Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 3, стр. 288-294

ВВЕДЕНИЕ

Более двух десятилетий назад был синтезирован пептид LKEKKYSP – фрагмент 131–138 интерферона-α₂ (IFN-α₂) человека, способный с высоким сродством связываться с тимоцитами мыши и фибробластами человека [1, 2]. Связывание меченого пептида конкурентно ингибировали IFN-α₂ и тимозин-α₁ (TM-α₁). Сравнение аминокислотных последовательностей пептида и TM-α₁ показало, что они содержат одинаковый пятичленный фрагмент LKEKK, соответствующий последовательностям 16–20 TM-α₁ и 131–135 IFN-α₂. Ранее мы синтезировали пептид LKEKK, пометили его тритием и исследовали рецепцию меченого пептида. Проведенные эксперименты показали, что [³H]LKEKK с высоким сродством связывается с T-лимфоцитами донорской крови [3] и мембранами тонкого кишечника крысы [4]. Связывание меченого пептида конкурентно ингибировали немеченые TM-α₁, IFN-α₂ и B-субъединица холерного токсина (CT-B). Протестированный параллельно пептид с инвертированной последовательностью KKEKL не ингибировал связывание, что свидетельствовало о высокой специфичности рецептора. Обработка клеток протеазами не влияла на связывание, что указывало на небелковую природу рецептора или той его части, которая непосредственно участвует в связывании. На основании этих данных было сделано заключение, что пептид LKEKK,TM-α₁, IFN-α₂ и CT-B имеют общий, по всей видимости, небелковый рецептор. Кроме того, было высказано предположение, что этим рецептором может быть рецептор холерного токсина GM1-ганглиозид [4].

Для проверки этого предположения мы получили ¹²⁵I-меченную CT-B ([¹²⁵I]CT-B) и изучили ее связывание с T- и B-лимфоцитами донорской крови [5, 6], мембранами эпителиальных клеток тонкого кишечника крысы [7], эпителиальными клетками линий IEC-6 крысы и Caco-2 человека [8]. Эксперименты показали, что во всех изученных случаях [¹²⁵I]CT-B с высоким сродством связывалась с небелковым рецептором и ее связывание ингибировали немеченые IFN-α₂,TM-α₁ и пептид LKEKK, но не ингибировал пептид KKEKL. В диапазоне концентраций 10–1000 нМ CT-B и пептид LKEKK дозозависимо увеличивали активность растворимой гуанилатциклазы (sGC), но не влияли на активность мембраносвязанной гуанилатциклазы (mGC) перечисленных типов клеток. Протестированный параллельно пептид KKEKL не влиял на активность sGC. Полученные результаты свидетельствовали о том, что связывание CT-B и пептида LKEKK с общим рецептором на поверхности клетки-мишени приводит к увеличению активности sGC.

Цель настоящей работы – изучение действия CT-B и пептида LKEKK на клетки мышиной макрофагальной линии RAW 264.7.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основные характеристики пептидов (чистота, данные аминокислотного анализа, молекулярная масса) приведены в табл. 1. Удельная активность [¹²⁵I]CT-B составила 98 Ки/моль.

Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях [¹²⁵I]CT-B специфически связывается с клетками линии RAW 264.7. Неспецифическое связывание меченого белка в этих условиях составляло 7.9 ± 0.8% от величины его общего связывания. На рис. 1 приведен график Скэтчарда, характеризующий специфическое связывание [¹²⁵I]CT-B с клетками RAW 264.7. Линейность графика свидетельствует о наличии на клетках одного типа рецепторов к CT-B, а значение K_d = 2.3 ± 0.2 нМ – о высоком сродстве белка к рецептору.

Для характеристики специфичности связывания [¹²⁵I]CT-B с клетками RAW 264.7, в качестве потенциальных конкурентов меченого белка были протестированы немеченые IFN-α₂, TM-α₁, пептиды LKEKK и KKEKL. Приведенные в табл. 2 значения K_i, равные 0.9 ± 0.2, 1.1 ± 0.3 и 1.4 ± 0.3 нМ соответственно, свидетельствуют о высокой ингибирующей способности TM-α₁, IFN-α₂ и пептида LKEKK и об отсутствии таковой у пептида с инвертированной последовательностью KKEKL – K_i > 1 мкМ. Неспособность пептида KKEKL ингибировать связывание указывает на высокую специфичность рецептора.

Следует отметить, что CT-B является перспективным иммуномодулирующим и противовоспалительным агентом. Недавние исследования показали, что белок подавляет иммунопатологические реакции при аллергии и аутоиммунных заболеваниях [9, 10], стимулирует гуморальный иммунитет и индуцирует противовоспалительные реакции in vivo [11, 12]. Поскольку пути передачи сигнала от CT-B внутрь клетки, опосредующие эти эффекты, неизвестны, остается неясным, как один и тот же белок может обеспечивать два противоположных иммунных процесса – предотвращение инфекции и подавление аутоиммунных реакций.

Ранее мы показали, что связывание CT-B и пептида LKEKK с T- и B-лимфоцитами [6] и эпителиальными клетками слизистой оболочки тонкого кишечника [7, 8] приводит к увеличению активности растворимой гуанилатциклазы (sGC), но не влияет на активность аденилатциклазы и мембраносвязанной гуанилатциклазы (pGC). В настоящей работе мы изучили влияние CT-B, пептидов LKEKK и KKEKL не только на активность sGC в клетках RAW 264.7, но и на продукцию ими активатора этого фермента – оксида азота (NO). Эксперименты показали, что в диапазоне концентраций 10–1000 нМ CT-B и пептид LKEKK дозозависимо увеличивают продукцию клетками NO (табл. 3) и активность sGC в них, но не влияют на активность pGC (табл. 4). Протестированный параллельно пептид с инвертированной последовательностью KKEKL был неактивен, что свидетельствует о высокой специфичности действия CT-B и пептида LKEKK. Таким образом, связывание CT-B и пептида LKEKK с общим рецептором на поверхности клеток RAW 264.7 приводит к увеличению продукции NO и активации sGC.

NO – это диффузный мессенджер, опосредующий широкий спектр физиологических и патологических процессов в нервной, сердечнососудистой и иммунной системах [13]. Он выполняет несколько защитных функций: улучшает перфузию тканей, ингибирует агрегацию тромбоцитов [14], снижает адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам [15, 16] и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры [17], способствует сохранению тканевой и органной архитектуры. Помимо регуляции нормальных физиологических функций NO участвует в развитии ряда патологических состояний, таких как септический шок, инсульт и нейродегенеративные заболевания [13, 18, 19]. NO синтезируется из L-аргинина изоформами NO-синтазы (NOS) – индуцибельной (iNOS), эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS) [13, 20].

Показано, что растворимая гуанилатциклаза (sGC) – гетеродимер, состоящий из α- и β-субъединиц, катализирует превращение гуанозин-5'-трифосфата (GTP) в циклический гуанозин-3',5'-мононофосфат (cGMP) и активируется прямым взаимодействием NO с гемом β-субъединицы [21]. Накапливающийся в клетке cGMP передает сигналы к нижестоящим элементам сигнального каскада: cGMP-зависимым протеинкиназам, cGMP-регулируемым катионным каналам и cGMP-активируемым фосфодиэстеразам [21, 22]. Имеются неопровержимые доказательства того, что эффекты низких концентраций NO (~5–50 мкМ) опосредованы cGMP [23, 24]. Полученные нами результаты согласуются с этими данными: возрастание продукции NO с 26 мкМ в контроле до 48 и 45 мкМ в присутствии, соответственно, 100 нМ CT-B или пептида LKEKK (табл. 3) приводило к почти двукратному увеличению активности sGC (табл. 4).

Установлено, что NO увеличивает содержание F-актина в макрофагах и таким образом изменяет их способность к адгезии, образованию псевдоподий и фагоцитозу [25, 26]. Высказано предположение, что ключевыми регуляторами реорганизации актина, приводящей к морфологическим изменениям в NO-стимулированных клетках, может быть cGMP-регулируемый Ca²⁺-кальмодулин [26].

Мы изучили влияние CT-B и пептида LKEKK на адгезию, распластывание и фагоцитарную активность клеток RAW 264.7 in vitro. Известно, что наличие в организме воспаления приводит к усиленной направленной миграции лейкоцитов. Активированные клетки приобретают способность прилипать к сосудистому эндотелию и перемещаться в область инфекции и воспаления, при этом они изменяют свою округлую форму на звездчатую. Поэтому такие свойства фагоцитов как адгезия и распластывание адекватно отражают их функциональный статус. Кроме того, адгезию и распластывание клеток в какой-то мере можно рассматривать как начальные стадии фагоцитоза: прикрепление и обтекание частицы псевдоподиями [27]. Эксперименты показали, что CT-B и пептид LKEKK при концентрации 100 нМ значительно увеличивают способность клеток RAW 264.7 к адгезии и распластыванию in vitro: количество прилипших к пластику клеток было соответственно на 29.4 и 22.6%, а распластанных на 39.7 и 33.2% больше, чем в контроле (P < 0.05).

Для изучения способности CT-B и пептида LKEKK влиять на фагоцитарную активность клеток RAW 264.7 в качестве модельной системы был использован фагоцитоз бактерий вирулентного штамма Salmonell atyphimurium 415 in vitro. В табл. 5 приведены показатели (ФА, ЦПД и ФЧ – см. экспер. ч.), характеризующие фагоцитоз бактерий S. typhimurium 415 клетками RAW 264.7 в контроле и в присутствии CT-B или пептида LKEKK. Результаты контрольных экспериментов показали, что клетки активно поглощают бактерии этого штамма: через 2 ч в фагоцитозе участвовало более половины общего числа клеток (ФА 56.3 ± 5.2%); при этом каждый фагоцит содержал в среднем 7 микроорганизмов (ФЧ 7.0 ± ± 2.2). Однако переваривания поглощенных микробов не происходило. Более того, они продолжали активно размножаться внутри фагоцитов, о чем свидетельствует увеличение ФЧ с 7.0 ± 2.2 до 12.1 ± 3.2 между 2 и 7 ч фагоцитоза. Заражение клеток продолжалось 2 ч, затем среду заражения заменяли средой культивирования, и, начиная с этого момента, увеличение ФЧ могло происходить только за счет размножения ранее поглощенных микробов. Массовая гибель клеток наблюдалась уже к 7 ч фагоцитоза (ЦПД 61.7 ± ± 5.3%), к 12 ч весь монослой был разрушен (ЦПД ~100%). Таким образом, в контроле взаимодействие микробов с клетками RAW 264.7 заканчивалось гибелью последних. В присутствии 100 нМ CT-B или пептида LKEKK картина коренным образом менялась: в обоих случаях достоверно увеличивалась переваривающая способность клеток, размножения сальмонелл внутри клеток не наблюдалось (табл. 5). Полученные результаты свидетельствуют о способности CT-B и пептида LKEKK стимулировать бактерицидную активность клеток RAW 264.7 in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

CT-B, TM-α₁, INF-α₂ и синтетический пептид LKEKK, соответствующий последовательностям 16–20 TM-α₁ и 131–135 IFN-α₂, с высоким сродством связываются с рецептором CT-B на клетках RAW 264.7. Связывание CT-B и пептида LKEKK с рецептором приводит к возрастанию продукции клетками NO, активации внутриклеточной sGC и увеличению фагоцитарной активности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали тимозин-α₁ человека (ImmundiagnostikAG, Германия), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), Tris (Fluka, США), среды для культивирования клеток, фетальную сыворотку теленка и Hepes (“ICN”, США); сахарозу, бычий сывороточный альбумин (БСА), EDTA, EGTA, азид натрия (NaN₃) (Serva, Германия), липополисахарид (LPS) из Escherichia coli серотип 055:B5 (“Sigma”, США), среду для культивирования клеток DMEM (Gibco, США); все остальные реагенты и растворители были отечественного производства и использовались после соответствующей очистки.

Пептиды LKEKK и KKEKL синтезировали на автоматических синтезаторах (модель 430A и VegaCoupler, модель C250; Applied Biosystems, США) с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи и очищали препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф “Gilson”, Франция), колонка WatersSymmetryPrepC18 (19 × 300 мм) (Malva, Греция). Синтезированные пептиды были охарактеризованы данными аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф “Gilson”, Франция; колонка XТerra RP18, Malva, Греция) и аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°C; аминокислотный анализатор 4151 Alpha Plus, LKB, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр “Finnigan”, США). Рекомбинантный интерферон-α₂ был получен из ФГУП “Гос. НИИ ОЧБ” ФМБА (Санкт-Петербург, Россия).

Введение ¹²⁵I в CT-B (20 мкг) проводили по методу Саласински и соавт. [28] с помощью Na¹²⁵I (1 мКи) и Йодогена. Йодированный белок выделяли из реакционной смеси на колонке (0.9 × 10 см) с сефадексом G-25, элюируя 50 мМ фосфатным буфером (pH 7.4) со скоростью 5 мл/ч. Пик выхода ¹²⁵I-меченной CT-B определяли в контрольном опыте с немеченой CT-B. Радиоактивность фракций измеряли с помощью счетчика “Mini-Gamma Counter” (LKB, Швеция). Фракции с максимальной радиоактивностью, позиция которых соответствовала позиции пика немеченого белка в контроле, объединяли и определяли суммарную и удельную активности полученного препарата.

Макрофагальную клеточную линию мыши RAW 264.7 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную сыворотку теленка, при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Клетки (10⁶ клеток/лунка) высевали в 6-луночные планшеты для культивирования клеток (Nunc, Дания). Жизнеспособность клеток оценивали по окрашиванию витальным красителем трипановым синим (выживаемость клеток: 95%).

Реакцию связывания [¹²⁵I]CT-B с клетками RAW 264.7 проводили в соответствии со следующей схемой: клеточную суспензию (10⁶ клеток/мл) инкубировали с меченым белком (10^–11–10^–7 М, три параллельных пробы для каждой концентрации) в 1 мл среды DMEM, содержщей 10 мМ Hepes, 20 мМ NaN₃ и 50 мкМ PMSF, pH 7.4, при 4°C в течение 40 мин. По окончании инкубации реакционную смесь фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/A (Whatman, Англия). Фильтры промывали ледяным физиологическим раствором, содержащим 10 мМ Hepes, pH 7.4 (3 раза по 5 мл). Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью гамма-счетчика Mini-Gamma Counter. Величину специфического связывания [¹²⁵I]CT-B с клетками определяли по разности между ее общим и неспецифическим связыванием, а величину неспецифического связывания [¹²⁵I]CT-B – в присутствии 10^–4 М немеченой CT-B (1000-кратный избыток по отношению к самой большой концентрации меченого белка – 10^–7 М). Для определения равновесной константы диссоциации K_d строили график зависимости отношения молярных концентраций связанной (B) и свободной (F) [¹²⁵I]CT-B от молярной концентрации связанной [¹²⁵I]CT-B (B) [29].

Для оценки способности TM-α₁, IFN-α₂, пептидов LKEKK и KKEKL ингибировать специфическое связывание [¹²⁵I]CT-B с клетками RAW 264.7 суспензию клеток (10⁶ клеток/мл) инкубировали с меченым белком (3 нМ) и одним из потенциальных конкурентов (диапазон концентраций 10^–10–10^–5 М, три повтора для каждой концентрации), как описано выше. Константу ингибирования (K_i) определяли по формуле: K_i = = [IC]₅₀/(1 + [L]/K_d) [30], где [L] – молярная концентрация [¹²⁵I]CT-B; K_d – равновесная константа диссоциации комплекса [¹²⁵I]CT-B – рецептор; [IC]₅₀ – концентрация немеченого лиганда, вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связывания меченого белка. Величину [IC]₅₀ определяли графически на основании кривой ингибирования. Значение K_d измеряли предварительно, как описано выше.

Для определения NO, продуцируемой клетками RAW 264.7, их предварительно инкубировали с LPS (1.0 мкг/мл) в течение 18 ч. В насыщенной кислородом среде NO быстро окисляется до ${\text{NO}}_{2}^{ - }$, поэтому уровень NO оценивали по изменению содержания ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ в среде культивирования. Образцы готовили согласно процедуре [31] и анализировали с использованием хемилюминесцентного метода [32]. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью флуоресцентного спектрофотометра “Hitachi” (Япония) при длинах волн возбуждения и излучения 365 и 450 нм соответственно. Продукцию NO выражали в нмоль ${\text{NO}}_{2}^{ - }$/мл среды. Для оценки достоверности различий между средними значениями в контроле и опыте использовали t-критерий Стьюдента.

Для определения активности растворимой (sGC) и мембраносвязанной (pGC) гуанилатциклазы в RAW 264.7 клетках, активированных LPS (1.0 мкг/мл), их ресуспендировали в 10 мМ Tris-HCl-буферном растворе, pH 7.5, содержащем 1 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитол, 5 мкМ пепстатин A, 50 мкМ PMSF, 10 мкМ ингибитор трипсина из сои и 1 мМ бензамидин. Полученную суспензию (2.5 × 10⁸ клеток/мл) гомогенизировали в ледяной бане и гомогенат центрифугировали при 100 000 g (10 мин, 4°C). Супернатанты отбирали, а осадки ресуспендировали в равных объемах буферного раствора. Супернатанты и ресуспендированные осадки использовали для определения активности sGC и pGC соответственно. Гуанилатциклазную активность определяли путем мониторинга превращения [α-³²P] GTP в [³²P] cGMP и выражали в количестве (нмоль) cGMP, образовавшегося за 10 мин в расчете на 1 мг белка [33]. Продукт выделяли осаждением с карбонатом цинка и хроматографией на колонке с окисью алюминия [34]. Концентрацию белка определяли с помощью метода Лоури, используя в качестве стандарта БСА [35]. Для оценки достоверности различий между средними значениями в контроле и опыте использовали t-критерий Стьюдента.

Для изучения адгезии и распластывания клеток RAW 264.7 их активировали LPS (1.0 мкг/мл) и культивировали в 96-луночном планшете в среде DMEM, содержащей 5% эмбриональную сыворотку теленка, в течение 12 ч в атмосфере 5% CO₂ при 37°C, затем фиксировали метанолом в течение 5 мин и окрашивали красителем Гимза. В камере Горяева подсчитывали число клеток, прилипших к 1 мм² поверхности. Для оценки распластывания использовали окулярную сетку: распластанными считали клетки, у которых продольные размеры превышали поперечные в 3 раза. В каждой лунке просчитывали по 300 клеток.

Для характеристики фагоцитарной активности клеток RAW 264.7, активированных LPS (1.0 мкг/мл), использовали разработанную нами ранее методику изучения фагоцитозаперитонеальными макрофагами мыши бактерий вирулентного штамма S. typhimurium 415 [36, 37]. Сальмонелезную бактериальную культуру выращивали в бульоне Хоттингера при 37°C в течение 6 ч, пересевали на мясопептонный агар и инкубировали при 37°C в течение 18 ч. Монослои клеток RAW 264.7 на покровных стеклах культивировали при 37°C в стерильных стеклянных пробирках со средой DMEM, содержащей стрептомицин и пенициллин (по 100 мкг/мл среды каждый) и инактивированную эмбриональную сыворотку теленка (5%). Спустя 1 сут клетки заражали средой, содержащей сыворотку и бактериальную культуру S. typhimurium 415 в таком количестве, чтобы ее конечное разведение составляло 10⁸ микробных клеток на 1 мл среды. Через 2 ч контакт между клетками и микробами прерывали, заменяя среду заражения средой культивирования, содержащей антибиотики. В дальнейшем для предотвращения повторного захвата микробов, высвобождающихся из разрушенных клеток, через каждый час среду культивирования заменяли свежей. Фиксирование клеток на покровных стеклах проводили через 1, 2, 4, 7 и 12 ч (метанол, 3 мин). Полученные препараты окрашивали 0.1% водным раствором красителя азур II–эозин в течение 5 мин. Под микроскопом при увеличении ×1350 на каждом стекле просматривали по 300 клеток, определяя следующие показатели: фагоцитарную активность (ФА) – процент клеток, участвующих в фагоцитозе; цитопатическое действие бактерий (ЦПД) – процент клеток, разрушенных внутриклеточными бактериями; фагоцитарное число (ФЧ) – среднее количество микробов, приходящееся на одну клетку. Достоверность различий между контролем и опытом оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Рис. 1.

Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания ¹²⁵I-меченной CT-B с клетками линии RAW 264.7. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого белка соответственно.

Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” (грант № III-12, руководитель – член-корр. РАН В.М. Липкин).