Журнал аналитической химии, 2023, T. 78, № 1, стр. 24-33

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Аппаратура. Для изучения оптических и цветометрических характеристик в качестве цветорегистрирующего устройства использовали смартфоны iPhone X и iPhone ХIII (Apple, США), оснащенные специализированным программным обеспечением RGBer. Для возбуждения флуоресценции использовали источник монохроматического излучения с длиной волны 365 нм − осветитель люминесцентный диагностический Лампа Вуда ОЛДД-01 (Россия). Значения рН измеряли иономером Эксперт-001-3(0.1) (Россия) с комбинированным стеклянным электродом ЭСК-10603 (Россия).

В работе применяли аналитические весы Pioneer PA 214С специального класса точности с пределом взвешивания 0.1 мг (Ohaus Corporation, USA), дозаторы Proline Biohit одноканальные механические переменного объема 2–20 мкл, 100–1000 мкл, 1000–5000 мкл (Biohit, Финляндия).

Реактивы. Применяемые при изготовлении тест-устройств реактивы указаны в табл. 1 (Sigma-Aldrich, США и ООО “ХИМРЕАКТИВ”, Россия). Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду, соответствующую требованиям [14].

Изготовление тест-устройства для анализа. Применяли пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии HPTLC Silica gel 60 (Merck, Германия) и целлюлозную бумагу для хроматографии Whatman 17 Chr (Cytiva, США). Для изготовления тест-устройства бумагу замачивали однократно или двукратно (с высушиванием перед повторным замачиванием) в растворах реагентов (табл. 1) с последующим высушиванием.

Из полученных индикаторных бумаг изготавливали тест-устройство (рис. 1, 2) и после нанесения пробы молока измеряли цветометрические параметры.

Рис. 1.

Схема изготовления тест-устройства и измерения цветометрических характеристик индикаторных зон смартфоном. 1 – изготовление индикаторных зон с помощью дырокола, 2 – приклеивание индикаторов на двухсторонний скотч, 3 – нанесение пробы молока на индикаторные зоны, 4, 5 – измерение цветометрических характеристик с помощью смартфона с УФ-облучением и без него.

Рис. 2.

Тест-устройство и схема расположения индикаторных зон (номер зоны соответствует номеру индикатора из табл. 1).

Ход анализа. Образцы питьевого молока коммерческого производства для исследований приобретали в магазинах розничной торговли (супермаркетах) г. Владимира в период с апреля по декабрь 2021 г. (табл. 2). Все образцы были упакованы в пластиковую тару, отбирались с соблюдением сроков годности. Анализ проводили непосредственно после вскрытия бутылки. На индикаторные зоны наносили по 10 мкл образца питьевого молока, через 10–15 мин тест-устройство помещали в бокс (15 × 10 × 8 см) и фотографировали камерой смартфона со вспышкой (рис. 1). При изучении твердофазной флуоресценции индикаторных зон тест-устройство подвергали обработке монохроматическим излучением в УФ-диапазоне и проводили фотографирование в темном помещении. Цветометрические характеристики индикаторных зон оценивали с использованием программного продукта RGBer, установленного на смартфоне. Аналитический сигнал для каждой индикаторной зоны рассчитывали как сумму значений каналов R, G и B.

Хемометрический анализ. Для идентификации и аутентификации молока применяли метод главных компонент (principal component analysis, PCA), иерархический кластерный анализ (hierarchical clustering analysis, HCA) и метод k-средних (k-means) c использованием программного обеспечения XLSTAT (v. 2021.3.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Цветометрия окрашенных индикаторных систем для идентификации и аутентификации молока. Молоко содержит молочный жир, углеводы и минеральные вещества (кальций, фосфор, калий, магний и др.) и в среднем состоит из 87% воды, 4–5% лактозы, 3% белка, 3–4% жира, 0.8% минералов и 0.1% витаминов [15]. Состав молока зависит от вида млекопитающего и его рациона. В частности, распределение жирных кислот сильно зависит от вида животного и в значительной степени коррелирует с типом используемого корма [7]. Одним из важных показателей качества молока является активная кислотность (рН). Этот показатель колеблется в пределах 6.55–6.75 и поддерживается белковой, фосфатной, цитратной и др. буферными системами.

Выбор индикаторов в тест-устройстве для идентификации и аутентификации молока обусловлен его химическим составом, указанным выше. Использовали 12 кислотно-основных индикаторов с рК_а 4.0–8.5, изменение цвета которых зависит от содержания белков, поверхностно-активных веществ и активной кислотности (индикаторы 1–12). Также использовали четыре индикаторные системы, изменяющие цвет в присутствии солей кальция и магния, хлоридов, сульфатов, карбонатов и гидрокарбонатов (индикаторы 13–16) (табл. 1).

Установлены оптимальные условия регистрации аналитического сигнала: время регистрации – 10 мин после нанесения молока на индикаторные зоны, фотографирование со вспышкой при помещении тест-системы в бокс (рис. 1). Аналитический сигнал (A) рассчитывали по формуле: А = R + G + B.

Идентифицировали козье, коровье, овечье и буйволиное молоко. Как видно из рис. 3а, при использовании метода главных компонент можно однозначно установить видовую принадлежность молока: на графике все образцы располагаются в различных квадрантах и образуют соответствующие кластеры. Козье и коровье молоко (“Простоквашино”, 3.5%) оказались в одном кластере (второй квадрант), что свидетельствует о близости их химического состава (рис. 3б).

Рис. 3.

График РСА для идентификации молока от различных видов животных (а) и соответствующая дендрограмма (б). “linkage distance” – расстояние идентифицируемого молока от аналогичного молока, использованного для обучающей выборки.

Установлено, что дифференциация коровьего молока наблюдается как по массовой доле жира образцов, приобретенных у одного производителя (рис. 4а), так и по производителям (региону происхождения) при одинаковой массовой доле жира (жирности) (2.5%) (рис. 4б).

Рис. 4.

График РСА для образца молока “Искренне ваш” с массовой долей жира 1.5–4.0% (а) и для образцов молока с массовой долей жира 2.5% разных производителей (б).

Использование метода иерархического кластерного анализа позволило идентифицировать молоко по массовой доле жира и производителю (рис. 5). Идентифицируемое молоко (Х) выделено в кластеры с нулевым или небольшим расстоянием (linkage distance) от аналогичного молока, использованного для обучающей выборки. Идентификацию проводили также методом k-средних (k-means) по расстоянию от центроида до молока Х. В табл. 3 приведены расстояния от центроида (“Домик в деревне”, 2.5%) до центральной точки кластера определенного молока. Как видно, расхождения в расстояниях молока Х и молока, использованного для обучающей выборки, незначительны, что приводит к 100%-ной идентификации.

Рис. 5.

График РСА для молока разной жирности и разных производителей (а) и соответствующая дендрограмма (б). ИВ – образец молока “Искренне ваш”, ДВД – образец молока “Домик в деревне”.

Цветометрия флуоресценции индикаторных систем для идентификации и аутентификации молока. Флуоресценция молока в основном формируется за счет жирных кислот и витаминов [16]. Флуоресцентные свойства жирных кислот характеризуются максимумом излучения флуоресценции при 400 нм (длины волн возбуждения 310, 325, 355 и 370 нм). Определенный вклад в формирование спектра флуоресценции молока вносят и входящие в его состав витамины. Максимумы полос излучения находятся при следующих длинах волн: витамин А – 510 нм (327 нм), витамин Е – 347 нм (295 нм), витамин С – 460 нм (369 нм), витамин В2 – 520 нм (470 нм), витамин В6 – 400 нм, фолиевая кислота – 450 нм (345 нм).

В данном случае тест-устройство состояло из семи индикаторных зон, пропитанных флуоресцирующими реагентами (1, 2, 6, 7, 10−12) и двух зон из целлюлозной бумаги и пластины ТСХ (силикагель) (табл. 1, рис. 2).

На рис. 6 представлены данные РСА для образцов молока “ВкусВилл” с различной массовой долей жира (от 1.0 до 4%) и образцов молока различных производителей при одинаковом значении массовой доли жира (3.2%). Как и в случае окрашенных индикаторных систем, применение метода главных компонент для обработки аналитического сигнала собственной флуоресценции молока позволяет дифференцировать представленные образцы по массовой доле жира (рис. 6а) и по производителям (региону происхождения) (рис. 6б).

Рис. 6.

График РСА для образцов молока “ВкусВилл” с массовой долей жира 1.0–4.0% (а) и для образцов молока с массовой долей жира 3.2% разных производителей (б).

Фальсификация молока путем разбавления водой или добавления растительных жиров (например, пальмового масла) четко проявляется на графике РСА и дендрограмме (рис. 7). Разбавление молока “Простоквашино” (массовая доля жира 3.5%) в два раза водопроводной водой приводит к переходу позиции образца в другой квадрант и соответственно в другой кластер (3, 6 на рис. 7). Еще большая дифференциация наблюдается при добавлении в молоко “Светаево” (массовая доля жира 1.5%) пальмового масла до массовой доли жира 2.5% (1, 2 на рис. 7).

Рис. 7.

График РСА и дендрограмма для образцов “Светаево” (м.д.ж. 1.5%) с добавлением пальмового масла до массовой доли жира 2.5% (1); “Светаево” (м.д.ж. 1.5%) (2); “Простоквашино” (м.д.ж. 3.5%) (3); козьего молока (м.д.ж. 5.2%) (4); цельного молока (м.д.ж. 4.1%) (5); “Простоквашино” (м.д.ж. 3.5%), разбавленного водой в два раза (6).

Подобные виды фальсификации напрямую влияют на состав исходных образцов натурального происхождения, что приводит к изменению их физико-химических свойств и естественного баланса ингредиентов. Это, в свою очередь, влияет на интенсивность окраски или флуоресценции индикаторных зон тест-устройства. Учитывая аддитивный характер аналитического сигнала (А) в выбранной цветометрической системе RGB и многофакторность исследования (16 и 9 индикаторных зон), смещение позиции на графике или дендрограмме исходного и фальсифицированного образцов будет значительным. Данный факт является несомненным преимуществом, который уменьшает вероятность выдачи ложного результата.

* * *

Таким образом, представлен способ идентификации и аутентификации молока с использованием индикаторных тест-устройств, цветометрического и хемометрического анализов. Сочетание доступных методологий способствует решению нетривиальных задач выявления фальсификации, установления региона производства и видового происхождения продукции посредством комбинации современных, экспрессных и экологичных инструментов. Разработаны тест-системы для комплексной оценки физико-химических показателей и собственной флуоресценции молока, которые обеспечивают дифференциацию представленной в работе выборки по аддитивному аналитическому сигналу (А = R + G + B). Массив данных обрабатывали методами главных компонент и иерархического кластерного анализа. Установлена возможность выявления фальсификатов молока, полученных разбавлением водой и добавлением растительных жиров, по смещению позиции образцов на графике РСА и дендрограмме относительно опорных значений.