Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 3, стр. 272-287
Внутривидовая изменчивость состава яда моноклевой кобры Naja kaouthia
В. В. Рябинин 1, Р. Х. Зиганшин 1, В. Г. Старков 1, В. И. Цетлин 1, Ю. Н. Уткин 1, *, **
1 ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
117997 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия
* E-mail: utkin@ibch.ru
** E-mail: yutkin@yandex.ru
Поступила в редакцию 28.09.2018
После доработки 10.10.2018
Принята к публикации 19.10.2018
Аннотация
Проведен протеомный анализ яда самцов и самок моноклевой кобры Naja kaouthia, содержавшихся в неволе. С использованием в качестве базы данных аминокислотных последовательностей белков представителей таксономической группы Serpentes из базы данных UniProt KB в образцах ядов было идентифицировано 875 белков, а относительное содержание около 190 из них было определено в каждом образце яда методом безметочной количественной протеомики. Показано, что суммарное содержание 35 основных белковых компонентов яда каждой особи составляет около 98% общего количества белков. Анализ относительного содержания токсических компонентов яда у самцов и самок показал достоверное (p < 0.05) более высокое содержание фактора роста нервов и натрийуретического пептида в яде самок. Анализ профиля посттрансляционных модификаций токсинов яда N. kaouthia выявил у них неизвестные ранее сайты фосфорилирования, ацетилирования и формилирования.
ВВЕДЕНИЕ
Яды змей представляют собой сложные многокомпонентные смеси, содержащие в основном белковые соединения, с ярко выраженной биологической активностью и в течение многих веков применяются в качестве лекарственных средств. В настоящее время в ряде стран в качестве противовоспалительных и обезболивающих средств применяются мази, содержащие цельные яды змей: випросал В (Россия), кобратоксан и наятокс (Вьетнам), коброксин (США) и др. Однако и отдельные компоненты ядов могут служить основой для создания новых лекарственных средств. Например, нейротоксины из ядов кобр, такие как кобрoтоксин, короткий α-нейротоксин из яда тайваньской кобры Naja naja atra [1] и длинный α-нейротоксин из яда таиландской кобры N. kaouthia [2], проявляют выраженный анальгезирующий эффект. Кардиотоксин III из яда кобры N. naja atra блокирует миграцию и инвазию опухолевых клеток MDA-MB-231 (рак молочной железы) [3]. Цитотоксин NN-32 из яда N. kaouthia перспективен для лечения артрита [4], а цитотоксин NKCT1 кобры N. naja способен подавлять рост опухолевых клеток (лимфома) [5]. Выявление и эффективное использование такого рода белков представляет собой одну из актуальных проблем современной медицины и фармакологии.
Вместе с тем, существует проблема значительной вариабельности в составе белковых компонентов яда змей даже одного и того же вида, которая обусловлена различиями в среде обитания, рационе, возрасте змей и рядом других причин. Эту особенность необходимо учитывать при использовании ядов в качестве сырья для получения лекарственных средств и при проведении научных исследований. Одним из методов, позволяющих определить состав яда с высокой точностью, является протеомный анализ с использованием хроматомасс-спектрометрии. Современные методы протеомного анализа позволяют определить не только качественный, но и количественный состав яда.
Целью настоящей работы являлась оценка методами протеомного анализа вариабельности качественного состава и относительного количественного содержания пептидно-белковых компонентов яда змей вида N. kaouthia (моноклевая кобра), содержащихся в неволе в одинаковых условиях. Для этих целей был применен метод определения относительного содержания белков в яде без использования изотопных меток, до сих пор для анализа яда кобры N. kaouthia не использовавшийся.
Определение количественных различий в содержании белков в сложных биологических системах при, например, изменении физиологического или патофизиологического состояния таких систем является одной из наиболее востребованных задач, решаемых в современных протеомных исследованиях. На сегодняшний день количественную оценку относительного содержания белков в протеомах различных биологических объектов проводят методами хроматомасс-спектрометрии, как с использованием стабильных изотопных меток, так и без них. При сравнении безметочных методов количественного определения белков с методами, основанными на использовании стабильных изотопных меток, было показано, что оба подхода имеют очень близкую эффективность, при значительно более низкой стоимости безметочных подходов [6]. Кроме того, недавно разработанные усовершенствования в методах безметочного анализа белков [7] позволяют значительно расширить диапазон концентраций белков, в котором возможно корректное количественное сравнение содержания одних и тех же белков в различных образцах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки уровня вариабельности белкового состава ядов моноклевой кобры N. kaouthia нами были проанализированы образцы ядов 6 особей (три самца и три самки) этого вида змей, родившихся и содержащихся в неволе. Для этой цели образцы ядов, после денатурации содержащихся в них белков в присутствии дезоксихолата натрия, восстановления в них дисульфидных связей и карбамидометилирования образовавшихся свободных SH-групп, были подвергнуты триптическому гидролизу, а полученные смеси триптических пептидов анализировали методом хроматомасс-спектрометрии.
В результате инвентаризации белков яда этих 6 особей с использованием LC-MS/MS и поисковой машины Peaks Studio 8.0 (Bioinformatics Solutions Inc., Канада) было идентифицировано в общей сложности 1114 белков. Белок считали достоверно идентифицированным при условии обнаружения для него не менее одного уникального пептида при FDR < 1% (вероятность ложноположительной идентификации). Сравнение списков идентифицированных белков показало, что, на первый взгляд, яды разных особей значительно различаются по составу между собой (см. рис. 1).
Рис. 1.
Распределение идентифицированных белков в образцах яда самок и самцов моноклевой кобры N. kaouthia. (а) Сравнение между индивидуальными образцами яда самок (1–3). (б) Сравнение между индивидуальными образцами яда самцов (1–3). (в) Сравнение между образцами яда самок и самцов.
Учитывая тот факт, что около половины списка белков каждого образца яда было идентифицировано только по одному уникальному пептиду, наблюдаемые различия могут быть объяснены сочетанием двух факторов: низким содержанием подобных белков в образце и стохастической природой отбора ионов в сложных смесях для их последующей фрагментации при тандемной масс-спектрометрии. Подтверждение справедливости такой интерпретации наблюдаемых отличий в белковом составе яда разных особей моноклевой кобры было получено в результате оценки относительного содержания белков, которую проводили с использованием метода iBAQ [8, 9], реализованного в программном пакете MaxQuant [10]. В результате такой оценки было установлено, что несмотря на то, что в каждом образце яда было идентифицировано порядка 500 белков, более 98 мольных % (мол. %) от общего количества этих белков в образце составляет суммарное содержание 35 его мажорных компонентов (см. табл. 1).
Таблица 1.
Некоторые статистические данные протеомного анализа яда 6 особей моноклевой кобры N. kaouthia
| Пол и номер животного | Общее число белков/число белков идентифицированных по 1 уникальному пептиду | Число мажорных белков* | Суммарное содержание мажорных белков яда, мол. % |
|---|---|---|---|
| Самка № 1 | 500/240 | 33 | 99.99 |
| Самка № 2 | 484/252 | 35 | 98.05 |
| Самка № 3 | 595/289 | 37 | 98.06 |
| Самец № 1 | 450/212 | 34 | 98.54 |
| Самец № 2 | 432/209 | 38 | 97.96 |
| Самец № 3 | 488/235 | 34 | 98.12 |
Токсины, идентифицированные при протеомном анализе яда, составляют 15 различных семейств, которые перечислены в табл. 2. Наиболее представленным и разнообразным с молекулярной точки зрения является семейство трехпетельных токсинов, суммарное содержание которых в яде моноклевой кобры превышает 85 мол. %. Представители этого суперсемейства токсинов, несмотря на общую структурную организацию, взаимодействуют с очень широким спектром рецепторов и ионных каналов, вызывая самые разнообразные биологические эффекты [11].
Таблица 2.
Распределение токсинов яда моноклевой кобры Naja kaouthia по семействам и их относительное содержание в образцах яда
| Семейства токсинов | Наименование белка в базе данных UNIPROT | Сокращенное название | riBAQ (мол. %) | |
|---|---|---|---|---|
| среднее | СО* | |||
| Трехпетельные токсины | Three-finger toxin. Cytotoxin | 3FTx | 85.74 | 4.03 |
| Металлопротеиназа змеиного яда | Snake venom metalloproteinase | SVMP | 3.38 | 0.57 |
| Фосфолипаза А2 | Phospholipase A2 | PLA2 | 2.3 | 3.5 |
| Весприн | Vespryn | Vesp | 2.04 | 0.37 |
| Фактор яда кобры | Cobra venom factor | CVF | 1.90 | 0.46 |
| Богатый цистеинами белок яда | Cysteine-rich venom protein | CRVP | 1.18 | 0.35 |
| Фактор роста нервов змеиного яда | Snake venom nerve growth factor | SVNGF | 0.94 | 0.54 |
| Оксидаза L-аминокислот | L-Aminoacid oxidase | LAAO | 0.78 | 0.31 |
| Экто-5-нуклеотидаза | Ecto-5-nucleotidase | E5N | 0.42 | 0.07 |
| Фосфодиэстераза | Phosphodiesterase | PDE | 0.40 | 0.11 |
| Натрийуретической пептид | Natriuretic peptide | NP | 0.13 | 0.25 |
| Сериновая протеаза змеиного яда | Snake venom serine protease | SVSP | 0.10 | 0.03 |
| Гиалуронидаза | Hyaluronidase | Hyal | 0.027 | 0.006 |
| Лектин С-типа | C-Type lectin | CtL | 0.05 | 0.03 |
| Цистатин | Cystatin | Cyst | 0.01 | 0.006 |
В литературе имеются данные протеомного анализа яда моноклевой кобры [12, 13], полученные при анализе объединенных ядов от нескольких особей. В работе Tан и сотр. [13] исследованы яды из нескольких географических регионов. Наиболее представленными токсинами, как и в нашем случае, являются трехпетельные токсины, содержание которых изменяется от 63.5 (яд кобры из Малайзии) до 79.5% (яд кобры из Тайланда). Яд кобры из Вьетнама занимает промежуточное положение – 76.4%. Вторым по представленности токсином во всех ядах является фосфолипаза А2, содержание которой выше (более 10%), чем в нашем случае, и достигает в яде кобры из Малайзии 23.5% [13]. Высокое содержание трехпетельных токсинов характерно также для других видов кобр рода Naja. Так в яде N. atra их содержание составляет 84.3% [14], а в яде N. naja – 63.8% [15].
Разнообразие, относительная представленность и разброс в содержании токсинов этого семейства в образцах яда 6 особей моноклевой кобры N. kaouthia показаны в табл. 3. Наиболее представленными трехпетельными токсинами являются цитотоксины, содержание которых в среднем составляет около 60%. Далее следуют альфа-кобратоксин (12.4%) и слабые токсины (9.7%). Интересно отметить, что относительное содержание различных типов трехпетельных токсинов сильно зависит от географического региона их обитания [13]. Так, в ядах N. kaouthia из Малайзии и Вьетнама наиболее представлены цитотоксины, а в яде из Тайланда – альфа-кобратоксин, содержание которого достигает 33.3% [13]. В образцах исследованных нами ядов не обнаружены альфа-нейротоксины короткого типа, присутствующие в небольших количествах в ядах, исследованных в работе [13].
Таблица 3.
Разнообразие и относительная представленность основных трехпетельных токсинов в яде моноклевой кобры Naja kaouthia
| Наименование белка в базе данных Uniprot | Иденти-фикатор белка (Uniprot) | Содержание белка в образцах яда, мол. % | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| среднее (по всем образцам) | СО (по всем образцам) | среднее (по самцам) | СО (по самцам) | среднее (по самкам) | СО (по самкам) | ||
| Cytotoxin 1 | P60305 | 22.66 | 19.03 | 22.81 | 25.34 | 22.52 | 16.04 |
| Alpha-cobratoxin | P01391 | 12.42 | 39.62 | 12.67 | 11.29 | 12.17 | 62.74 |
| Cytotoxin 3 | P01446 | 9.18 | 48.89 | 10.71 | 13.76 | 7.65 | 83.87 |
| Cytotoxin 3d | Q98962 | 11.47 | 17.91 | 12.32 | 19.72 | 10.63 | 14.91 |
| Tryptophan-containing weak neurotoxin | P82935 | 7.45 | 32.09 | 8.70 | 26.91 | 6.19 | 32.64 |
| Cytotoxin homolog | P14541 | 4.69 | 47.42 | 4.87 | 59.04 | 4.50 | 44.32 |
| Cytotoxin 2 | P01445 | 6.67 | 23.76 | 5.83 | 32.71 | 7.51 | 9.59 |
| Cytotoxin 3a | Q98959 | 4.26 | 52.29 | 4.50 | 10.67 | 4.02 | 86.18 |
| Muscarinic toxin-like protein 1 | P82462 | 2.19 | 58.54 | 2.45 | 61.98 | 1.92 | 65.31 |
| Weak neurotoxin 6 | P29180 | 2.05 | 41.29 | 1.38 | 30.26 | 2.73 | 18.33 |
| Cytotoxin-like basic protein | P62377 | 0.67 | 31.43 | 0.62 | 13.90 | 0.73 | 42.83 |
| Weak neurotoxin 7 | P29181 | 0.18 | 99.26 | 0.30 | 55.50 | 0.05 | 93.37 |
| Cytotoxin 10 | P86541 | 0.19 | 96.82 | 0.13 | 98.18 | 0.26 | 94.80 |
| Muscarinic toxin-like protein 2 | P82463 | 0.66 | 90.12 | 0.58 | 94.59 | 0.74 | 101.42 |
| Cytotoxin sagitoxin | P83345 | 0.09 | 84.94 | 0.08 | 102.77 | 0.10 | 86.74 |
| Muscarinic toxin-like protein 3 | P82464 | 0.34 | 56.09 | 0.33 | 59.54 | 0.35 | 65.12 |
| 3FTx-Pse-78 | R4G319 | 0.21 | 74.41 | 0.12 | 16.87 | 0.29 | 64.51 |
| Cytotoxin 7 | P49122 | 0.13 | 114.15 | 0.06 | 81.00 | 0.21 | 96.29 |
| Cytotoxin 8 | Q91124 | 0.04 | 152.34 | 0.07 | 108.33 | 0.01 | 38.97 |
Анализ относительного содержания в яде моноклевой кобры токсинов различных семейств показал наличие статистически значимых отличий в содержании “фактора роста нервов змеиного яда” и “натрийуретического пептида” между самцами и самками (см. рис. 2).
Рис. 2.
Относительное содержание токсинов различных семейств в образцах яда самок (1) и самцов (2) моноклевой кобры N. kaouthia. По оси абсцисс указаны сокращенные названия семейств токсинов (расшифровку см. табл. 2); non-tox – все белки, не относящиеся к токсинам; f – самки, m – самцы.
Следует отметить, что у большинства видов змей, включая кобр рода Naja, отсутствует половой диморфизм по окраске и внешнему строению. Однако имеются ядовитые змеи с ярко выраженным половым диморфизмом, например, куфии и ботропсы. У этих видов самки крупнее самцов, а у куфий самцы и самки различаются окрасом.
Для выявления половых различий в составе яда были проведены сравнительные исследования состава яда самцов и самок храмовой куфии (Tropidolaemus wagleri) [16] и двух видов ботропсов (Bothrops jararaca и B. moojeni) [17, 18]. При этом обнаружено, что яды обоих полов храмовой куфии имели сравнимую токсичность и хроматографический профиль яда [16]. Это свидетельствует о неизменности состава яда у индивидуальных представителей вида, несмотря на ярко выраженный половой диморфизм. С другой стороны, при исследовании ядов B. jararaca обнаружено, что самки вырабатывали в пять раз больше яда, чем самцы. Электрофоретический анализ выявил у самцов большее количество белков по сравнению с самками. Яды самок обладали большими гиалуронидазной, геморрагической и летальной активностями, а яды самцов – большими коагулянтной, фосфолипазной и миотоксической активностями [18].
Сходные результаты получены при изучении яда B. moojeni с использованием протеомного подхода в комбинации с функциональной, цитотоксической и иммунореактивной характеристикой яда. Установлено, что яд самцов обладал более высокой активностью металлопротеиназы, что подтверждено увеличением экспрессии этого класса ферментов в протеоме. Самки вырабатывали большее количество яда, с более широким спектром компонентов и более сильной цитотоксичностью и антигенным потенциалом. В соответствии с этим яд самок показал более высокие уровни экспрессии ферментов, которые могут способствовать его цитотоксичности и иммунореактивности, таких как LAAO22. Кроме того, протеомный анализ позволил идентифицировать компоненты яда, которые экспрессированы исключительно в яде самцов или самок. Так, только у самцов обнаружены фосфолипаза В, ингибитор фосфолипазы и гиалуронидаза, тогда как только у самок экспрессируется CRVP. Обнаруженные нами различия в составе яда между самцами и самками кобры N. kaouthia не столь существенны, что, по-видимому, отражает отсутствие заметного полового диморфизма у этих змей.
В ходе протеомного анализа ядов мы обнаружили наличие целого ряда посттрансляционных модификаций (ПТМ) токсинов. Список ПТМ, идентифицированных нами в белках всех трех образцов ядов самцов и самок моноклевой кобры, представлен в табл. 4. Всего было выявлено 1960 пептидов с ПТМ. В данной работе мы провели анализ трех типов ПТМ: ацетилирование, фосфорилирование и формилирование. Выявленные локусы вышеназванных модификаций токсинов, а также указания на наличие или отсутствие этих модификаций у самцов и самок моноклевой кобры приведены в табл. 5–7. Обращает на себя внимание большое количество выявленных пептидов с ацетилированными и формилированными N-концевыми аминокислотными остатками, что может говорить о наличии в яде процессированных и модифицированных молекул этих токсинов.
Таблица 4.
Основные ПТМ, выявленные в белках яда моноклевой кобры N. kaouthia
| Тип посттрансляционной модификации | Число пептидов с модификацией | |
|---|---|---|
| яд самцов | яд самок | |
| Дегидратация | 87 | 77 |
| Ацетилирование (N-концевое) | 41 | 40 |
| Дезаминирование (Asn) | 40 | 35 |
| Гидроксилирование | 34 | 31 |
| Формилирование | 31 | 30 |
| Фосфорилирование (Ser, Thr, Tyr) | 23 | 10 |
| 4-Гидроксиноненал | 22 | 23 |
| Пироглутаминовая кислота из Gln | 15 | 11 |
| Ацетилирование (Lys) | 12 | 6 |
| Ацетилирование (N-концевое белка) | 8 | 1 |
| Пироглутаминовая кислота из Glu | 7 | 8 |
| N-Глюкуронилирование | 6 | 6 |
| Амидирование | 5 | 4 |
| Формилирование (N-концевое белка) | 5 | 2 |
| HexNAc (Asn) | 5 | 4 |
| HexNAc (Ser, Thr) | 5 | 4 |
| Карбоксилирование (Asp, Lys, Trp) | 4 | 3 |
| Дезамидирование (Arg) | 4 | 7 |
| Гептоза | 4 | 2 |
| Гексозамин | 4 | 2 |
| Гликозил-L-гидроксипролин | 3 | 1 |
| Фосфопропаргиламин | 3 | 0 |
| Дезаминирование (С- и N-концевое) | 2 | 1 |
| Липоил | 2 | 3 |
| Восстановленный 4-гидроксиноненал | 2 | 1 |
| Убиквитин | 2 | 0 |
| ADP-рибоза | 1 | 0 |
| Дегидратированный 4-гидроксиноненал | 1 | 0 |
| Глицерофосфат | 1 | 0 |
| Hex1HexNAc1 | 1 | 3 |
| HexNAc1dHex1 | 1 | 0 |
| HexNAc2dHex1 | 1 | 2 |
| HexNAc2dHex2 | 1 | 0 |
| Миристоилирование | 1 | 0 |
| Фосфоаденозин | 1 | 1 |
| Фосфогликозил-D-манноза-1-фосфорил | 1 | 0 |
| Фосфогуанозин | 1 | 1 |
| Фосфорилирование пиридилтиола | 1 | 1 |
| Окисление триптофана в кинуренин | 1 | 3 |
| Дезаминирование (N-концевое белка) | 0 | 1 |
| Карбоксилирование (Glu) | 0 | 1 |
| Фукоза | 0 | 1 |
| Hex1HexNAc1NeuAc1 | 0 | 1 |
| Hex1HexNAc1NeuAc2 | 0 | 1 |
| Hex1HexNAc2dHex1 | 0 | 1 |
| Hex | 0 | 1 |
| Hex (Asn, Ser, Tyr) | 0 | 6 |
| N-Ацетилглюкозамин-1-фосфорил | 0 | 1 |
| N-Связанное гликановое ядро | 0 | 2 |
Таблица 5.
Ацетилирование токсинов в 6 образцах яда N. kaouthia
| Идентифи- катор белка (UniProtKB) | Наименование белка в базе данных UniProtKB | Сиквенс пептида и локализация ПТМ* | Наличие (+) или отсутствие (–) модифицированно-го пептида в белке | |
|---|---|---|---|---|
| самцы (1–3)# | самки (1–3)# | |||
| P00598 | Acidic phospholipase A2 1 | C(+42.01)WPYFK | +++ | +++ |
| P00598 | Acidic phospholipase A2 1 | ISGC(+57.02)WPY(+15.99)FK(+42.01)TYSYEC (+57.02)SQGTLTC(+57.02)K | +++ | +++ |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | C(+42.01)C(+57.02)QVHDNC(+57.02)YNEAEK | –++ | +++ |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | C(+42.01)WPYFK | +++ | +++ |
| P60044 | Acidic phospholipase A2 2 | F(+42.01)KNM(+15.99)ISC(+57.02)TVPSRSWWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | +++ | ––+ |
| Q92086 | Acidic phospholipase A2 C | L(+42.01)YQFKNM(+15.99)VQC(+57.02)TVPNRSWWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | +–+ | +++ |
| A4FS04 | Acidic phospholipase A2 natratoxin | SWWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GK (–0.98)(+42.01) | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | C(+57.02)(+42.01)PNGHVC(+57.02)YT(+79.97)KTWC(+57.02)DAFC (+57.02)SIR | +++ | ––– |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | V(+42.01)DIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | D(+42.01)C(+57.02)PNGHVC(+57.02)YTK | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | D(+42.01)C(+57.02)PNGHVC(+57.02)YTKTWC(+57.02)DAFC(+57.02)SIR | +++ | ––– |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | D(+42.01)CPNGHVC(+57.02)YTK | +–– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | R(+42.01)VD(+15.99)LGC(+57.02)AATC(+57.02) PTVK | +++ | +–– |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | T(+42.01)GVD(+14.02)IQC(+57.02)C(+57.02)STDNC(+57.02)NPFPTR | ––– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | T(+42.01)GVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC (+57.02)NPFPTR | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | T(+42.01)GVDIQC(+57.02)CSTDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | T(+42.01)WCDAFC(+57.02)SIR | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | TWC(+57.02)DAFC(+57.02)S(+162.05)IRGK(+42.01)R | ++– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | TWC(+57.02)DAFC(+57.02)S(+42.01)IR | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | C(+57.02)(+42.01)FITPDITSK | ++– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | C(+57.02)FIT(+42.01)PDITSK | +++ | ++– |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | C(+57.02)FITPDITSK(+42.01) | +++ | ++– |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | V(+42.01)D(+57.02)LGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVK(+42.01)TGVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC (+57.02)NPFPTR | ––– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | G(+42.01)VD(+14.02)IQC(+57.02)C(+57.02)STD- NC(+57.02)NPFPTR | –++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | D(+42.01)LGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVKTGVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | +–– |
| B6EWW6 | Aminopeptidase | I(+42.01)PDGLM(+15.99)NQYNQILAIR | +++ | +–– |
| A0A1W7RJE8 | Aminopeptidase | I(+42.01)PDGLM(+15.99)NQYNQILAIR | +++ | ++– |
| P60043 | Basic phospholipase A2 1 | K(+42.01)NM(+15.99)IQC(+57.02)TVPKRSWWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | –++ | +++ |
| Q8UUI0 | Basic phospholipase A2 PC1 | A(+42.01)ALC(+57.02)FAKSPYNNNNYNIDIK | +++ | +++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | Y(+42.01)FKPGM(+15.99)PYELTVYVTNPDGSPAAHVPVVSEAFHSMGTTLSDGTAK | +–+ | +++ |
| Q02454 | Cytotoxin | M(+42.01)FMVATPK | ++– | +++ |
| P01451 | Cytotoxin 1 | L(+42.01)VPIAYK | +++ | –+– |
| P01451 | Cytotoxin 1 | T(+42.01)C(+57.02)PEGK(+42.01)NLC(+57.02) YK(+42.01)MFMMSDLTIPVK | +++ | ++– |
| P01451 | Cytotoxin 1 | T(+42.01)C(+57.02)PEGK(+42.01) | +++ | ++– |
| P01451 | Cytotoxin 1 | T(+42.01)C(+57.02)PEGK(+57.02)NLC(+57.02) YKMFMMSDLTIPVK | +++ | ++– |
| P01451 | Cytotoxin 1 | T(+42.01)C(+57.02)PEGKNLC(+57.02)YK(+42.01) | +++ | –++ |
| A0A0U5AR60 | Cytotoxin 12 | LIPLAYK(+42.01) | +++ | +–– |
| A0A0U4N5W4 | Cytotoxin 13 | C(+42.01)PAGKNLC(+57.02)YKMFMVSNKTVPVK | +–+ | +++ |
| A0A0U4W6K7 | Cytotoxin 16 | LIPLAYKTC(+57.02)AAGK(+42.01)NLC(+57.02)Y | +++ | +–– |
| P79810 | Cytotoxin 1c | LIPIAS(+42.01)K | +++ | –+– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | M(+42.01)FMMSDLTIPVK | +++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | M(+42.01)FMMSDLTIPVKR | ++– | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | MFMMS(+42.01)DLTIPVK | +++ | ++– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | MFMMSDLTIPVK(+42.01)R | –++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | N(+42.01)SLLVK | +++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | LIPIAS(+42.01)K | +++ | –+– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | C(+42.01)PAGKNLC(+57.02)YKMFMMSDLTIPVK | +++ | +++ |
| P60302 | Cytotoxin 3 | C(+57.02)(+42.01)NKLVPLFYK | +++ | –+– |
| P60302 | Cytotoxin 3 | LVPLFYK(+42.01) | +++ | +–– |
| P01446 | Cytotoxin 3 | K(+42.01)(+42.01)C(+57.02)NKLIPLAYK | +++ | –+– |
| P49122 | Cytotoxin 7 | C(+42.01)HNTQLPFIYNTC(+57.02)PEGK | +++ | ––– |
| Q91136 | Cytotoxin I-like T-15 | T(+42.01)C(+57.02)TAGKNLC(+57.02)Y(+79.97)K(+57.02)MFMMSDLTIPVK | +++ | ++– |
| P83345 | Cytotoxin sagitoxin | L(+42.01)VPLAYK | +++ | –+– |
| P60306 | Cytotoxin SP13b | L(+42.01)KPLAYK | –++ | +++ |
| A0A0F7YZM6 | Ecto-5'-nucleotidase 1a | Y(+42.01)DAM(+15.99)ALGNHEFDNGLNGLLDPLLK | +++ | ++– |
| P82942 | Hemorrhagic metalloproteinase-disintegrin-like kaouthiagin | C(+42.01)PTLTNQC(+57.02)IALLGPHFTVSPK | +++ | ––– |
| A0A024BTN9 | L-amino acid oxidase Bs29 | P(+42.01)LEEC(+57.02)FQETDYEEFLEIAR | +++ | +++ |
| A0A024BTN9 | L-amino acid oxidase Bs29 | N(+42.01)PLEEC(+57.02)FQETDYEEFLEIAR | +++ | +++ |
| P01388 | Long neurotoxin 2 | G(+42.01)VNIKC(+57.02)C(+57.02)S(+79.97)TD-NC(+57.02)NPFPTR | ––+ | +++ |
| O42257 | Long neurotoxin 7 | D(+42.01)C(+57.02)PNGHVC(+57.02)YTK | +++ | +++ |
| W8E7D1 | Phosphodiesterase | S(+42.01)M(+15.99)QAIFLAHGPGFK | +++ | +++ |
| F5CPF1 | Phospholipase A2 | P(+42.01)LLDY(+79.97)ADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | +++ | ––+ |
| D5J9R6 | Phospholipase A2 isoform 3 | C(+57.02)(+42.01)QTHDNC(+57.02)YDEAEK | +–+ | +++ |
| T1DJT3 | Protein disulfide-isomerase A6-like protein | L(+42.01)DLFSESAPAPELLEIINEDVLK | ––+ | +++ |
| B0FXL8 | Siamenotoxin I | L(+42.01)EC(+57.02)HDQQSSQTPTTTGC (+57.02)SGGETNC(+57.02)YK | +++ | +++ |
| E2ITZ3 | Three-finger toxin | L(+42.01)EC(+57.02)HNQQSSQTPTTTGC (+57.02)SGGETNC(+57.02)YK | –+– | +++ |
| E2IU01 | Three-finger toxin | V(+42.01)DIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | +++ |
| E2IU01 | Three-finger toxin | T(+42.01)GVD(+14.02)IQC(+57.02)C(+57.02)STDNC(+57.02)NPFPTR | ––– | +++ |
| E2IU01 | Three-finger toxin | R(+42.01)VD(+15.99)LGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVK | +++ | ––+ |
| P82935 | Tryptophan-containing weak neurotoxin | GC(+57.02)ADTC(+57.02)PVGK(+42.01)PYEM(+15.99)IEC(+57.02)C(+57.02)STDK | +++ | ++– |
| P82935 | Tryptophan-containing weak neurotoxin | Y(+42.01)IRGC(+57.02)ADTC(+57.02)PVGK(+42.01)PYEMIEC(+57.02)C(+57.02)STDK | +++ | +–– |
| P82935 | Tryptophan-containing weak neurotoxin | C(+42.01)LNC(+57.02)PEMFC(+57.02)GK | –++ | +++ |
| A0A194ARG1 | Venom factor | Q(+42.01)LDISVHDFPR | +++ | +++ |
| P25679 | Weak toxin CM-9a | L(+42.01)TCLNC(+57.02)PEMFC(+57.02)GK | +++ | –+– |
* ПТМ обозначены цифрами, соответствующими величине уменьшения (–) или увеличения (+) молекулярной массы аминокислотного остатка, находящегося слева от цифры: (–0.98) – амидирование; (+14.02) – метилирование; (+15.99) – окисление; (+42.01) – ацетилирование; (+57.02) – карбамидометилирование; (+79.97)– фосфорилирование; (+162.05) – гексозилирование.
Таблица 6.
Фосфорилирование токсинов в 6 образцах яда N. kaouthia
| Идентифи- катор белка (UniProtKB) | Наименование белка в базе данных UniProtKB | Сиквенс пептида и локализация ПТМ* | Наличие (+) или отсутствие (–) модифицированного пептида в белке | |
|---|---|---|---|---|
| самцы# | самки# | |||
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | T(+438.09)PVDDLDRC(+57.02)C(+57.02)QVHDNC (+57.02)YNEAEK | +++ | –++ |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | PNRS(+242.02)WWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | +++ | ––– |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | SRC(+57.02)WPYFK(+345.05)TYSYEC (+57.02)SQGTLTC(+57.02)K | ––– | +++ |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | LAAICFAGAPY(+790.97)NNNNYNIDLK | +++ | ––– |
| P15445 | Acidic phospholipase A2 2 | LAAIC(+57.02)FAGAPY(+790.97)ND (–18.01)NNYNIDLK | +++ | –++ |
| P60045 | Acidic phospholipase A2 3 | LAAIC(+57.02)FAGAPY(+790.97)N (+0.98)DANYNIDLK | +++ | +++ |
| P60045 | Acidic phospholipase A2 3 | LAAIC(+57.02)FAGAPY(+790.97)NDANYNIDLK | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | TK(+345.05)TWC(+57.02)DAFC (+57.02)SIR | +++ | –+– |
| Q7T1K6 | Cysteine-rich venom protein natrin-1 | KMEWYPEAAS(+121.04)NAERWANTC(+57.02)SLNHSPDNLR | –+– | +++ |
| Q02454 | Cytotoxin | T(+57.02)(+790.97)LKC(+57.02)NKLVPLFYK | +++ | –++ |
| A0A0U4N5W4 | Cytotoxin 13 | T(+57.02)(+790.97)LKC(+57.02)NKLIPLAYK | +++ | ++– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | Y(+930.98)KMFMMSDLTIPVK | +++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | FMMS(+154.00)DLTIPVK | +++ | –++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | LC(+57.02)Y(+122.01)KMFMMSDLTIPVKR | –++ | +++ |
| P60306 | Cytotoxin SP13b | LC(+57.02)Y(+122.01)KMFMMSNKTVPVK | +++ | –++ |
| P82942 | Hemorrhagic metalloproteinase-disintegrin-like kaouthiagin | C(+57.02)DLPELC(+57.02)T(+136.03)GQSAEC(+57.02)PTDSLQR | +++ | –++ |
| A0A024BTN9 | L-amino acid oxidase | NPLEECFQET(+790.97)DYEEFLEIAR | +++ | +++ |
| P25668 | Long neurotoxin 1 | TGVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDDC (+57.02)DPFPT(+117.00)RKRP | +++ | +–+ |
| F5CPF1 | Phospholipase A2 | P(+42.01)LLDY(+790.97)ADYGC (+57.02)YC(+57.02)GR | +++ | ––+ |
| P82935 | Tryptophan-containing weak neurotoxin | T(+329.05)C(+57.02)PVGKPYEMIEC(+57.02)C(+57.02)STDK | +++ | +++ |
| A0A194ARG1 | Venom factor | Q(+0.98)LDIS(+790.97)VHDFPR | +++ | +++ |
| P61898 | Venom nerve growth factor | KNPNPEPS(+770.99)GC(+57.02)RGIDSSHWNSYC(+57.02)TETDTFIK | +++ | ++– |
* ПТМ обозначены цифрами, соответствующими величине уменьшения (–) или увеличения (+) молекулярной массы аминокислотного остатка, находящегося слева от цифры. (–18.01) – дегидратирование; (+0.98) – дезамидирование; (+42.01) – ацетилирование (N-концевое); (+57.02) – карбамидометилирование; (+77.99) – метилфосфонилирование; (+79.97) – фосфорилирование; (+93.98) – метилфосфорилирование; (+117.00) – фосфо-пропаргиламин; (121.04) – фосфорилирование в пиридил тиол; (+122.01) – О-изопропил-фосфорилирование; (136.03) – О-диэтилфосфорилирование; (+154.00) – глицерофосфорилирование; (+242.02) – фосфогликозил-D-манноза-1-фосфорил; (+329.05) – фосфоаденозин; (+345.05) – фосфогуанозин; (+438.09) – O3-(рибофлавинфосфорил).
Таблица 7.
Формилирование токсинов в 6 образцах яда N. kaouthia
| Идентифика-тор белка (UniProtKB) | Наименование белка в базе данных UniProtKB | Сиквенс пептида и локализация ПТМ* | Наличие (+) или отсутствие (–) модифицированного пептида в белке | |
|---|---|---|---|---|
| самцы# | самки# | |||
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | K(+27.99)TYSYEC(+57.02)SQGTLTC (+57.02)K | +++ | +++ |
| P00596 | Acidic phospholipase A2 1 | S(+27.99)WWDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GR | +++ | ++– |
| Q91133 | Acidic phospholipase A2 2 | K(+27.99)TYSYEC(+57.02)SQGTLTC (+57.02)K | +++ | +++ |
| P60045 | Acidic phospholipase A2 3 | S(+57.02)WQDFADYGC(+57.02)YC(+57.02)GK(+27.99) | ++– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | R(+27.99)VDLGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVK | ++– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | TGVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDN (+0.98)C(+57.02)NPFPTRK(+27.99) | –+– | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | TGVDIQC(+57.02)C(+57.02)STDNC (+57.02)NPFPTRK(+27.99) | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | C(+27.99)FITPDITSK | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | K(+27.99)DC(+57.02)PNGHVC(+57.02)YTK | +++ | +++ |
| P01391 | Alpha-cobratoxin | K(+27.99)TGVDIQC(+57.02)C(+57.02) STDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | +++ |
| A0A1Z0YU62 | AncTx1-W28R/I38S | K(+27.99)SIFGVTTEDC(+57.02)PDGQNLC(+57.02)FK | +++ | +–– |
| Q8UUI0 | Basic phospholipase A2 PC1 | AALC(+57.02)FAK(+27.99)SPYNNNNYNIDIK | +++ | –++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)YIQEGDAC(+57.02)K | ++– | +++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)LC(+57.02)DDFAQFSYTLTEFGC(+57.02)PT | +++ | +++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)LDDRVPDTEIETK | +–– | +++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)DLTEEPNSQGISSK | +++ | +–– |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)IIIQGDPVAQIIENSI | +++ | –++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)IIIQGDPVAQIIENSIDGS | +++ | –++ |
| Q91132 | Cobra venom factor | K(+27.99)VYSYYNLDEK | +++ | +–+ |
| Q7T1K6 | Cysteine-rich venom protein natrin-1 | K(+27.99)MEWYPEAASNAER | +++ | +++ |
| Q7T1K6 | Cysteine-rich venom protein natrin-1 | K(+27.99)QSSC(+57.02)QDDWIK | +++ | –++ |
| P01451 | Cytotoxin 1 | T(+57.02)C(+57.02)PEGKNLC(+57.02) YK(+27.99)MFMMSDLTIPVK | ––– | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | M(+27.99)FMMSDLTIPVK | +++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | MFMMSDLTIPVK(+27.99) | +++ | –+– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | MFMMSDLTIPVK(+27.99)R | +++ | +++ |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | K(+27.99)YVC(+57.02)C(+57.02)NTDR | +++ | ++– |
| Q98958-2 | Cytotoxin 1d/1e | K(+27.99)MFMMSDLTIPVK | +++ | +++ |
| A8QL58 | L-amino-acid oxidase | K(+27.99)TC(+57.02)ADIVINDLSLIHDLPK | +++ | +++ |
| P25672 | Long neurotoxin 4 | R(+27.99)VDLGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVK | ++– | +++ |
| P82462 | Muscarinic toxin-like protein 1 | K(+27.99)FLFSETTETC(+57.02)PDGQNVC(+57.02)FNQAHLIYPGK | +++ | +–– |
| P82463 | Muscarinic toxin-like protein 2 | K(+27.99)SIFGVTTEDC(+57.02)PDGQNLC(+57.02)FK | +++ | +–– |
| F8J2F1 | Putative long chain neurotoxin 178R | S(+27.99)WC(+57.02)DAFC(+57.02)SIR | +++ | +–+ |
| A0A0B8RXZ9 | Snake venom 5'-nucleotidase | VQLQNYSSQEIGK(+27.99) | +++ | +–+ |
| P82885 | Thaicobrin | ADVTFDSNTAFESLVVSPDK(+27.99)K | +++ | +++ |
| P82885 | Thaicobrin | K(+27.99)TVENVGVSQVAPDNPER | +++ | +++ |
| E2ITZ3 | Three-finger toxin | GC(+57.02)GC(+57.02)PSVK(+27.99)N (+0.98)GIEINC(+57.02)C(+57.02)TTDR | +++ | +++ |
| E2ITZ3 | Three-finger toxin | LEC(+57.02)HNQQSSQTPTTTGC (+57.02)SGGETNC(+57.02)YKK(+27.99) | +++ | +++ |
| E2IU01 | Three-finger toxin | R(+27.99)VDLGC(+57.02)AATC(+57.02)PTVK | ++– | +++ |
| E2IU01 | Three-finger toxin | K(+27.99)TGVDIQC(+57.02)C(+57.02) STDNC(+57.02)NPFPTR | +++ | –++ |
Следует отметить, что N-ацетилирование является достаточно распространенной ПТМ, которая играет важную роль в различных клеточных процессах [19]. В последнее время стало очевидным значение посттрансляционного N-концевого ацетилирования в модуляции взаимодействия и фолдинга белков [20]. Несмотря на достаточно широкую распространенность этой ПТМ, имеется лишь одна работа, в которой идентифицирован в яде и охарактеризован Nα-ацетилированный токсин [21]. Это – десятичленный пептид, содержащий ацетильный остаток на N-концевой α-аминогруппе и способный блокировать холинорецептор никотинового типа. Обнаруженные нами ацетилированные пептиды свидетельствуют о достаточно большой представленности этой ПТМ в токсинах яда кобры.
N-Формилирование белков является не столь широко распространенной ПТМ, как N-ацетилирование. Однако, в литературе имеются данные о присутствии N-формилированного мелиттина в яде пчелы Apis mellifera [22], но роль такой ПТМ остается не ясной. Фосфорилирование белков представляет собой широко распространенную ПТМ, одной из основных функций которой является изменение биологической активности белка. Ранее фосфорилированные токсины были обнаружены в ядах австралийских элапид [23, 24]. На основании окрашивания электрофоретических гелей флуоресцентным красителем, специфичным для фосфорилированных белков, авторы сделали вывод, что в ядах фосфорилированные белки могут быть представлены изоформами белков, подобных факторам Va и Xa, а также фосфолипазами А2 [23]. Найденные нами фосфорилированные пептиды, соответствующие последовательностям фосфолипаз А2, подтверждают факт фосфорилирования этих токсинов.
Следует отметить, что большинство найденных пептидов, содержащих ПТМ, являются фрагментами трехпетельных токсинов или фосфолипаз А2. Возможно, целью ПТМ этих токсинов является изменение их биологической активности. Интересно, что в ядах самцов присутствует большее число токсинов с ПТМ. Однако, вследствие того, что содержание токсинов с ПТМ существенно ниже, чем немодифицированных, это различие вряд ли имеет существенное значение для функциональной активности яда.
Оценка масштабов и биологической значимости явления посттрансляционной модификации токсинов потребует дополнительных исследований и будет предметом наших последующих исследований.
Таким образом, в ходе исследования были проанализированы образцы яда, полученные от 6 особей моноклевой кобры N. kaouthia, содержавшихся в неволе в одинаковых условиях. Протеомный анализ позволил выявить в каждом из образцов несколько сотен белков. Обнаружена высокая вариабельность состава яда у различных особей. Вместе с тем найдены достоверные различия в количественном содержании фактора роста нервов и натрийуретического пептида в ядах самцов и самок. Этих токсинов содержится больше в яде самок. Кроме того, нами обнаружено большое число токсинов с посттрансляционными модификациями. При этом наибольшее число токсинов с такими модификациями выявлено в трехпетельных токсинах и фосфолипазах А2. В ядах самцов обнаружено большее число токсинов с ПТМ, чем в ядах самок.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы яда
В работе использовали образцы яда, полученные от 6 особей моноклевых кобр N. kaouthia (три самца и три самки). Змей доили ручным массажем желез, полученный яд высушивали над хлористым кальцием и хранили при −20°C.
Восстановление, алкилирование и гидролиз белков трипсином
Навеску высушенного яда растворяли в восстанавливающем и алкилирующем буфере (pH 8.5) так, чтобы финальные концентрации яда, Трис, дезоксихолата натрия (SDC), Трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) и 2-хлорацетамида (CAA) составлялии 1 мг/мл, 100 мМ, 1%, 10 мМ и 40 мМ соответственно. Полученный раствор прогревали при 95°С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли равный объем трипсина (Promega, США) в 100 мМ Трис pH 8.5 в весовом соотношении 1 : 100. После инкубации в течение ночи при 37°С раствор триптических пептидов подкисляли TFA до конечной концентрации 1%, экстрагировали образовавшийся осадок дезоксихолевой кислоты в равный объем этилацетата при интенсивном перемешивании, разделяли этилацетат и водную фазу центрифугированием (15 000 g, 2 мин), этилацетат отбрасывали. Процедуру экстракции повторяли трижды.
Пептиды обессоливали на микроколонках StageTips, как было описано ранее [25, 26], с небольшими модификациями. Микроколонки для обессоливания пептидов изготавливали из наконечников для автоматических пипеток (200 мкл) и мембраны Empore SDB-RPS (3M). Для обессоливания 20 мкг триптического гидролизата использовали 1 микроколонку с двумя кусочками мембраны, вырезанными иглой диаметром 14 G. Пептиды наносили на микроколонку центрифугированием при 200 g в течение ~6 мин, промывали последовательно: 100 мкл 1% TFA, 100 мкл этилацетата, 100 мкл 1% TFA, 100 мкл 0.2% TFA, и элюировали 60 мкл раствора, содержащего 5% гидроксида аммония и 40% ацетонитрила. Элюат высушивали на центрифужном вакуумном испарителе досуха и хранили до хроматомасс-спектрометрического анализа при –85°С.
Хроматомасс-спектрометрический анализ пептидов
Высушенный элюат растворяли в 20 мкл водного раствора, содержащего 2% ацетонитрила и 0.1% TFA, и 3 мкл наносили на колонку (75 мкм × × 25 см) с сорбентом Aeris Peptide XB-C18 2.6 мкм (Phenomenex). Разделение пептидов проводили в хроматографической системе Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific), сопряженной с масс-спектрометром Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) посредством наноэлектроспрейного источника (Thermo Fisher Scientific). Пептиды загружали на термостатируемую при 40°С колонку в буфере А (0.2% муравьиная кислота (FA) в воде) и элюировали с нее линейным (120 мин) градиентом 4–>55% буфера Б (0.1% FA, 19.9% вода, 80% ацетонитрила) при скорости потока 350 нл/мин. После каждого хроматографического разделения колонку промывали 95% буфера Б в течение 5 мин и уравновешивали буфером А в течение 5 мин. Масс-спектрометрические данные сохраняли при автоматическом переключении между MS1-сканированием и вплоть до 15 MS/MS-сканирований (метод topN). Целевое значение для MS1-сканирования было выставлено 3 × 106 в диапазоне 300−1200 m/z с максимальным временем инжектирования ионов 60 мс и разрешением 60 000 при m/z 200. Изолирование ионов-прекурсоров осуществляли при ширине окна 1.4 m/z и фиксированной первой массе 100.0 m/z. Ионы-прекурсоры фрагментировали методом высокоэнергетической диссоциации в ловушке C-trap c нормализованной энергией столкновения 28 эВ. MS/MS-сканы сохраняли c разрешением 15 000 при m/z 200 и при значении 1 × 105 для целевых ионов в диапазоне 200–2000 m/z с максимальным временем инжекции ионов 30 мс.
Анализ хроматомасс-спектрометрических данных
Каталогизацию белков яда и анализ их ПТМ проводили с использованием компьютерной программы PEAKS Studio 8.0 build 20160908 [27]. Первичные структуры пептидов, генерируемые программой PEAKS Studio, анализировали против белковых последовательностей таксономической группы Serpentes (70112 структур), экстрагированных из базы данных UniProtKB (10.2017), со следующими настройками: карбамидометилирование Cys – фиксированная модификация; N‑концевое ацетилирование белков, окисление Met и дезамидирование Asn/Gln – вариабельные модификации; специфичность протеазы – трипсин. Максимальное количество пропущенных сайтов гидролиза трипсином – 3, а также допущение неспецифического расщепления трипсином по N- и C-концам пептида. Допустимый уровень ложноположительных идентификаций (FDR) пептидов был установлен на 0.01 и определялся путем корреляции массива MS/MS-данных с реверсной базой данных белковых последовательностей, которая генерировалась программой PEAKS Studio. Идентификацию пептидов осуществляли при допустимом начальном отклонении массы иона-прекурсора до 10 м.д. и допустимом отклонении массы фрагментов 0.05 Да. При составлении списков структур пептидов, имеющих следующие ПТМ: ацетилирование, фосфорилирование и формилирование, нами учитывались только ПТМ c величиной ASCORE, характеризующей точность локализации ПТМ, большей или равной 25.
Для безметочного MS1-количественного определения белков использовали программное обеспечение MaxQuant (версия 1.5.6.5) [10]. Идентификацию пептидов проводили с использованием поисковой машины Andromeda [28] и базы данных UniProtKB (70112 белков, 10.2017 г.) для таксономической группы Serpentes. Для идентификации пептидов использовали следующие параметры настройки поисковой машины Андромеда: карбамидометилирование Cys – фиксированная модификация; N-концевое ацетилирование белков, окисление Met и дезамидирование Asn/Gln – вариабельные модификации. Уровень ложноположительных результатов (FDR) допускался не более 0.01 как для пептидов, так и для белков, при минимальной длине пептида в 7 а.о., и определяли его с использованием реверсной базы данных. Белки, соответствовавшие реверсной базе данных, отфильтровывали. Идентификацию пептидов осуществляли при допустимом начальном уровне отклонения массы иона-прекурсора 20 м.д. и массы фрагментов – 20 м.д. При идентификации белков в каждом образце использовали библиотеку соотнесения МС- и МС/МС-спектров (match library), в качестве которой использовали хроматомасс-спектрометрические данные анализа триптических гидролизатов всех проанализированных образцов яда.
Для оценки количественного содержания белков использовали встроенный в программу MaxQuant алгоритм iBAQ (intensity based absolute quantification) [8], который складывает интенсивности пиков всех идентифицированных для конкретного белка триптических пептидов и делит полученную сумму на количество теоретически возможных триптических фрагментов этого белка. Для определения относительного содержания белка в образце в мольных процентах, использовалась величина riBAQ [9], представляющая собой величину iBAQ каждого белка, нормализованную на сумму величин iBAQ всех идентифицированных белков.
Список литературы
Chen R.Z., Robinson S.E. // Life Sciences. 1990. V. 47. P. 1949–1954.
Chen Z.X., Zhang H.L., Gu Z.L., Chen B.W., Han R., Reid P.F., Raymond L.N., Qin Z.H. // Acta Pharmacologica Sinica. 2006. V. 27. P. 402–408.
Tsai P.C., Chu C.L., Chiu C.C., Chang L.S., Lin S.R. // Toxicon. 2013. V. 74. P. 56–67.
Gomes A., Bhattacharya S., Chakraborty M., Bhattacharjee P., Mishra R., Gomes A. // Toxicon. 2010. V. 55. P. 670–673.
Bhowmik T., Saha P.P., Dasgupta A., Gomes A. // Cancer Nanotechnology. 2013. V. 4. P. 39–55.
Neilson K.A., Ali N.A., Muralidharan S., Mirzaei M., Mariani M., Assadourian G., Lee A., van Sluyter S.C., Haynes P.A. // Proteomics. 2011. V. 11. P. 535–553.
Cox J., Hein M.Y., Luber C.A., Paron I., Nagaraj N., Mann M. // Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 2014. V. 13. P. 2513–2526.
Schwanhausser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. // Nature. 2011. V. 473. P. 337–342.
Shin J.B., Krey J.F., Hassan A., Metlagel Z., Tauscher A.N., Pagana J.M., Sherman N.E., Jeffery E.D., Spinelli K.J., Zhao H., Wilmarth P.A., Choi D., David L.L., Auer M., Barr-Gillespie P.G. // Nature Neuroscience. 2013. V. 16. P. 365–374.
Cox J., Mann M. // Nature Biotechnology. 2008. V. 26. P. 1367–1372.
Kini R.M., Doley R. // Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 2010. V. 56. P. 855–867.
Laustsen A.H., Gutierrez J.M., Lohse B., Rasmussen A.R., Fernandez J., Milbo C., Lomonte B. // Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 2015. V. 99. P. 23–35.
Tan K.Y., Tan C.H., Fung S.Y., Tan N.H. // Journal of Proteomics. 2015. V. 120. P. 105–125.
Shan L.L., Gao J.F., Zhang Y.X., Shen S.S., He Y., Wang J., Ma X.M., Ji X. // J. Proteomics. 2016. V. 138. P. 83–94.
Dutta S., Chanda A., Kalita B., Islam T., Patra A., Mukherjee A.K. // J. Proteomics. 2017. V. 156. P. 29–39.
Tan C.H., Tan K.Y., Yap M.K., Tan N.H. // Scientific Reports. 2017. V. 7. P. 43237.
Amorim F.G., Costa T.R., Baiwir D., De Pauw E., Quinton L., Sampaio S.V. // Toxins. 2018. V. 10. pii: E177. doi. https://doi.org/10.3390/toxins10050177
Furtado M.F., Travaglia-Cardoso S.R., Rocha M.M. // Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 2006. V. 48. P. 401–410.
Drazic A., Myklebust L.M., Ree R., Arnesen T. // Biochim. et Biophys. Acta. 2016. V. 1864. P. 1372–1401.
Aksnes H., Drazic A., Marie M., Arnesen T. // Trends in Biochemical Sciences. 2016. V. 41. P. 746–760.
Vulfius C.A., Spirova E.N., Serebryakova M.V., Shelukhina I.V., Kudryavtsev D.S., Kryukova E.V., Starkov V.G., Kopylova N.V., Zhmak M.N., Ivanov I.A., Kudryashova K.S., Andreeva T.V., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. // Toxicon. 2016. V. 121. P. 70–76.
Kreil G., Bachmayer H. // Eur. J. Biochem. 1971. V. 20. P. 344–350.
Birrell G.W., Earl S., Masci P.P., de Jersey J., Wallis T.P., Gorman J.J., Lavin M.F. // Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 2006. V. 5. P. 379–389.
Earl S.T., Birrell G.W., Wallis T.P., St Pierre L.D., Masci P.P., de Jersey J., Gorman J.J., Lavin M.F. // Proteomics. 2006. V. 6. P. 6554–6565.
Rappsilber J., Mann M., Ishihama Y. // Nature Protocols. 2007. V. 2. P. 1896–1906.
Geyer P.E., Kulak N.A., Pichler G., Holdt L.M., Teupser D., Mann M. // Cell Systems. 2016. V. 2. P. 185–195.
Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. // Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 2003. V. 17. P. 2337–2342.
Cox J., Mann M. // Annual Review of Biochemistry. 2011. V. 80. P. 273–299.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Биоорганическая химия
Пн.-пт.: 10.00-19.00