Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 2, стр. 136-144

ВВЕДЕНИЕ

Для решения проблемы достоверности масс-спектрометрического определения аминокислотной последовательности в пептидах испробовано множество методов ионизации их молекул и фрагментации ионизированных молекулярных ионов. При этом основными недостатками используемых методов с точки зрения расшифровки масс-спектров являются неполнота перекрывания диапазона получаемых масс, низкая интенсивность пиков фрагментных ионов.

В масс-спектрах пептидов наиболее информативными являются ионы продуктов расщепления молекулы по скелетным амидным связям, содержащие заряд либо на N-концевом фрагменте исходного пептида (b-ионы), либо на С-концевом (y-ионы). Ввиду особенностей механизма распада молекулярного иона пептида в камере столкновений в фрагментных масс-спектрах более интенсивными бывают y-ионы, особенно в случае триптических пептидов [2]. Известные из литературы попытки повышения интенсивности b-ионов (особенно в области низких масс – ионов b₁, b₂, ключевых для идентификации ионов b-серии), не всегда оказываются эффективными [3].

Из-за высокого уровня фона наиболее трудна для идентификации область ионов с m/z < 300, что делает невозможным прямое масс-спектрометрическое определение структуры пептидов в классическим варианте метода MALDI. Это обстоятельство привело к усложнению аппаратуры и методологии анализа (разработка и широкое использование дорогостоящего многостадийного метода MS/MS, вплоть до MS/MSⁿ) [4–6].

Недостатками МС/МС-способа являются следующие:

— сложность и, следовательно, высокая стоимость оборудования;

— низкая интенсивность образующихся b-ионов (особенно в области низкомолекулярных фрагментов), что затрудняет однозначную интерпретацию масс-спектра;

— циклизация коротких линейных пептидов, образующихся при фрагментации исходного пептида, за счет взаимодействия N-концевой аминогруппы пептида с карбонильными группами скелетных амидных связей [7–9]. Чаще всего химической причиной образования циклов является нуклеофильная атака свободной N-концевой аминогруппы пептида на С-концевой карбонил того же пептида [10].

Подобные процессы перегруппировок типичны для электрораспылительной масс-спектрометрии с квадрупольной ячейкой столкновений (тройной квадруполь) из-за большого времени столкновения с молекулами инертного газа в ячейке.

Для повышения информативности масс-спектров проводят химическую модификации N-концевой аминогруппы анализируемых пептидов [8, 10, 11].

Нами был предложен более простой в приборном и методическом исполнении способ масс-спектрометрического секвенирования пептидов и получения их аминокислотных последовательностей [12], заключающийся в том, что масс-спектрометрическая фрагментация молекулярного иона пептида происходит в области низкого вакуума между соплом и скиммером источника ионов под воздействием электрического поля в присутствии остаточного газа. Предлагаемый подход позволяет получать информативные y-ионы, по интенсивности в 5–100 раз превышающие уровень фона, что позволяет определять последовательность аминокислот пептида, содержащего до 10 а.о., без использования компьютерных программ или определять сиквенс более длинных пептидов, проводя компьютерный анализ фрагментации и сравнение полученной аминокислотной последовательности с существующими базами первичных структур белков и пептидов [12].

Особенностью этого способа фрагментации пептидов является то, что в фрагментных масс-спектрах преобладают высокоинтенсивные информативные y-ионы, а интенсивность b-ионов, хотя и возрастает, но в гораздо меньшей степени, чем для y-ионов.

Целью данной работы являлось создание способа получения высокоинтенсивных b-ионов всех образующихся дансилированных фрагментов пептида с последующей однозначной идентификацией аминокислотной последовательности пептида с использованием преимущественно Dns-b-ионов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Продукты реакции дансилирования N-концевой аминогруппы пептидов дансилхлоридом разделяют хроматографически, элюат подают в источник ионов масс-спектрометра в режиме on-line с последующей управляемой фрагментацией дансилированного пептида [11, 12].

При наличии в масс-спектрах пиков Dns-фрагментов, превышающих по интенсивности пики остальных ионов спектра, становится возможным определение полной аминокислотной последовательности пептида с использованием лишь пиков b-ионов и легко идентифицируемых продуктов их распада (отщепление молекул H₂O, CO).

В данной работе представлены масс-спектры исходного недансилированного пептида Thr-Val-Leu (TVL, рис. 1) и его дансилированного производного Dns-TVL (рис. 2, 3), а также аналогичные масс-спектры даларгина (Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg, Y-A-G-F-L-R (Dal) (рис. 4), и Dns-даларгина Dns-Dal (рис. 5–7). Во всех масс-спектрах для наглядности обозначены и Dns-содержащие b‑фрагменты, и ионы внутренней фрагментации пептидов.²²

Рис. 1.

Масс-спектр пептида TVL (U_rf 800 В).

Рис. 2.

Масс-спектр Dns-TVL (U_rf 1000 В).

Рис. 3.

Масс-спектр Dns-TVL (U_rf 300 В).

Рис. 4.

Масс-спектр даларгина (Dal) m/z 100–620 (есть пики всех y-ионов, пики b-ионов отсутствуют).

Рис. 5.

Масс-спектр ди-Dns-Dal (m/z 100–1200).

Рис. 6.

Масс-спектр Dns-Dal (m/z 300–880). Символами y^# обозначены продукты внутренней фрагментации даларгина, не содержащие Dns-группу.

Рис. 7.

Масс-спектр Dns-даларгина (m/z 150–590).

В масс-спектре немодифицированного пептида TVL присутствует ограниченное число пиков b- и y-ионов. С одной стороны, это упрощает вид масс-спектра, но с другой – лишает дополнительной информации, необходимой для определения структуры пептида.

При фрагментации немодифицированного пептида даларгина(II) интенсивность b-ионов ничтожно мала по сравнению с интенсивностью y-ионов (рис. 4). В то же время в масс-спектрах Dns-(I) (рис. 2, 3) и Dns-(II) (рис. 5–7) преобладают пики, соответствующие Dns-производным b‑ионов.

При этом нет необходимости учитывать низкомолекулярные ионы масс-спектра т.к. минимальный наименьший из всех возможных информативных Dns-ионов – иммониевый ион Dns-Gly (+Dns-NH=CH₂) имеет m/z 263, что позволяет исключить из рассмотрения пики ионов с m/z < 263.

Как известно, изменение радиочастотного напряжения U_rf на транспортирующем квадруполе времяпролетного масс-спектрометра позволяет изменять диапазон масс детектируемых ионов. При обычном рабочем напряжении U_rf ≈ 1000 В, низкомолекулярные ионы не попадают на детектор и не видны в масс-спектре (см. рис. 1). Но при снижении U_rf до 300–500 В, массовое окно спектрометра смещается в область более низких масс, и легкие ионы детектируются с хорошей интенсивностью. Однако при этом выпадают из рассмотрения тяжелые ионы. Поэтому для сравнения качества масс-спектров и возможности детектировать и родительские тяжелые ионы, и легкие ионы их фрагментов в данной работе приходилось перенастраивать U_rf.

В масс-спектрах образцов, имеющих Dns-метку и снятых при разных значениях U_rf (300 или 1000 В, рис. 2, 3), нет существенного различия ни в насыщенности масс-спектров пиками фрагментных ионов, ни в интенсивности самих пиков. Это позволяет проводить съемку масс-спектра при одном значении U_rf, без дополнительной фрагментации. В стандартном МС/МС-методе чаще всего это делают для целенаправленного получения низкомолекулярных иммониевых ионов N-концевых аминокислот и коротких пептидов (a₁-, a₂-продуктов вторичной фрагментации первичных b-ионов).

В масс-спектре свободного даларгина присутствуют исключительно пики y-ионов, а пики b-ионов отсутствуют, (кроме пика Tyr_imm, производного от b₁, рис. 4). В спектре Dns-даларгина получены пики всех b-ионов (рис. 5, 6).

Наряду c преимущественным образованием высокоинтенсивных пиков ионов Dns-b-фрагментов пептида, в масс-спектрах обнаруживаются немодифицированные фрагменты внутреннего расщепления Dns-пептида, т.е. не имеющие Dns-группы в своей структуре, но дающие дополнительную информацию о строении пептида (табл. 1, 2).

Отдельно стоит отметить, что в масс-спектре Tyr-содержащего даларгина, наряду с М⁺-ионом моно-Dns-даларгина присутствует M⁺-ион ди-Dns-даларгина. При этом в фрагментных масс-спектрах видны ионы фрагментов только моно-Dns-даларгина и отсутствуют ионы ди-Dns-фрагментов (рис. 5–7).

Таким образом, показана принципиальная возможность получения высокоинтенсивных пиков b-ионов (в том числе и для обычно малоинтенсивных ионов b₁ и b₂) путем фрагментации дансилированных пептидов в узле ввода пробы, а не в отдельной столкновительной камере (q) масс-спектрометра, что позволяет обойтись без дорогостоящего МС/МС-принципа фрагментации.

Благодаря наличию в масс-спектрах ограниченного числа высокоинтенсивных Dns-b-ионов сильно упрощается вид масс-спектра и появляется возможность проводить расшифровку масс-спектров вручную, без использования дорогостоящего масс-спектрометрического программного обеспечения (по крайней мере, для пептидов, содержащих до 10 а.o., обычно составляющих основную часть ферментативных гидролизатов целевых белков и объектов пептидомного анализа).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для растворения образцов и хроматографического анализа использовали ацетонитрил (сорт 0 или 1, Криохром, Санкт-Петербург), муравьиную кислоту (Merck, ФРГ). Тридистиллят воды, используемой для приготовления растворов, и ацетонитрил, пропускали через фильтры 0.45 мкм (фирма “Millipore”, CША). Хроматографию пептидов проводили на микроколоночном хроматографе “Милихром А-02” (Институт хроматографии “Эконова”, Новосибирск). Для анализа использовали пептидные стандарты (Thr-Val-Leu, фирма “Serva”, ФРГ), (даларгин, Calbiochem, США). Дансилирование пептидов проводили, как указано ранее [13]. Образцы растворов Dns-пептидов хроматографировали на колонке с обращенной фазой (ProntosilС₁₈, 120 мкм, 2.0 × × 75–150 мм, Институт хроматографии “Эконова”, г. Новосибирск) в 0.2% муравьиной кислоте c градиентом концентрации ацетонитрила. Элюат, содержащий компоненты смеси, через металлический капилляр диаметром 100 мкм подавался в источник ионов электроспрей со скоростью 2–50 мкл/мин без нагрева узла ввода. В качестве столкновительного газа использовался азот воздуха.

Масс-спектры снимали на масс-спектрометре МХ 5310 (ИАП РАН, Санкт-Петербург): анализатор – времяпролетный рефлектрон с двуxступенчатым зеркалом, рабочий диапазон масс – до 10 000 Да. Масс-спектры всех пептидов снимали при фиксированном напряжении на капилляре (3100–3400 В) и изменяемом напряжении на сопле с шагом 20–30 В в диапазоне 50–300 В и на скиммере в диапазоне 40–80 В.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят С.В. Шабельникова (ЦИН РАН, Санкт-Петербург ) за содействие в проведении эксперимента.