Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 2, стр. 145-154

ВВЕДЕНИЕ

Разработка подходов к снижению повреждения сердца, вызванного ишемическим и реперфузионным стрессом, является актуальной задачей экспериментальной кардиологии. В последние годы в различных лабораториях осуществляется направленный поиск новых соединений, способных воздействовать на адаптационные механизмы в миокардиальных клетках в условиях изменившегося кислородного и энергетического обеспечения и таким образом уменьшать повреждение сердца. При ишемии и последующей реперфузии в миокарде увеличивается выработка ряда присущих организму факторов – адипокинов, цитокинов и вазоактивных пептидов, инициирующих механизмы запрограммированного клеточного выживания, которые запускаются каскадами реперфузионных киназ. К таким соединениям относится адипокин апелин, являющийся лигандом сопряженного с G-белками APJ-рецептора и представляющий собой 77-членный полипептид.

Апелин активно экспрессируется различными тканями, включая эндотелиальные и гладкомышечные клетки коронарных сосудов и кардиомиоциты. Активация системы апелин/APJ-рецептор оказывает вазодилатирующее действие на сосуды, стимулирует транспорт ионов Ca²⁺ в кардиомиоциты, улучшая сократимость миокарда, снижает толерантность к инсулину при ожирении, препятствует образованию атеросклеротических бляшек [1]. Показано, что С-концевые фрагменты апелина (апелин-36, апелин-17, апелин-13 и апелин-12) способны улучшать восстановление функции сердца и снижать необратимые повреждение кардиомиоцитов при реперфузии после длительной ишемии [2]. Пептид апелин-12 (H-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-OH, A12), соответствующий С-концевому фрагменту апелина у животных различных видов и человека, является минимальной активной частью молекулы исходного апелина-77. Он обладает высоким сродством к APJ-рецептору и оказывает мощное защитное действие при экспериментальной ишемии и реперфузии сердца у крыс [3, 4].

Эти данные указывают на возможность использования пептидов в качестве потенциальных кардиопротекторных лекарственных средств, однако чувствительность пептидов к протеолитической деградации в организме человека является серьезным препятствием к их практическому применению. Во многих лабораториях ведется поиск модифицированных апелиновых пептидов, обладающих селективным действием и метаболической устойчивостью [5, 6].

Нами ранее были синтезированы оригинальные пептиды на основе природного апелина-12 [7, 8]. С целью увеличения протеолитической стабильности в структуры этих соединений были внесены следующие модификации: N-концевой остаток аргинина был защищен от действия аминопептидаз N^α-метильной группой; подверженный окислению остаток метионина был заменен на норлейцин; С-концевой остаток фенилаланина защищали от действия карбоксипептидаз амидированием. Полученные аналоги обладали кардиопротекторной активностью при моделировании ИБС и хронической сердечной недостаточности на лабораторных животных. Было выяснено, что наибольшей защитной эффективностью обладает пептид химической структуры H-MeArg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe-OH, названный метилином. Преимуществом метилина по сравнению с природными кардиопротекторами является комбинированный характер его действия, который включает метаболическую коррекцию, антиоксидантную защиту и стабилизацию мембран кардиомиоцитов, поддержку внутриклеточного ионного гомеостаза и вазодилатационные свойства [9, 10]. Антиишемические и инотропные (увеличение силы сердечных сокращений) свойства этого пептида могут найти клиническое применение в кардиологической практике.

Данная работа является продолжением наших исследований в области дизайна, синтеза и изучения пептидных кардиопротекторов и посвящена разработке оптимизированной методики синтеза и оценке протеолитической стабильности наиболее перспективного в плане практического применения MeArg¹, Nle¹⁰-аналога апелина-12 – метилина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация схемы синтеза метилина. При твердофазном синтезе (ТФС) пептидов, содержащих в последовательности несколько остатков аргинина, часто возникают проблемы, связанные с защитами гуанидиновой функции этой аминокислоты. Как правило, в ТФС в сочетании с N^α-Fmoc-защитой для блокирования гуанидиновой функции аргинина применяют группы тозильного типа (Mtr, Pmc или Pbf). При отщеплении Mtr- или Pmc-защит требуются достаточно жесткие условия и длительные обработки, часто сопровождающиеся образованием побочных продуктов например, реакция сульфатирования гидроксильных групп остатков серина и/или треонина (с выходом побочного продукта до 50%) [11]. Эта побочная реакция характерна и при синтезе апелиновых пептидов.

Ранее мы показали [8], что при получении апелина-12 содержание побочного О-сульфата в “сыром” продукте ТФС может колебаться от 6 до 48% в зависимости от состава смеси, использованной для заключительного деблокирования и отщепления пептида от полимерного носителя. При синтезе метилина мы также столкнулись с образованием соответствующего побочного продукта – О-сульфата метилина. Было установлено, что степень сульфатирования остатка Ser снижается в присутствии воды как скэвенджера в составе деблокирующей смеси, однако полностью подавить эту реакцию не удается. При ТФС апелиновых пептидов в граммовых количествах данная проблема встает более остро, поскольку при укрупнении масштаба синтеза, как правило, повышается интенсивность побочных процессов и, как следствие этого, усложняется очистка пептидов.

С целью исключения возможности образования трудноотделимых побочных продуктов, описанных выше, мы предприняли попытку ТФС метилина с использованием введения остатка аргинина с незащищенной гуанидиновой функцией, хотя примеры реализации такого подхода в твердофазном синтезе пептидов немногочисленны. Принципиальная возможность использования в синтезе производных N^G-незамещенного аргинина обусловлена тем, что основность гуанидиновой функции (рК_а ≈ 12.5) намного выше основности α-аминогруппы эфиров аминокислот; эта разница в основности позволяет в ходе пептидного синтеза селективно блокировать гуанидиновую группу протонированием, что и обеспечивает ее временную защиту на стадии создания амидной связи [12]. Сообщалось об успешном ТФС аналогов рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LH-RH) с применением тактики минимальной защиты, когда аргинин защищали солеобразованием [13].

В нашей лаборатории с применением этой тактики были осуществлены успешные синтезы брадикинина и октапептидного фрагмента 584–591 гликопротеина gp41 ВИЧ1 ступенчатым наращиванием пептидной цепи [14], β-амилоида-(1–42) [15] фрагментной конденсацией на твердой фазе с использованием аргинина без защиты гуанидиновой функции. Для протонирования гуанидиновой группы аргинина использовали хлоргидрат [13] или бромгидрат пиридина [14, 15]; для присоединения соответствующих производных Boc- или Fmoc-Arg(Н⁺)-ОН применяли карбодиимидный метод [13–15] или регент Кастро – BOP [14]. В работе [14] было показано, что конденсация N^α-Fmoc-аргинина с пептидилполимерами в присутствии N,N-диизопропилкарбодиимида или BOP не сопровождается рацемизацией.

Синтез метилина проводили с С-конца с применением Fmoc-методологии. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот использовали следующие защиты: Bu^t – для гидроксильной функции серина, Trt – для имидазольной функции гистидина и Boc – для ε‑аминогруппы лизина, гуанидиновые группы аргининов не защищали. Для исключения из синтетического цикла проблемной стадии пролинсодержащего дипептидилполимера (H-Pro-Phe-P), на первом этапе ТФС фенилаланил-полимер конденсировали с дипептидным блоком Fmoc-Nle-Pro-OH, далее пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте. Для присоединения N-концевого остатка аргинина использовали его N^αBoc,N^α-метильное производное (Boc-MeArg), остаток аргинина в третье положение пептида вводили в виде Fmoc-производного.

Схема 1 . Получение Boc-MeArg-OH.

Синтез Boc-MeArg-OH осуществляли, опираясь на описанную методику [16], по схеме 1 , исходя из Вос-L-глутамина (I). На первой стадии под действием уксусного ангидрида в пиридине происходит дегидратация γ-карбоксамидной функции Вос-глутамина с образованием соответствующего нитрила (II). Затем проводили селективное метилирование α-аминогруппы соединения (II) с использованием иодистого метила и гидрида натрия в тетрагидрофуране с образованием кристаллической N-Вос-2-метиламино-4-циано-L-масляной кислоты (III). Гидрогенолизом продукта (III) на платиновом катализаторе в изопропиловом спирте получали N^αBoc,N^αMe-орнитин (IV), в который вводили гуанидиновую группу действием S-метилизотиомочевины в присутствии триэтиламина с образованием целевого N^αBoc,N^αMe-аргинина (V). Соединение (V) очищали на катионообменнике в пиридин-ацетатном буфере до 95%-й чистоты. Полученный продукт был идентичен коммерческому образцу. Структуру полупродуктов и целевого соединения (V) подтверждали данными спектроскопии ¹Н-ЯМР, а их чистоту анализировали с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе.

Для разработки оптимальной схемы синтеза были проведены тестовые ТФС метилина в автоматическом и ручном режиме, в которых меняли масштаб синтеза (от 0.5 до 1.5 ммоль), реагенты для протонирования гуанидиновой функции аргинина и способ создания амидной связи. Для протонирования гуанидиновой группы применяли либо бромгидрат пиридина [14, 15], либо 1-гидроксибензотриазол (HOBT). При этом оказалось, что HOBT эффективно блокирует боковую функцию аргинина, а получаемые при этом соли N^α-защищенного аргинина существенно лучше, чем соответствующие хлор- или бромгидраты, растворяются в применяемых для ТФС растворителях.

Для создания амидной связи использовали карбодиимидный метод, соли фосфония/урония – реагент Кастро гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония (ВОР) [17] или тетрафторборат N,N,N',N'-тетраметил-О -(бензотриазол-1-ил)урония (TBTU) [18].

Важным нюансом конденсации производных N^G-незащищенного аргинина с использованием BOP или TBTU является возможность проведения реакции без применения органического основания. Обычно при использовании ВОР и TBTU в ТФС для активации карбоксильной группы применяют 2–3 эквивалента органического основания (диизопропилэтиламина или N-метилморфолина), необходимого для связывания кислых противоионов – гексафторфосфата или тетрафторбората. Известно, что избытки оснований способны привести к рацемизации присоединяемой аминокислоты. В случае активации карбоксильной группы Fmoc-Arg-OH или Fmoc-MeArg-OH в присутствии ВОР или TBTU их гуанидиновая группа (с рК_а ≈ 12.5) играет роль органического основания, являясь акцептором кислых противоионов и при этом происходит ее блокирование.

Дополнительным преимуществом этого способа конденсации является тот факт, что активированное производное аргинина получается in situ в условиях непрерывного технологического процесса, т.е. не требуется введения дополнительной стадии приготовления активированных производных аргинина.

В наших экспериментах лучшие результаты на стадии введения в пептидную цепь остатков аргинина были получены при 2-кратном проведении соответствующих конденсаций с использованием ВОР или TBTU (см. табл. 1). В работе [14] было показано, что в ходе ТФС на стадии деблокирования N^G-незамещенного Arg-содержащего пептидилполимера пиперидиновым реагентом происходит депротонирование гуанидиновой функции. Для предотвращения возможного ацилирования гуанидина при следующей стадии конденсации, мы применяли 5-минутную промывку аминосвободного Arg-пептидилполимера 5% раствором HOBT в DMF или NMP непосредственно перед введением следующей аминокислоты. Оказалось, что эта дополнительная обработка исчерпывающе защищает гуанидиновую группу остатков аргинина протонированием и не препятствует ацилированию α-аминогруппы Arg-пептида, сидящего на полимере. Кроме того, в отличие от бромгидрата пиридина, 1-гидроксибензотриазол хорошо растворим в органических растворителях, и его растворы в вышеприведенных растворителях устойчивы при хранении.

В табл. 1 дана сравнительная оценка результатов синтеза метилина по традиционной схеме ТФС с постоянными защитами гуанидиновой функции остатков аргинина (как описано в работе [8]) и с временной защитой аргининов протонированием, а на рис. 1 представлены профили аналитической ВЭЖХ соответствующих “сырых” продуктов ТФС. С точки зрения выхода целевого пептида обе схемы синтеза дают сопоставимые результаты, однако состав “сырого” продукта, полученного с использованием незащищенного аргинина, благодаря отсутствию трудноотделимых примесей позволяет получить пептид с чистотой более 98% в одну стадию с помощью ионообменной хроматографии (ср. рис. 1а и б). Чистота пептида подтверждена данными ВЭЖХ, а структура пептида – данными масс-спектрометрии и ¹Н-ЯМР-спектроскопии, представленными в табл. 2.

Рис. 1.

Аналитическая ВЭЖХ “сырых” продуктов ТФС метилина с постоянной (а) и временной (б) защитой остатков аргинина. Колонка Kromasil 100 C18, 5 мкм, 4.6 × 250 мм. Пептиды элюировали со скоростью 1 мл/мин градиентом буфера Б в буфере А от 10 до 70% за 30 мин, буфер А – 0.05 M KH₂PO₄, pH 3.0, буфер Б – 70% ацетонитрил в буфере А, детекция при 220 нм.

Таким образом, разработанная методика получения метилина с временным блокированием гуанидиновых функций остатков аргинина на стадии его включения в пептид с использованием традиционных для ТФС реагентов образования амидной связи позволяет существенно упростить пост-синтетические процедуры и последующую очистку сырого продукта.

Изучение протеолитической деградации метилина с помощью спектроскопии протонного магнитного резонанса. Следующим этапом работы было сравнительное изучение протеолитической стабильности апелина-12 и метилина в плазме крови человека. Пептиды в биологических системах подвергаются быстрому ферментативному гидролизу, что существенно ограничивает их практическое применение. Изучение протеолитической стабильности пептидов и путей их деградации дает важную информацию, необходимую для целенаправленного создания протеолитически устойчивых соединений, в частности, путем защиты участков пептидной цепи с преимущественно гидролизуемыми амидными связями. Задача количественного определения введенных в организм пептидов представляется достаточно сложной, требует разработки специальных подходов и до сих пор во многом остается нерешенной.

В настоящее время для изучения протеолитической деградации пептидов in vivo и in vitro применяют различные методы. Одним из подходов к исследованию метаболизма пептидов является использование в этом анализе аналогов изучаемых пептидов, содержащих изотопные метки. Так, биодеградацию семакса, селанка, [Leu]энкефалина и гексапептидного фрагмента фактора дифференцировки лейкоцитов (HLDF-6-амида) исследовали с помощью равномерно меченных тритием аналогов этих пептидов, а для анализа меченых соединений применяли ВЭЖХ [19, 20].

Наиболее часто для изучения биодеградации пептидов используется комбинация ВЭЖХ с масс-спектрометрией [21]. Авторы работы [22] разработали чувствительный метод определения присутствующих в плазме крови человека апелинов-12, -13, -17, -36, и [Pyr¹]апелина-13, основанный на катионообменной экстракции апелиновых пептидов из плазмы крови с последующей мультиплексной жидкостной хроматографией/ тандемной масс-спектрометрией (LC/MS/MS). В этой работе для количественной оценки каждой из апелиновых форм использовались внутренние стандарты апелинов-12, -13, -17, -36 и [Pyr¹]апелина-13, содержащие стабильные изотопы ¹³С и ¹⁵N.

Для анализа ферментативных превращений пептидов в различных биологических системах используется также ЯМР-спектроскопия [23–26]. Высокая степень индивидуальности спектров ЯМР [27] пептидов дает возможность непосредственно в ходе ферментативного гидролиза определить как качественный, так и количественный состав образующихся продуктов распада. При этом, что особенно важно, для идентификации структуры продуктов гидролиза не требуется их выделения из биологической смеси [23–26]. Метод позволяет, используя один образец пептида, непрерывно следить за кинетикой его гидролиза. Одним из ограничений метода является его относительно низкая чувствительность. Поэтому приходится работать в области концентраций пептидов, заметно превышающих фармакологические. Тем не менее, метод непрерывной регистрации гидролиза пептидов удобен при изучении взаимосвязи структуры и ферментативной стабильности в рядах пептидных аналогов. Ранее мы успешно использовали ¹Н-ЯМР для сравнительной оценки протеолитической стабильности ряда пептидных ингибиторов киназы легких цепей миозина [28, 29].

Фрагменты спектров ЯМР природного апелина-12 в плазме крови человека, полученные через различные промежутки времени после его добавления в плазму крови человека, даны на рис. 2. Сравнение этих спектров показывает, что амплитуда сигналов пептида при 4.37 и 3.35 м.д., относящихся к протонам С^αН- и С^δН₂-групп остатков Arg¹ в составе пептида, со временем уменьшается; при этом в спектрах появляются новые, более узкие, сигналы при 3.88 и 3.35 м.д., амплитуда которых со временем увеличивается. Эти сигналы отнесены, соответственно, к протонам С^αН- и С^δН₂-групп свободного аргинина, что было подтверждено неизменностью химических сдвигов этих сигналов при добавлении аминокислоты – аргинина в раствор. Сигналов других свободных аминокислот, в частности, C-концевого Phe¹² на начальном этапе деградации обнаружено не было.

Рис. 2.

Фрагменты спектров ¹Н-ЯМР апелина-12 в плазме крови человека (после вычитания спектра плазмы), полученные через 20 (а), 100 (б), 210 (в), 400 (г), 600 (д) и 800 мин (е) после добавления пептида в плазму. Сигналы протонов остатков аминокислот – продуктов протеолитической деградации помечены символом *.

Следовательно, первоначальной стадией деградации апелина-12 является гидролиз связи Arg¹–Pro²N-концевой части пептида c образованием свободного аргинина. Время полудеградации N-концевой части апелина-12 в плазме крови оказалось равным приблизительно 2 ч 45 мин. Значительное перекрывание сигналов протонов С^δН₂-групп остатков Arg¹ (3.35 м.д.) и Arg³ (3.32 м.д.) в составе апелина-12, а также и С^δН₂-протонов отщепившегося свободного аргинина при 3.35 м.д. затрудняет получение информации о пути распада и времени полужизни этого пептида в плазме. В дальнейшем, после трехчасовой инкубации апелина-12 в плазме, кроме сигналов протонов свободного аргинина, в спектрах появляются сигналы и других свободных аминокислот: δ-СН₃-группы свободного Leu⁴ при 1.05, 1.06 м.д., С^δН₂-пролина при 3.45, 3.52 м.д., а также протонов ароматического кольца С-концевого Phe¹².

Кинетическая картина (рис. 3) изменения амплитуды сигналов протонов (С^2,6Н, С⁴Н, С^3,5Н) ароматического кольца С-концевого остатка Phe¹² и, в первую очередь, амплитуды сигналов протонов С^3,5Н отщепившегося фенилаланина при 7.53 м.д. позволила оценить время полужизни С-концевого остатка Phe¹² в апелине-12 в плазме крови, которое оказалось близким к 8 ч. Следовательно, скорость отщепления С-концевого остатка Phe¹² в плазме, по крайней мере, в три раза меньше скорости гидролиза связи Arg¹–Pro² в N‑концевой части апелина-12. Таким образом, определяющей фактором в деградации апелина-12 в плазме крови является последовательное отщепления N-концевых аминокислотных остатков, начиная с отщепления Arg¹ .

Рис. 3.

Фрагменты спектров ¹Н-ЯМР апелина-12 в плазме крови человека (после вычитания спектра плазмы), полученные через 300 (а), 500 (б), 700 (в), 850 (г), 1000 (д) и 1300 мин (е) после добавления пептида в плазму. Сигналы протонов остатка фенилаланинина – продукта протеолитической деградации помечены символом *.

В отличие от апелина-12 в спектрах метилина не наблюдается каких-либо существенных изменений амплитуды сигналов протонов аминокислотных остатков N-концевой части пептида, по крайней мере в первые 4 ч его инкубации в плазме (рис. 4). В частности, не изменяется амплитуда сигналов протонов С^δН₂-групп (3.34 м.д.) остатков МеArg¹, Arg³, а также протонов метильной группы MeArg¹ при 2.63 м.д., т.е. связь МеArg¹– Pro² в метилине не гидролизуется. Ранее также было показано, что метилирование N-концевых остатков в пептидах в значительной степени защищает их от действия аминопептидаз [26, 27]. Время полужизни метилина в плазме крови определяется только скоростью отщепления С-концевого остатка Phe¹², свидетельством чего является, как и в случае апелина-12, появление в спектрах метилина, например, сигналов протонов ароматического кольца свободного фенилаланина-С^3,5Н при 7.53 м.д. Скорость отщепления остатка Phe¹² в метилине практически такая же, как в апелина-12 и близка к 8 ч.

Рис. 4.

Фрагменты спектров ¹Н-ЯМР метилина в плазме крови человека (после вычитания спектра плазмы), полученные через 20 (а), 300 (б), 500 (в), 700 (г) и 1000 мин (д) после добавления пептида в плазму. Сигналы протонов остатков аминокислот – продуктов протеолитической деградации помечены символом *.

Разумеется, значения времен полужизни пептидов, полученные в экспериментах in vitro, не соответствуют времени их реальной сохранности в кровотоке, т.к. в этих экспериментах концентрации пептидов существенно выше, а активность ферментов плазмы крови ниже, чем в физиологических условиях. Кроме того, следует отметить значительное уширение сигналов рассмотренных пептидов в плазме крови по сравнению с их раствором в D₂O без заметного изменения их химических сдвигов. Этот факт можно объяснить обратимым связыванием пептидов с компонентами плазмы крови, что может приводить к увеличению времени их распада. Однако проведенные сравнительные эксперименты позволяют построить ряд относительной устойчивости пептидов к протеолитической деградации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возможность использования модифицированных пептидов апелина в качестве потенциальных лекарственных средств для терапии сердечно-сосудистых заболеваний диктует необходимость разработки оптимизированных способов синтеза этих соединений и изучения их стабильности в биологических системах. Представленная схема получения метилина исключает возможность образования побочных продуктов сульфатирования гидроксильной группы остатка серина, что обеспечивает упрощение пост-синтетических процедур и очистки пептида. Исследование протеолитической стабильности метилина c помощью ¹H-ЯМР выявило существенное возрастание времени полужизни пептида в плазме человека по сравнению с природным апелином-12. Такие свойства могут повысить эффективность внутривенного введения метилина больным с различной патологией сердца, а также обосновывают возможность его использования в составе комплекса мер, направленных на защиту миокарда, при проведении операций на открытом сердце. Эти результаты являются принципиально важными для организации экспериментального производства метилина и его запланированных клинических испытаний в ФГБУ “НМИЦ кардиологии” Минздрава России.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы производные L-аминокислот (Fluka, NovaBiochem и Bachem Швейцария), BOP, HOBt, TBTU, NMM (Fluka, Швейцария), TIBS (Sigma-Aldrich, США). Для синтеза применяли DMF, N-метилпирролидон (NMP), дихлорметан, 4-метилпиперидин и TFA (Fluka, Швейцария). Для синтеза и очистки пептидов использовали ацетонитрил и изопропиловый спирт (Panreac, Испания). Аналитическую ВЭЖХ пептидов проводили на приборе Knauer (ФРГ) на колонке Kromasil (Швеция) 4.6 × 250 мм, 5 мкм; пептиды элюировали со скоростью 1 мл/мин градиентом буфера Б в буфере А: от 10 до 70% за 30 мин, буфер А – 0.05 M KH₂PO₄, pH 3.0, буфер Б – 70% ацетонитрила в буфере А, детекция при 220 нм. Препаративную ВЭЖХ пептидов проводили на приборе Knauer (ФРГ) на колонке Диасорб С16 130Т (25 × 250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А – 0.01 M NH₄OAc, pH 4.5, буфер Б – 70% ацетонитрила в буфере А. Пептиды элюировали градиентом 0.5% в минуту буфера Б в буфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин, детекция при 226 нм.

Ионообменную хроматографию проводили на колонке с СМ-сефадексом (Sigma-Aldrich, США) 25 × 700 мм, пептиды элюировали линейным градиентом концентрации пиридин-ацетатного буфера с рН 4.5 от 0.05 до 2 М.

ЯМР-спектры сняты на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d₆ при 300 K, концентрация пептидов составляла 2–3 мг/мл, химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана и масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе VISION 2000, Termobioanalysis corp., Finnigan, США).

Схема 2 . Твердофазный синтез метилина.

Автоматический твердофазный синтез метилина проводили согласно схеме 2 на синтезаторе Tribute-UV (Protein Technologies Inc., США), начиная с 0.83 г (0.5 ммоль) Fmoc-Phe-полимера (Sigma-Aldrich, США) с содержанием стартовой аминокислоты 0.60 ммоль/г. ТФС метилина в ручном варианте проводили, исходя из 2.5 г (1.5 ммоль) того же аминоацилполимера.

На приведенной выше схеме циклы ТФС пронумерованы в соответствии с последовательностью присоединения аминокислот. Протокол ТФС для циклов 1–7 был стандартным и включал следующие стадии: деблокирование α-аминогрупп раствором 5% 4-MePip и 2% DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ен) в DMF 5 мин (в программу была включена функция спектрофотометрического контроля полноты отщепления Fmoc-защиты); промывки DMF; присоединение 4-х кратного избытка Fmoc-AA в присутствии TBTU/NMM в DMF в течение 1.5 ч; промывки DMF. В циклах 8 и 10 для присоединения Fmoc-Arg-OH и Boc-N^αMe-Arg-OH cоответственно проводили двойные конденсации. Вариант 1 – к раствору 2.0 ммоль Fmoc-Arg-OH и 2.0 ммоль HBr-Pyr в 15 мл смеси DMF/NMP 1 : 1, добавляли 2.0 ммоль DIC и 2.0 ммоль HOBt и эту смесь прибавляли к пептидилполимеру, перемешивали 1.5 ч, после чего пептидилполимер промывали DMF и конденсацию повторяли с теми же количествами реагентов. Вариант 2 – к раствору 2.0 ммоль Fmoc-Arg-OH и 4.0 ммоль HOBt в 15 мл смеси DMF/NMP 1 : 1, прибавляли 2.0 ммоль DIC и смесь прибавляли к пептидилполимеру, перемешивали 1.5 ч, пептидилполимер промывали DMF и конденсацию повторяли. Вариант 3 – смесь 2.0 ммоль Fmoc-Arg-OH + 2.0 ммоль BOP растворяли в 10 мл DMF в течение 4 мин, прибавляли к пептидилполимеру и перемешивали 1.5 ч, после промывок конденсацию повторяли. Кроме того, в двух заключительных циклах синтеза – 9 и 10 перед конденсацией в протокол была включена дополнительная промывка α-аминодеблокированного пептидилполимера 5% раствором HOBt в DMF в течение 5 мин. Деблокирование и отщепление додекапептида от полимера осуществляли действием смеси TFA–вода–TIBS (95 : 2.5 : 2.5), после осаждения пептида и промывок диэтиловым эфиром полученный продукт очищали с помощью ИОХ до 98%-й чистоты (по данным ВЭЖХ в вышеуказанных условиях). Структуру полученного пептида подтверждали данными ¹Н-ЯМР-спектроскопии, приведенными в табл. 2. Масс-спектр: найдено m/z 1418.866; M_{расчет.} = 1418.7.

Получение плазмы крови. Плазму получали из крови здорового донора путем осаждения клеточных элементов и ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr в течении 48 ч при 4°С для удаления фракции липидов. Плазму без липидов диализовали в фосфатно-солевом буфере (2.68 мМ KCl, 1.47 мМ KH₂PO4, 136.89 мМ NaCl, 8.1 мМ Na₂HPO₄, pH 7.1–7.4), лиофилизовали и растворяли в D₂O.

¹Н-ЯМР-анализ деградации пептидов. Химические сдвиги сигналов в ¹Н-ЯМР-спектрах были измерены относительно внутреннего стандарта – натриевой соли 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфаната. Отнесение сигналов к определенным группам протонов аминокислотных остатков проводилось с помощью метода дифференциального двойного резонанса. Для выделения сигналов, принадлежащих протонам пептида, применялась разностная спектроскопия: из каждого спектра, полученного после добавления пептида в плазму крови, вычитался спектр свободной плазмы. Концентрация пептида в образце составляла 2–2.5 мг/мл.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при поддержке Минздрава России (НИР № 20180201-27).