из детектора данные информационных каналов ОМС становятся аналитическим сигналом.

Завершающим шагом в информационном потоке ОМС является прогноз – применение предварительно созданной математической модели к новому измерению и преобразование аналитического сигнала в результат анализа. Результатом может быть значение концентрации или обобщенного химического показателя, а также отнесение к классу, т.е. в конечный результат качественного или количественного анализа. Если цель анализа – определение концентрации компонента образца, нужна градуировочная модель, а ответ “да/нет” является результатом дискриминантного анализа. В любом случае прогностическая модель – обязательный элемент информационного потока. Хемометрические модели являются цифровыми по своей природе. То есть работа ОМС предполагает наличие компьютера.

Компьютер с установленным ПО – важнейший элемент ОМС. Он осуществляет управление системой, отвечает за прогноз и выдачу результата. Эти функции могут быть встроены или перенесены на внешний компьютер, соединенный с мультисенсорной системой по кабелю или беспроводным способом. В автономных ОМС используется встроенный компьютер с собственным дисплеем, который одновременно служит и для управления устройством, и для отображения результата прогноза. В некоторых случаях результат может отображаться при помощи цветовых сигналов на корпусе анализатора. Например, зеленый означает “да”, красный – “нет”, желтый – “спорно”, белый – “ошибка измерения”.

Существуют реализации ОМС, где схема информационного потока (рис. 3) упрощена. Например, правая часть схемы после образца может замениться человеческим восприятием – глазом (аналог детектора) и мозгом (“компьютер”). Так, флуоресцентное свечение возбужденного образца в видимой области указывает на наличие определенного химического вещества, а интенсивность этого излучения – на его концентрацию. В другом варианте источник на схеме (рис. 3) может отсутствовать, и его роль может играть естественная, например солнечная, радиация. Более того, источник света может сам являться образцом, например, в спектральном анализе излучающих объектов – ламп, жидкокристаллических дисплеев и т.д.

Конструкционные элементы оптических мультисенсорных систем. В оптической спектроскопии существует широкий выбор конструкционных элементов, используемых в качестве источников света, интерфейсов измерения и детекторов. Выбор элементов при разработке ОМС зависит от природы образца, используемого спектрального метода, оптимальной геометрии измерения, а также от специфических требований к анализатору, таких как скорость измерения, стоимость, встраиваемость и размер. Современные технические элементы, используемые для конструирования ОМС, а также типы используемого ПО и компьютеров приведены в табл. 2.

При всем их разнообразии различные источники излучения и системы детектирования образуют устойчивые пары, технические характеристики которых, как правило, и определяют разбиение анализаторов на спектральные области и методы, такие как УФ, Вид, БИК и ИК. Интерфейсы измерения более универсальны и часто применимы с различными спектрометрами и видами молекулярной спектроскопии. Так, кварцевая кювета может быть использована для регистрации любых оптических спектров, кроме ИК.

Для хранения модели и прогноза в автономных ОМС обычно используются современные компактные микрокомпьютеры. Для управления устройством все чаще используются микроконтроллеры, оснащенные необходимым ПО. Программное обеспечение для прогноза может быть установлено как на встроенном, так и на внешнем компьютере и быть стандартным (доступным коммерческим продуктом) или собственной разработкой. Последнее может быть необходимо, например, при создании высокооптимизированного сенсора. Альтернативным подходом к прогнозу является использование ИПП, которое может упростить устройство за счет перенесения всех расчетов на удаленный сервер (“в облако”), но соединение с моделью потребует доступа к сети Интернет.

Список конструкционных элементов в табл. 2, разумеется, не исчерпывающий. Он включает лишь основные элементы, использовавшиеся в практических приложениях настоящей работы и рассмотренные в литературных источниках.

Классификация оптических мультисенсорных систем. Оптические мультисенсорные системы разнообразны и могут иметь различные конструкционные принципы. Для систематической разработки полезно различать типы устройств. Классификация ОМС может базироваться на различных критериях [3, 8]. Основные физические принципы оптической спектроскопии иллюстрирует рис. 4.

Рис. 4.

Физические эффекты, используемые в оптической спектроскопии и в оптических мультисенсорных системах (последние выделены серым фоном).

С точки зрения геометрии измерения в ОМС может быть реализовано три основных режима измерения в зависимости от угла детектирования по отношению к облучению: на пропускание (180°), на отражение (0°) и на рассеяние (под углом 90°, как например, в нефелометрии, или под иным углом). Отдельную категорию “на отражение” представляет метод нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО), где угол внутреннего отражения определяется свойствами кристалла. Приведенная терминология условна. В каждом из рассмотренных выше режимов измерения детектируемый после взаимодействия с образцом световой поток может содержать комбинацию эффектов поглощения, рассеяния, люминесценции и КР.

С точки зрения конструкции ОМС можно разделить на три типа в зависимости от того, какой из узлов информационного потока на рис. 3 отвечает за специализацию спектрального анализатора в соответствии с приложением: источник, детектор или ПО (табл. 3).

Светодиодные ОМС (тип 1) – одно из привлекательных направлений разработки. Они совмещают в себе простоту конструкции с широтой возможностей [33]. Сходные конструкции ОМС с автоматически сменяемыми фильтрами и широкополосным источником света реализованы, например, в анализаторах фирмы NDС (Дейтон, США) [100] и в анализаторе BioView, оснащенном зондом для анализа процессов методом двумерной флуоресцентной спектроскопии [101, С. 29]. Вместо светодиодов могут использоваться мощные лазерные диоды, например, во флуоресцентных ОМС [99]. Высокоинформативные и точные флуоресцентные и рамановские ОМС можно реализовать на основе настраиваемых лазеров, особенно если их стоимость – основное препятствие к широкому использованию – будет снижаться.

Оптические мультисенсорные системы второго типа характеризуются использованием специализированных детекторов в определенном узком спектральном диапазоне, который подбирается в зависимости от приложения. К таким детекторам прежде всего относятся миниатюрные пироэлектрические детекторы [39, 40] для БИК- и ИК-областей, например НИС типа Fabry-Perót [43]. Однако основой специализированных детекторов может служить и оптимизированный массив фотодиодов типа ДМД или ПЗС с индивидуально разработанным на уровне электроники способом считывания спектральной информации.

Третий тип ОМС чаще всего встречается при использовании в качестве основы готовых мини- и микроспектрометров, разрабатываемых в коммерческих или исследовательских целях. В последние годы наблюдается повышенный интерес к изготовлению “демократичных” спектроскопических анализаторов, в основном для Вид- и БИК-областей. Дебю и др. [21] показали, что спектрометр, изготовленный из подручных материалов – старого CD-диска, зеркальца и пустой упаковки, может быть успешно использован для определения креатинина в моче. В качестве детектора и компьютера при этом используется камера смартфона. Существуют и другие примеры использования готовых бытовых устройств типа фотоаппарата или смартфона как основы импровизированных спектральных анализаторов [22, 106]. Такой подход является проявлением запроса на персонализацию анализа, отмеченную выше. Спецификой спектрометров такого типа (будем называть их упрощенными спектрометрами), помимо максимального облегчения конструкции за счет отказа от встроенного источника света и других элементов, является недостаток стандартизации, что характерно и для процесс-спектрометров. Это касается не только штучных исследовательских прототипов, но и более качественных (и не столь дешевых) коммерческих марок, таких как продукция фирм RGB Photonics [44] или Spectral Engine [45]. Упрощенные спектрометры являются по сути полуфабрикатами, и их использование в практическом анализе сопряжено с достраиванием недостающих компонентов, таких как ПО для низкоуровневой обработки данных (до их записи в память компьютера), восполняющей недостаток стандартизации, в том числе неравномерности и избыточности шага сбора спектральных данных. Именно на этапе низкоуровневой обработки данных происходит выбор переменных и их усредненных интервалов, а значит, может быть реализована специализация ОМС третьего типа (табл. 3), т.е. программная оптимизация под выбранное приложение. Типичным примером является сенсор для онлайн-определения воды в порошкообразной пищевой добавке в ходе ее производства [107].

ПРИМЕРЫ РАЗРАБОТКИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОПТИЧЕСКИХ МУЛЬТИСЕНСОРНЫХ СИТЕМ

Этот раздел иллюстрирует разработку и применение ОМС примерами из различных практических областей: пищевой и фармацевтической промышленности, биотехнологии, медицинской диагностики и экологии. Представленные в работах [37, 49–51, 69, 81, 96, 99, 102–112] с участием автора системы находятся на разных стадии разработки (табл. 4), основанной на принципе упрощения полноспектрального метода за счет его специализации и оптимизации под выбранное приложение.

Определение питательных компонентов молока. В работах [97, 102, 103, 105, 106, 108–110] предложен и разработан новый метод оптического анализа для определения содержания жира и общего белка в молоке. Метод основан на рассеянии света, наблюдаемом в спектральной области 400–1100 нм. Экспериментальные результаты в дальнейшем использованы в разработке светодиодной ОМС. Возможность точного определения жира и белка в натуральном негомогенизированном молоке обусловлена способностью спектрального метода (в сочетании с хемометрикой) различать низкоселективные спектральные профили рассеяния коллоидными частицами разных видов и размеров: мицеллами белка (преимущественно 80–200 нм) и глобулами жира (1–15 мкм). Для экспериментального обоснования подхода была проведена серия исследований с искусственными образцами молока, приготовленными в соответствии с принципами планирования многокомпонентной градуировки [113, 114]. Природную вариабельность размеров жировых глобул учитывали путем пошаговой ультразвуковой гомогенизации образцов. Каждый образец анализировали сначала в исходном состоянии, а затем после каждого из двух шагов гомогенизации – по 10 и 20 с. Хемометрический анализ полноспектральных данных лабораторного ДМД-спектрометра доказал принципиальную возможность определения жира и общего белка в натуральном молоке при высокой вариабельности размеров взвешенных частиц (табл. 5).

Возможность использования светодиодов для определения молочного жира и белка предложенным методом показана в серии предварительных экспериментов с использованием анализа цифровых изображений диффузных пятен, наблюдаемых при просвечивании слоя молока на трех различных длинах волн [106]. С помощью разработанного [115] алгоритма оптимизации оптических каналов теоретически рассчитана конфигурация оптимальной ОМС на светодиодах. Набор светодиодов оптимизирован для одновременного (в ходе одного измерения) определения жира и белка в образце. Расчетная ОМС с семью светодиодами на выбранных длинах волн, как показано в табл. 5 (СД ОМС пропускание), не уступает полноспектральному методу в точности определения компонентов молока.

В отдельном эксперименте показана возможность анализа молока в режиме диффузного отражения и дополнения спектрального разрешения пространственным для увеличения точности [105]. Регистрацию спектров на различном расстоянии от источника облучающего образец света осуществляли при помощи зонда, имеющего плоскую рабочую поверхность с выведенной на нее линейкой из восьми световодных каналов. Один из них был соединен с источником белого света, а остальные – со спектральным детектором. Для анализа данных использовали безэталонный метод, согласно которому в качестве внутреннего спектра сравнения выступал один из каналов зонда. Расчет светодиодной ОМС с пространственным разрешением проводили на дополненных данных, где измеренные спектры всех каналов объединены. При этом каждый пространственный канал может теоретически иметь собственный оптимальный набор светодиодов. Использование световодов в режиме диффузного отражения осложнено более слабыми, чем в анализе на пропускание, интенсивностями детектируемых сигналов. Тем не менее, благодаря использованию пространственного разрешения, а также безэталонному измерению, метод показал практически такую же точность (табл. 5), что и полноспектральный. Оптические мультисенсорные системы на основе регистрации диффузного отражения особенно востребованы в анализе молока. Они просты в обслуживании и хорошо подходят как для полевого, так и для и онлайн-анализа.

Глобальные градуировочные модели для практического определения жира и общего белка были построены на тысяче с лишним свежих образцов, собираемых в Самарской области и прилегающих регионах в течение одного года. Среднеквадратичное отклонение определения как для жира, так и для белка составило при этом около 0.1% в концентрационных диапазонах 1.55–4.97% и 2.27–4.25% соответственно. В исследованиях [76, 108] показана возможность переноса моделей методом коррекции наклона и отсечения на другой спектрометр того же типа. Потеря точности перенесенной модели несущественна [108].

Контроль качества фармацевтических продуктов. Онлайн-анализ твердых фармацевтических форм является одной из приоритетных областей разработки ОМС. Он включает важные практические задачи [49, 69, 107, 110, 111]: определение концентрации воды или активного фармацевтического ингредиента (АФИ), мониторинг нанесения слоя защитного полимерного покрытия и связанный с ним прогноз растворимости готового препарата.

В приведенных ниже примерах в качестве основного спектрального метода для онлайн-измерений в среде идущего процесса использовался ДМД-спектрометр в БИК-области (табл. 4), оснащенный погружным ДО-зондом LHP (рис. 1) диффузного отражения [23].

Недостаточная точность определения влажности порошков, гранулятов и пеллет является одной из проблем существующих методов онлайн-мониторинга фармацевтических производств. Анализ в этом случае затруднен высокой турбулентностью процессов грануляции и сушки в псевдоожиженном (“кипящем”) слое реактора, обеспечивающем циркуляцию взвешенных частиц в подаваемом снизу воздушном потоке. Быстро меняющаяся плотность виртуального образца, находящегося в “поле зрения” зонда, приводит к сильным колебаниям общей спектральной интенсивности. Как показано в работе [69], традиционные способы устранения этого эффекта математической предобработкой спектров (так называемая коррекция рассеяния) одновременно удаляет полезную спектральную информацию – зависимость рассеяния света от влажности материала. Высокая корреляция спектральных интенсивностей с массовой долей воды проявляется даже на тех длинах волн, которые не принадлежат полосам поглощения воды.

Для повышения точности определения воды градуировочные модели строили на представительном наборе данных, который включал 25 загрузок процесса, 16303 онлайн-спектра и 301 референтный образец, изъятый из среды процесса для термогравиметрического анализа. Для сохранения в данных наиболее полной информации (связанной с разным содержанием воды) удаление стохастических перепадов спектральной интенсивности было проведено сглаживанием методом скользящего среднего вдоль временно́й оси. Такая предобработка позволила существенно улучшить качество данных, избежав информационных потерь при коррекции рассеяния. Это позволило снизить среднеквадратичное отклонение прогноза определения воды (%, г/100 г) в широком диапазоне концентраций с обычных 0.3% до 0.1%.

Еще один процесс фармпроизводства, требующий онлайн-контроля – нанесение защитной полимерной оболочки пеллет, обеспечивающей целевую доставку лекарства – замедленное высвобождение АФИ в пищеварительном тракте. Отдельной задачей в анализе процессов изготовления пеллет и разработке соответствующих ОМС является прогнозирование профиля высвобождения АФИ пеллет из наблюдаемых в ходе процесса БИК-спектров. Кинетика растворения определяет качество производимого препарата. Спланированный в работе [111] эксперимент включал 12 загрузок процесса с двумя видами материала покрытия и различными условиями проведения. Тесты растворимости отобранных из среды процесса образцов на разной стадии готовности показали, что зависимость доли высвобожденного АФИ $\left( {{\varphi }} \right)$ от времени t независимо от материала и толщины покрытия хорошо описывается уравнением с двумя константами m и k, сходным с кинетикой автокатализа. Причем параметр m отвечает за скорость высвобождения (наклон), а k – задержку (индукционный период):

Исследование показало, что параметр m определяется исключительно материалом покрытия и может быть рассчитан из данных соответствующих загрузок процесса с использованием последовательной Байесовой оценки. Согласно этому методу статистического анализа данные отдельных загрузок обрабатываются одни за другими, а оценки, полученные нелинейной аппроксимацией предыдущей загрузки, используются как априорная информация для следующей. Другая константа k тесно связана с толщиной нанесенного покрытия (спектрально наблюдаемой через общую массу нанесенного материала) и, следовательно, может быть определена с помощью градуировки на БИК-спектрах процесса. Прогнозирование кривой растворимости лекарств спектральным методом сделано впервые.

В исследовании [110] показана возможность определения толщины покрытия пеллет через их усредненный размер. Толщину определяли при помощи анализа цифровых фотографий, отобранных из среды процесса проб с последующей ПЛС-градуировкой на собранных признаках изображения. Метод может стать основой ОМС для экспресс-анализа или доработан до онлайн-метода.

Онлайн-мониторинг биотехнологических процессов. Показаны примеры разработки ОМС разных типов для мониторинга процесса ферментации дрожжей S. cerevisiae на основе БИК-, ИК- и флуоресцентной спектроскопии [81, 99].

Мультисенсорный ИК-анализатор для определения этанола, глюкозы и фруктозы [81] создавался для онлайн-измерений в режиме нарушенного полного внутреннего отражения. В разработке использовали НПВО-зонды на основе ПИК-волокна с двумя различными НПВО-элементами: алмазным (DATR) и со сменяемым наконечником с ПИК-петлей на конце (LATR). В тестируемых прототипах ОМС использовали две спектрометрические техники: разработанный в исследовании [81] дифракционный спектрометр с пиродетектором PYREOS (GrS) и НИС типа Fabry-Pérot (FPI). НИС был настроен на относительно узкий спектральный интервал (1150–950 см^–1) в ИК-области “отпечатков пальцев”, содержащий сигналы поглощения всех исследуемых компонентов. При этом использовали подход [8], основанный на упрощении эталонного полноспектрального метода (FTIR-DATR) путем замены Фурье-спектрометра или алмазного зонда на более практичные.

Сравнение трех созданных прототипов ИК-ОМС проводили на двух тестовых наборах образцов, каждый из которых состоял из 25 попарных смесей этанол–глюкоза (EG-набор) и фруктоза–глюкоза (FG-набор). Тестовые наборы были смешаны по схеме диагонального дизайна [113]. Как видно из табл. 6, переход от Фурье-спектрометра к GrS или FPI, как и замена алмазного зонда на недорогой и легко тиражируемый LATR, связаны с неизбежной потерей спектрального разрешения и качества сигнала. При этом многомерные модели сохраняют достаточно приемлемую точность для ряда практических приложений мониторинга процессов в пищевой промышленности. Работоспособность одной из систем (GrS-LATR) была подтверждена испытаниями в ходе процесса ферментации в управляемом лабораторном биореакторе.

Представленные результаты показывают, что использование методов хемометрики для анализа данных и построения градуировок при разработке ОМС в значительной степени компенсирует снижение качества данных – селективности, спектрального разрешения и других характеристик. Убедительно показана принципиальная возможность создания ИК-ОМС для мониторинга типичных для ферментации концентраций этанола, глюкозы и фруктозы в среде биотехнологического процесса. Возможность независимого определения различных углеводов при помощи ОМС дает несомненное преимущество по сравнению с существующими одноканальными, к примеру, рефрактометрическими анализаторами.

На основе флуориметрии были разработаны два прототипа ОМС для онлайн-мониторинга ферментации S. cerevisiae [99]. Одной из типичных проблем флуориметрического спектрального анализа ферментационной среды является наложение сигналов биофлуорофоров на интенсивную полосу эмиссии возбуждающего излучения, рассеянного средой. Акцент исследования сделан на преодолении этого эффекта экспериментальными и математическими средствами.

В первом варианте показано, что наблюдаемая в онлайн-спектрах дополнительная полоса излучения (от встроенного оптического сенсора) с максимумом при 870 нм заметно улучшает точность прогноза биомассы по сравнению с использованием областей сигналов только флуоресценции или только БИК-сенсора по отдельности. Зависимость интенсивности рассеяния от концентрации клеток дрожжей позволяет различить растущую флуоресценцию внутриклеточных флуорофоров и убывающую сходных веществ в составе среды ферментации.

Для разработки метода онлайн-мониторинга культивации S. cerevisiae посредством двумерной флуориметрии (второй вариант) в ходе процесса было получено 39 спектров возбуждения-эмиссии (СВЭ), включающих спектры флуоресценции на 24 длинах волн возбуждения. Из-за сильного доминирования полосы возбуждающего излучения в спектрах исходные данные процесса плохо пригодны для стандартных хемометрических методов регрессионного анализа. В то же время предобработка данных разрушительна для слабого сигнала флуоресценции. Поэтому для анализа данных был разработан новый алгоритм, позволяющий разрешить как траекторию процесса, так и чистые двумерные СВЭ отдельных флуорофоров.

Испытания различных оптических спектральных методов в четырех процессах ферментации дрожжей S. cerevisiae доказали перспективность создания ОМС на базе ИК-спектроскопии и флуориметрии, в том числе двумерной. Важную роль при этом играет максимальное использование спектральной информации, а также применение методов разведочного анализа данных на этапе разработки.

Оптические методы в медицинской диагностике. Медицинская диагностика является важнейшей областью практического приложения ОМС. В серии исследований [37, 50, 51, 96] были разработаны прототипы оптических диагностических анализаторов для определения границы опухоли при раке почки у человека (разрешение этической комиссии EA1/134/12 клиники Charite, Берлин, ФРГ). Спектральная гистопатология является относительно новым подходом в онкологической диагностике, способным снизить вероятность ошибки в ходе хирургической операции. В первом примере были разработаны и прототипы светодиодных ОМС на основе БИК-спектроскопии, основанные на быстром попеременном облучении образца на нескольких длинах волн, а диффузно отраженный свет регистрируется фотодиодным детектором. По данным разведочного анализа были выбраны четыре светодиода с центральными длинами волн вблизи максимумов поглощения воды (0.94 и 1.44 мкм) и липидов (1.17 мкм) – известных маркеров некоторых видов рака. Светодиод с максимумом испускания на 1.30 мкм предназначался для коррекции рассеяния и служил внутренним каналом сравнения в соответствии с концепцией безэталонного измерения (см. выше). Целью исследования было экспериментальное подтверждение принципиальной возможности распознавания патологически измененной биоткани предложенным методом через спектрально детектируемые обобщенные химические (содержание воды, липидов, гликогена и других маркеров рака без их количественного определения) и морфологические характеристики при малом числе доступных клинических образцов.

Для повышения достоверности результатов экспериментальный план имел несколько иерархических уровней, включающих повторные измерения в нескольких точках каждого из образцов. Таким образом, результирующие измерения отражали изменчивость ткани как в пределах образца, так и между ними. Дискриминантный анализ данных проводился методом ПЛС-ДА, основанном на построении градуировочной модели, где образцы здоровой и больной ткани кодируются численно (0 и 1 соответственно), а отнесение нового образца происходит по положению прогноза относительно границы 0.5. Полученные в работе значения чувствительности, селективности и точности для наиболее консервативного метода проверки модели указывают на общую пригодность светодиодных БИК-ОМС для распознания опухоли [37, 96] и целесообразность их дальнейшей разработки. Основной проблемой остается недостаточная чувствительность, вызванная большим разнообразием ткани раковых образцов, что может быть преодолено за счет использования в дальнейшем более представительных клинических данных. В ходе разработки должна быть тщательно оптимизирована оптическая конфигурация каналов (их число и рабочие длины волн), а также геометрия измерения. Информативность измерения может быть повышена расширением спектральной области или добавлением других методов спектроскопии.

Во втором примере исследованы диагностические возможности методов флуоресцентной и ИК-спектроскопии, а также проверена эффективность их объединения в одном устройстве. Для обеспечения совместимости ИК-спектры (снятые на Фурье-спектрометре с НПВО-зондом на основе ПИК-волокна) и спектры флуоресценции (возбуждаемые лазером при 473 нм и регистрируемые через зонд диффузного отражения) снимали в одних и тех же размеченных позициях (всего 31 точка на восьми доступных образцах). Результирующий набор данных включал 92 пары спектров, которые затем анализировали как отдельно, так и совместно путем соединения их в один вектор вдоль спектральной оси. Для анализа ИК-спектры были сужены до наиболее информативной (с точки зрения известной биохимии заболевания) области 1220–1010 см^–1, а спектры флуоресценции – до области наблюдаемого сигнала 490–680 нм. Для поиска оптимального решения использовали комбинаторный подход, тестирующий все наилучшие методы предобработки отдельных спектральных блоков и их всевозможные комбинации при совместном анализе данных. Разведочный анализ показал полное разделение классов “рак” и “норма” только для комбинированных данных.

В ПЛС-ДА-анализе флуориметрия показывает более низкую дискриминирующую способность, чем ИК-спектроскопия. Объединение спектров флуоресценции со второй производной ИК-спектров с последующей предобработкой методом СНВ ведет к синергетическому эффекту. Это позволяет предположить, что рассмотренные методы отвечают за различные биомаркеры, причем из-за малой глубины проникновения ИК-спектроскопия преимущественно “работает” на клеточном уровне, в то время как флуоресцентный сигнал может приходить с глубины нескольких миллиметров, неся дополнительную химическую и морфологическую информацию. Результат данного исследования обосновывает целесообразность сочетания НПВО-ИК-спектроскопии и флуориметрии в одном аналитическом устройстве. При разработке мультимодального анализатора ИК- и флуоресцентный спектрометры могут быть заменены на ОМС.

Экологический мониторинг. Заключительный практический пример посвящен разработке экспресс-метода и ОМС для экологического мониторинга почв с целью определения общих углеводородов нефти (ОУН) на основе ИК-измерения через НПВО-зонд [104, 112]. Предварительный анализ ИК-спектров спланированной серии 57 искусственных образцов почвогрунта, приготовленных смешиванием почвенного субстрата, глины, песка и доломитовой муки, позволил изучить спектральные характеристики почв различного состава и сравнить их со спектрами нефти. На основе этих данных для количественного анализа ОУН была выбрана спектральная область 4000–1700 см^–1 и оптимальный для нее НПВО-зонд на основе халькогенидного ИК-волокна с рабочим кристаллическим элементом ZrO₂.

Градуировочная серия загрязненных образцов была приготовлена путем добавления нефти и воды как основного природного фактора, влияющего на измерение, к 100 г искусственного образца почвогрунта, по составу близкого к распространенному в Самарской области. При измерениях зонд приводили в плотный контакт с таблеткой образца с полным погружением в нее кристалла. Обучающий набор из 25 образцов следовал диагональной схеме [113], в которой содержания обоих компонентов варьировали в диапазоне 1–13%. На этом наборе были построены градуировочные модели для ОУН и воды (%, г/100 г). Наилучшая точность моделей была достигнута при использовании метода интервальной оптимизации [115] с использованием пяти трехточечных интервалов с усреднением без предобработки для ОУН и четырех индивидуальных переменных после применения методов предобработки соответствующих данных, выбранных в качестве оптимальных. Среднеквадратичные отклонения прогноза соответственно составили 1.1% для ОУН и 0.6% для воды.

Основной экспериментальной проблемой метода является низкая общая интенсивность спектров более сухих образов и низкая прецизионность измерения, что вообще характерно для НПВО-анализа твердых материалов. Предложенные оригинальные техники предобработки и анализа данных в значительной степени преодолевают это негативное влияние, и достигаемые погрешности определения являются приемлемыми для ряда практических задач. Полученные результаты позволяют рекомендовать дальнейшую разработку ОМС для полевого определения ОУН на основе ИК-спектроскопии в области 4000–1700 см^–1 через оптоволоконный НПВО-зонд. Дальнейшее повышение точности метода потребует создания улучшенного интерфейса измерения.

* * *

Специализированные оптические анализаторы низкой селективности – оптические мультисенсорные системы – представляют собой новое направление развития аналитической спектроскопии. Благодаря своим потребительским качествам, таким как миниатюрность, портативность, автономность, возможность использования в режиме онлайн и ценовая доступность, ОМС способны существенно расширить аналитические возможности оптической спектроскопии по сравнению с традиционным лабораторным анализом. Их намечающееся широкое использование для решения различных задач качественного и количественного анализа в промышленности, в медицине и других областях повышает уровень аналитического контроля многих важных аспектов человеческой деятельности. Дальнейшая разработка оптических мультисенсорных систем связана с решением целого ряда научных, технических и методологических задач.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, государственное задание № 0778-2020-0005.