Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 3, стр. 295-301

ВВЕДЕНИЕ

β-Адренорецепторы (β-АР) интенсивно изучаются уже более 50 лет и за эти годы в мире опубликованы десятки тысяч работ по этой тематике, причем только за последние 10 лет опубликовано более 7 тысяч работ. Основная причина такого интереса – участие β-АР в патогенезе ряда кардиореспираторных патологий, занимающих в настоящее время лидирующие места в структуре заболеваемости и смертности [1]. Назначение β-агонистов и β-адреноблокаторов, осуществляющих свое действие через β-АР, пациентам с данной сочетанной патологией до сих пор остается не решенным вопросом, ввиду возможного развития побочных эффектов. Специфичность взаимодействия β-агонистов и β-адреноблокаторов с β-АР является одним из важнейших факторов, определяющих возможность их избирательного воздействия на организм, длительность и выраженность действия, в также вероятность возникновения нежелательных побочных реакций. Большое значение имеют индивидуальные реакции конкретного человека на действие β-агонистов и β-адреноблокаторов, что приводит к необходимости персонифицированного подхода при назначении таких препаратов.

Большой вклад в изучение β-АР внесли исследования, проведенные с использованием радиолигандного анализа [2, 3]. С его помощью была получена важнейшая информация о природе и типах адренорецепторов, о характере взаимодействия с различными лигандами – антагонистами и агонистами, а также о содержании различных типов адренорецепторов в органах и тканях [4]. Все эти работы носили исследовательский фундаментальный или прикладной характер, и, хотя в каждой работе декларировалась ее значимость для медицины, в практическом здравоохранении радиолигандные методы анализа не использовались. Среди многочисленных причин такого положения следует выделить две основные: во-первых, при работе в условиях реальной клинической практики для радиолигандного анализа доступна только кровь, а количество адренорецепторов на поверхности клеток крови весьма ограничено. Несмотря на высокую чувствительность радиолигандного метода, определение классических параметров – константы связывания лиганда и количества активных клеточных рецепторов – требует значительного количества крови. Во-вторых, β-адренорецепторная система весьма динамична, идет постоянный обмен информацией между клетками. В результате – количество адренорецепторов на поверхности клеток и константы связывания с лигандами меняются под действием множества различных факторов. Поэтому применение традиционного радиолигандного анализа в условиях реальной клинической практики затруднительно и маловероятно.

Ранее нами был предложен метод оценки рецепторной активности β-1- и β-2-адренорецепторов, основанный на вытеснении из клеточных рецепторов меченного иодом-125 цианопиндолола, неспецифически связывающегося с несколькими типами рецепторов, лигандами с высокой специфичностью к адренорецепторам: СGP-20712 и ICI 118,551 [5]. С помощью этого подхода удалось начать исследования динамики изменений активности β-АР и получить интересные данные о влиянии β-агониста (сальбутамола) на активность β2-АР Т-лимфоцитов человека для здоровых людей и лиц с респираторной патологией [6]. Причем в этих работах была отмечена взаимосвязь β2-АР с другими клиническими и лабораторными параметрами, имеющих доказанное клиническое значение. При этом активность β1-АР лимфоцитов в этих же пробах, определенная нами, была на крайне низком уровне – примерно в 10–20 раз ниже активности β2-АР этих же клеток. Эти данные хорошо согласуются с исследованиями о распределение β1- и β2-АР по органам и тканям [7]. Поэтому наши результаты активности β1-АР Т‑лимфоцитов нами всесторонне не анализировались из-за малодостоверных результатов.

Однако в ходе продолжающихся исследований с Т-лимфоцитами лиц, страдающих сочетанной кардиореспираторной патологией, нами было выявлено, что для некоторых типов кардиологических патологий характерна чрезвычайно высокая активность β1-адренорецепторов Т-лимфоцитов. Это заставило нас вновь вернуться к вопросу о специфичности и достоверной селективности предложенного нами анализа, а также о необходимости разработки модификации метода с целью увеличения достоверности получаемых результатов по активности β1-адренорецепторов Т-лимфоцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение активности β-АР живых клеток – задача достаточно сложная и, несмотря на громадное число публикаций по этой тематике, простого и однозначного метода для решения этой задачи до сих пор нет. Отчасти это связано с неоднозначностью самой задачи и неопределенностью терминологии. Различные авторы под понятием активность β-адренорецепторов подразумевают несколько разные эффекты. Часть авторов считает, что активность АР – это количество лиганда, связавшегося с рецептором в ходе измерения [8]. Этот взгляд радиолигандного подхода соответствует скорее химической точкеи зрения. Часть авторов считает, что активность клеточных рецепторов необходимо определять как биологическую функцию рецептора и более правильным является использование косвенных методов – определение вторичных мессенджеров (cAMP или протеинкиназы А) [9, 10]. Такая точка зрения соответствует медико-биологическим представлениям об измеряемом объекте.

Мы считаем более правильным химический подход, при котором активность клеточных β-АР определяется как специфическое связывание меченого лиганда в определенных стандартизированных условиях [8]. Так как для определения рецепторной активности основным измеряемым параметром является количество связанного с рецептором радиоактивного лиганда, считаем, что для количественной оценки удобнее использовать величину имп./мин на 1 млн клеток. Это позволяет проводить количественные сравнения изменений рецепторной активности как под действием различных внешних факторов, так и в динамике.

Одной из проблем определения активности β-АР клеток с помощью [¹²⁵I]цианопиндолола является специфичность определяемых адренорецепторов. Использование меченных тритием специфических лигандов позволяет решить эту проблему [11]. Однако, чувствительность радиолигандного анализа с тритиевым лигандом примерно в 50 раз уступает чувствительности анализа с использованием [¹²⁵I]цианопиндолола, что является критическим показателем для возможного медицинского применения.

К сожалению, [¹²⁵I]цианопиндолол не обладает высокой специфичностью в отношении разных β-АР. По данным различных авторов константы связывания для β1- и β2-адренорецепторов из разных источников колеблются в диапазоне 7–40 пМ (10^–12 М) [12]. Это привело к идее использовать для селективного определения β1- и β2-адренорецепторов специфические лиганды CGP-20712 и ICI 118,551, впервые опубликованной в 1989 г. [13]. Позднее идея получила развитие, и были получены данные по селективному определению активности β1- и β2-АР для разных типов клеток, в том числе лимфоцитов лошади [14, 15]. Были получены очень интересные результаты о соотношении количества активных β1- и β2-АР на поверхности клеток и определены константы связывания лигандов. Но все эти работы были проведены на объектах, которые могли быть использованы для анализа в значительном количестве. Учитывая крайне ограниченный объем материала, доступный для анализа, который может быть взят у реального пациента (тем более в ходе серийных последовательных исследований), эти методы нельзя было переносить в клиническую практику без серьезной переработки.

Предложенный нами ранее способ определения активности β2-АР Т-лимфоцитов заключался в вытеснении [¹²⁵I]цианопиндолола β2-специфическим лигандом – эритро-(S*,S*)-1-[2,3-(дигидро-7-метил-1H-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)-амино]-2-бутанол гидрохлоридом – более известным в литературе по сокращенному наименованию – ICI 118,551 [16]. Лиганд обладает высокой степенью селективности, аффинность ICI 118,551 к β2 превышает аффинность к β1 в 550 раз [17]. Фактически мы определяли активность клеточных β2-АР как количество [¹²⁵I]цианопиндолола, которое при определенных фиксированных условиях вытесняется специфическим лигандом ICI 118,551.

К сожалению, такой подход сложно использовать для определения активности β1-АР лимфоцитов. Количество β1-АР на поверхности лимфоцитов слишком мало, и специфический β1-лиганд –[дигидрохлорид 2-((3-карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино]-3-[4-(1-метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси]-2-пропанола), более известный как СGP-20712 [18], не мог специфически вытеснять [¹²⁵I]цианопиндолол из β1-АР просто из-за их слишком незначительного количества (см. рис. 1а). Причем специфичность СGP-20712 в отношении β1-АР также очень высокая – аффинность СGP-20712 к β1 превышает аффинность к β2 в 501 раз [17]. Из полученных нами данных по сравнительной активности β1 и β2-АР в одних и тех же образцах для здоровых добровольцев (образцы 1, 2, 3) и пациентов с бронхо-легочной патологией (образцы 4, 5, 6) следует, что активность β1-АР весьма низкая и находится на уровне не превышающим 0.1 фмоль (10^–16 моль) рецепторов на 1 млн Т-лимфоцитов, или примерно 60 рецепторов на клетку.

Рис. 1.

Сравнительная активность β1- (черные столбики) и β2-адренорецепторов (светлые столбики) Т-лимфоцитов. Активность адренорецепторов приведена в имп./мин на млн клеток (Т-лимфоцитов). а – активность адренорецепторов здоровых добровольцев (1, 2, 3) и пациентов с бронхо-легочной патологией (4, 5, 6); б – активность адренорецепторов у пациентов с идиопатической аритмией. Анализ проводился в 3 параллелях, отклонения от средней величины не превышали 10%.

Однако, при определении адренорецепторной активности Т-лимфоцитов у пациентов с идиопатическими нарушениями сердечного ритма оказалось, что у некоторых пациентов активность β1-адренорецепторов существенно выше – на уровне 1–1.5 фмоль на 1 млн клеток, и сопоставима с активностью β2-АР (см. рис. 1б). Эти результаты заставили нас заново проанализировать специфичность и селективность предложенного нами ранее метода определения активности β-АР.

Для верификации специфичности предложенного нами метода мы использовали линии трансфицированных клеток, экспрессирующих β1-АР (ADL-7A) или β2-АР (A2R9). Линия клеток ADL-7A несет рекомбинантный ген β1-АР человека под контролем конститутивного промотора ранних генов цитомегаловируса P_CMV; на поверхности 1 клетки экспонируется более 2 млн активных β1-АР [19]. Линия трансфицированных клеток A2R9 содержит ген β2-адренорецептора с присоединенным на С-конце зеленым флуоресцентным белком EGFP также под контролем P_CMV. На поверхности 1 клетки A2R9 находится не менее 1.5 млн активных β2-АР. Ранее было показано [20], что присоединение зеленого белка к С‑концу практически не меняет их биологические свойства.

Для подтверждения специфичности предложенного метода мы проверили эксперименты по вытеснению меченного [¹²⁵I]цианопиндолола из клеточных рецепторов линии ADL-7A лигандом СGP-20712 в различных концентрациях (см. рис. 2). Аналогичная серия экспериментов по вытеснению меченого [¹²⁵I]цианопиндолола ICI 118,551 в различных концентрациях лигандом была проведена для линии A2R9 (рис. 3).

Рис. 2.

Связывание [¹²⁵I]цианопиндолола клетками ADL-7A в присутствии СGP-20712. В реакционной смеси 6 тыс. клеток ADL-7A. Подробности анализа в разделе “Экспериментальная часть”. Из 100 000 имп./мин на млн клеток максимальное связывание 53390 имп./мин на млн клеток. Анализ проводился в 3 параллелях, отклонения от средней величины не превышали 10%.

Рис. 3.

Связывание [¹²⁵I]цианопиндолола клетками A2R9 в присутствии ICI 118,551. В реакционной смеси 7.5 тыс. клеток A2R9. Подробности анализа в разделе “Экспериментальная часть”. Из 100 000 имп./мин на млн клеток максимальное связывание 55 980 имп./мин на млн  клеток. Анализ проводился в 3 параллелях, отклонения от средней величины не превышали 10%.

Подобные исследования проводились ранее на культурах клеток CHO (культуры клеток яичников китайского хомячка), в которых после соответствующих генно-инженерных трансформаций экспрессировались гены β1- или β2-АР человека [17, 21]. Эти исследования позволили получить данные по специфичности ряда адренорецепторных лигандов и их способности влиять на активность внутриклеточной аденилатциклазы. Правда, к точным количественным оценкам специфичности лигандов следует относиться осторожно, т.к. эти величины зависят от конкретного метода и условий проведения анализа. Например, коэффициент селективности для ICI 118,551, определенный в работе [14] на лимфоцитах лошади, отличается от данных, полученных на культуре клеток.

Следует отметить, что по нашим данным (см. табл. 1) СGP-20712, даже в очень высокой концентрации (0.44 мкМ), практически не вытесняет [¹²⁵I]цианопиндолол из клеточных β2-АР – вытеснение составляет около 3%. Это подтверждает специфичность предложенной нами схемы анализа, т.к. выбранная концентрация СGP-20712 будет оказывать минимальное влияние на связывание радиоактивного лиганда β2-АР Т-лимфоцитов. В то же время лиганд ICI 118,551 в высокой концентрации (0.32 мкМ) частично (около 20%) вытесняет [¹²⁵I]цианопиндолол из клеточных лимфоцитарных β1-АР. Впрочем, для селективного определения активности β1-АР Т-лимфоцитов это искажение количественной оценки не превысит 10% даже для лиц с чрезвычайно высокой (редкой патологической) активностью β1-АР Т-лимфоцитов.

Мы провели модификацию предложенного метода, заключающуюся в изменении порядка прибавления реактивов в инкубационную смесь. Было предложено сначала инкубировать клетки со специфическими лигандами СGP-20712 или ICI 118,551, а затем добавлять меченый цианопиндолол. Результаты этих экспериментов на клетках ADL-7A и A2R9 представлены в табл. 1. Интересно, что предынкубация клеток с СGP-20712 (β1-специфический лиганд) активирует клеточные β1-АР, в то же время предынкубация с ICI 118,551 (β2-специфический лиганд) существенных изменений в активность β2-АР не вносит.

Анализ β-адренорецепторной активности Т-лимфоцитов с предынкубацией

Для проверки этой модифицированной схемы анализа мы использовали несколько образцов Т-лимфоцитов реальных пациентов с сочетанной кардиореспираторной патологией. Сравнительные данные по активности β1- и β2-АР представлены на рис. 4. Следует отметить, что модификация метода не приводит к существенным изменениям активности β2-АР в 3 образцах из 5 (пациенты 1, 4, 5). В то же время для β1-АР изменения в методике дают радикальное увеличение величины активности. При этом не вызывает сомнения тот факт, что фактически незначительная коррекция методики – изменение порядка прибавления реагентов к исследуемым клеткам, приводит к получению новой информации о возможной реакции клеточных β-АР на предынкубацию со специфическим лигандами, что характеризует функциональное состояние рецепторного аппарата. Механизмы наблюдаемого феномена пока не ясны, поэтому необходимо накопление большего количества наблюдений у пациентов с различными кардиореспираторными заболеваниями (и их сочетанием) для их расшифровки и оценки возможного клинического значения получаемых данных.

Рис. 4.

Активность β1-АР (а) и β2-АР (б) Т-лимфоцитов без проведения предынкубации (черные столбики) и с проведением предынкубации (светлые столбики). Активность приведена в имп./мин на млн клеток (Т-лимфоцитов). 1, 2, 3, 4, 5 – реальные пациенты с сочетанной кардиореспираторной патологией. Анализ проводился в 3 параллелях, отклонения от средней величины не превышали 10%.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что предложенный нами способ, основанный на вытеснении меченого [¹²⁵I]цианопиндолола специфическими лигандами СGP-20712 и ICI 118,551, позволяет селективно определять активность как β2- так и β1-АР Т-лимфоцитов человека, а предынкубация с вышеуказанными лигандами позволяет получать дополнительную информацию, характеризующую состояние адренорецепторного аппарата.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали специфические лиганды СGP-20712 и ICI 118,551, а также цианопиндолол фирмы “Sigma” (США). Радиоактивный изотоп Na[¹²⁵I] с молярной активностью более 2000 Ки/ммоль был получен от фирмы В/О “Изотоп”. [¹²⁵I]цианопиндолол синтезировали как описано ранее [5]. Остальные реактивы, использованные в работе, были квалификации не ниже ч. д. а.

Клеточные культуры. Клетки ADL-7A, полученные путем трансфекции родительской линии НЕК293 клеток почки эмбриона человека геном β1-АР ADRB1, были любезно предоставлены Т.Н. Власик (Институт экспериментальной кардиологии НМИЦ кардиологии МЗ РФ, Москва). Клетки A2R9, экспрессирующие β2-АР человека, слитый с зеленым флуоресцентным белком, получены от ООО “МонА”, Москва. Клетки культивировали во флаконах в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мM L-глутамин, 100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина (все реактивы компании “Invitrogen”, США) в атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Для проведения анализа адренорецепторной активности клетки HEK293, ADL-7A и A2R9 снимали с поверхности флаконов обработкой трипсином, реакцию протеолиза останавливали добавлением культуральной среды с 10% FBS, клетки осаждали центрифугированием 15 мин при 1100 об/мин (200 g), дважды промывали PBS при комнатной температуре и суспендировали в растворе PBS c 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich, США). В экспериментах по верификации специфичности суспензии клеток смешивали с таким расчетом, чтобы в пробе для анализа находилось 5 × 10⁵ клеток HEK293, выполняющих функцию носителя, и 2000 клеток ADL-7A или 3500 клеток A2R9. В экспериментах с предынкубацией использовали, соответственно, 3.5 × 10⁵ клеток HEK293, 6000 клеток ADL‑7A и 7500 клеток A2R9.

Проведение радиолигандного анализа β-адренорецепторной активности. Забор периферической крови, выделение Т-лимфоцитов и анализ адренорецепторной активности проводили как описано ранее [5]. Для экспериментов с предынкубацией суспензию клеток разбавляли PBS с 0.1% BSA до концентрации 10 млн/мл и 100 мкл клеточной суспензии инкубировали в течение 30 мин при 37°C с добавлением 10 мкл раствора немеченого лиганда (СGP 20712 или ICI 118,551) при осторожном перемешивании на шейкере со скоростью 100 об./мин. Затем в реакционную смесь добавляли 100 мкл раствора [¹²⁵I]цианопиндолола в PBS с концентрацией 1000 имп./мин/мкл и инкубировали еще 30 мин. Процесс останавливали добавлением в каждую пробу по 400 мкл ледяной воды. Для отмывки от не связавшейся радиоактивности клетки центрифугировали при 2000 g 10 мин, осадок трижды промывали суспендированем в 200 мкл холодного раствора PBS и центрифугированием при тех же условиях, после чего просчитывали на γ-счетчике “Wallac Wizard 1470” (PerkinElmer, США). Все измерения проводили в 3 параллелях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Статья написана в рамках проведения работ по Государственному контракту № 19.001.18.14 от 13 апреля 2018 года ФГБУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России “Анализ распространенности бронхиальной гиперреактивности у спортсменов в циклических видах спорта с персонифицированным обоснованием применения ингаляционных β2-агонистов” (шифр: “Бронх-18”). Авторы выражают благодарность Т.Н. Власик за предоставление клеток ADL‑7A, И.Н. Рыбалкину за предоставление клеток A2R9 и А.Я. Шевелеву за помощь при анализе результатов.