Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 4, стр. 404-411

ВВЕДЕНИЕ

Рецептор врождeнного иммунитета NOD2 задействован во множестве процессов, протекающих в организме, и играет важнейшую роль при поддержании нормального гомеостаза тканей, развитии сердечно-сосудистых патологий (атеросклероза, ишемической болезни сердца) и диабета, инфекционных и онкологических заболеваниях, болезнях нервной системы и т.д [1–3]. Комплексность сигналов, транслируемых NOD2, объясняется наличием у данного рецептора множества партнеров – на сегодняшний день известно более 30 белков, способных непосредственно с ним взаимодействовать и соответственно регулировать его функциональную активность [4].

NOD2 распознает низкомолекулярные фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий, в частности мурамоилдипептид (MDP) [5], а также его дисахаридсодержащий аналог глюкозаминилмурамоилдипептид (GMDP) [6]. При распознавании лиганда рецепторы олигомеризуются и взаимодействуют с адапторным белком RIP2 (от англ. receptor interacting serine/threonine protein kinase 2), что приводит к активации канонических NF-kB и MAPK сигнальных путей [7] и далее к продукции провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов (рис. 1).

Рис. 1.

Cхема сигнальных путей от рецепторов врожденного иммунитета NOD2 и TLR4. Серым цветом и жирным шрифтом показаны молекулы, анализируемые в настоящей работе.

Ранее мы показали, что в распознавание мурамоилпептида GMDP рецептором NOD2 вовлечен фактор транскрипции YB-1 [8, 9], причем YB-1 был способен специфически взаимодействовать как с GMDP, так и с NOD2-белком. При иммунопреципитации антитела к YB-1 реагировали с белковым комплексом, который при анализе методом иммуноблотинга давал четкую полосу продукта с молекулярной массой, соответствующей массе NOD2, распознаваемого также анти-NOD2-антителами. Анти-NOD2-антитела позволяли выявить белок с размером, соответствующим YB-1, реагирующий с анти-YB-1-антителами. Методом конкурентного ИФА со специфичными к YB-1 моноклональными антителами было определено, что белок YB-1 способен в присутствии GMDP формировать комплекс с рекомбинантным фрагментом NOD2-273-1040 (включающим NOD- и LRR-домены); константа диссоциации комплекса составила 4 × 10^–8. С помощью конфокальной микроскопии была продемонстрирована совместная локализация белков NOD2 и YB-1 в клетке.

В работе [10] было обнаружено увеличение синтеза фактора транскрипции YB-1 в стабильно экспрессирующих рецептор NOD2 клетках при стимуляции их MDP. GMDP совместно с рекомбинантным белком YB-1 стимулировал экспрессию мРНК фактора Nf-kB2 (p52) и хемокина Cxcr4 в клеточной линии моноцитов мышей WEHI-3 [8]. Кроме того, добавление экзогенного YB-1 усиливало экспрессию Nf-kb2 в ответ на стимуляцию GMDP в клетках с NOD2-нокдаунами [9], что подтверждает участие YB-1 в NOD2- и MDP/GMDP-зависимом иммунном ответе, но его точная функция и механизм действия остаются до настоящего времени неизвестными.

С целью изучения роли фактора транскрипции YB-1 при формировании сигнала от NOD2-рецептора мы оценивали влияние рекомбинантного белка YB-1 на ответ лейкемических моноцитов человека линии ТНР-1 при стимуляции их GMDP, при этом анализировалось относительное содержание мРНК провоспалительного цитокина IL-1β и ряда молекул, участвующих в активации сигнального пути фактора транскрипции NF-kB. Также были получены клетки линии ТНР-1 с инактивированными генами, кодирующими молекулы NOD2 и YB-1. При анализе клеточного ответа было показано, что фактор транскрипции YB-1 ингибировал индуцированный GMDP иммунный ответ, что хорошо коррелировало с увеличением экспрессии практически всех исследованных молекул в нокаутных по YB-1 клетках.

Так как одной из наиболее хорошо охарактеризованных иммунологических реакций является сильный синергетический эффект между рецепторами NOD2 и TLR4 (лиганд LPS) [11], мы оценивали также влияние YB-1 на ответ, индуцированный при совместном действии GMDP и LPS. Важными адапторными молекулами для семейства TLR, обеспечивающими специфичность формируемого при этом сигнала, являются белки MyD88, TRIF, TRAM и MAL/TIRAM [12] (рис. 1). При активации комплекса MyD88-IRAK (от англ. interleukin-1 receptor-associated kinase) 1-IRAK4 рекрутируется и активируется TRAF6 (от англ. TNFR-associated factor 6). Далее TRAF6 катализирует присоединение полиубиквитиновых цепочек к регуляторной единице IKK (от англ. IκB kinase) комплекса NEMO (от англ. NF-kB essential regulator). Полиубиквитиновые цепочки рекрутируют TAK1 (от англ. TGF-β-activating kinase 1) и связанные с ней белки TAB1, TAB2 и TAB3, что приводит к фосфорилированию и активации IKKα/β-комплекса [13, 14] и последующему высвобождению компонентов NF-kB, которые в виде димеров транслоцируются в ядро и активируют транскрипцию и последующий синтез провоспалительных цитокинов [15].

Как и в предыдущем случае, мы оценивали содержание мРНК IL-1β и ряда молекул сигнальных путей от NOD2- и TLR4-рецепторов в исходных клетках и клетках, нокаутированных по генам NOD2 и YB-1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

YB-1 представляет собой эволюционно консервативный мультифункциональный белок [16, 17], присутствующий как во внутриклеточном, так и внеклеточном пространстве [18], при этом известно, что внеклеточный YB-1 эффективно интернализуется клетками. Важно отметить, что уровень YB-1 повышается при воспалении и очень сильно увеличен у больных с сепсисом [19].

В дополнение к хорошо изученным свойствам YB-1 взаимодействовать с ДНК и РНК, влияя на процессы транскрипции и трансляции, мы показали, что существует ассоциация между YB-1 и рецептором NOD2, и оба компонента комплекса необходимы для нормального развития иммунного ответа [9].

В данной работе на первоначальном этапе мы оценивали влияние рекомбинантного белка YB-1 на индуцированную GMDP экспрессию ряда факторов: мРНК провоспалительного цитокина IL-1β, рецепторов врожденного иммунитета NOD2 и TLR4, соответствующих их адапторных молекул RIP2 и MyD88 и субъединиц р105/р50 (NF-kB1) и р100/р52 (NF-kB2) транскрипционного комплекса NF-kB (см. рис. 1). Клетки линии лейкемических моноцитов человека ТНР-1 стимулировали GMDP в концентрации 10 мкг/мл в присутствии YB-1 (концентрация 1 мкг/мл) и через 2 ч оценивали изменение экспрессии мРНК методом количественного ПЦР-анализа, совмещeнного с обратной транскрипцией. Специфические олигонуклеотиды, используемые для амплификации фрагментов целевых молекул, приведены в табл. 1. Как можно видеть из результатов, приведенных в табл. 2, GMDP стимулировал продукцию IL-1β и белка р100/р52, в то время как YB-1 оказывал выраженный ингибирующий эффект на экспрессию мРНК данных молекул.

Для дальнейшего изучения функции YB-1 были получены клетки с отдельно инактивированными генами NOD2 и YB-1. Для этой цели с использованием плазмид RNAi-Ready pSYREN-RetroQ-TetH (технология Knockout Inducible RNAi Systems, Clontech Laboratories) была проведена стабильная трансфекция клеток ТНР-1. Последовательности олигонуклеотидов, кодирующие специфическую антисмысловую РНК, вводили после PolIII-промотера. Трансфекцию клеток проводили методом электропорации; для селекции клонов клетки культивировали в присутствии гигромицина в концентрации 250 мкг/мл. Ингибирование функции целевых генов NOD2 и YB-1 оценивали по снижению относительного содержания их мРНК методом ПЦР (данные не показаны).

Нокаутные по NOD2 и YB-1 клетки аналогичным образом обрабатывали GMDP; полученные данные приведены на рис. 2. В то время как продукция IL-1β под действием GMDP в клетках с пониженным содержанием NOD2 была ожидаемо снижена, нокаутные по YB-1 клетки демонстрировали повышенный относительный уровень мРНК IL-1β, а также всех остальных проанализированных молекул.

Рис. 2.

Относительные уровни экспрессии мРНК провоспалительного цитокина IL-1β, рецепторов NOD2 и TLR4, адапторных молекул RIP2 и MyD88 и субъединиц р105/р50 и p100/p52 фактора транскрипции NF-kB при стимуляции GMDP в клетках линии ТНР-1 с инактивированными генами NOD2 (koNOD2) и YB-1 (koYB-1).

Известно, что GMDP совместно с LPS-лигандом TLR4-рецептора врожденного иммунитета, при продукции провоспалительных цитокинов проявляют ярко выраженную синергическую реакцию [11], что свидетельствует о взаимосвязи сигнальных путей NOD2- и TLR4-рецепторов, хотя точные механизмы их взаимодействия остаются неизвестными. C использованием клеточной линии макрофагов мыши J774 ранее мы показали, что GMDP и LPS взаимообразно влияют на экспрессию своих рецепторов и их белков-адапторов – RIP2 (NOD2) и MyD88 (TLR4), причем особенно значительными были стимулирующие эффекты LPS при экспрессии NOD2 и GMDP при экспрессии MyD88 [6]. В настоящей работе мы оценивали влияние YB-1 на клеточный ответ, индуцированный через сигнальный путь TLR4-рецептора, т.е. либо LPS, либо комбинацией лигандов GMDP/LPS. Аналогичный выявленному ранее при ответе на GMDP ингибиторный эффект YB-1 демонстрировал практически для всех исследованных молекул и в данном случае (табл. 3).

Подобное же действие мы наблюдали также при анализе методом ИФА концентрации еще одной субъединицы NF-kB – белка р65 (RelA) в ядерной фракции клеток ТНР-1 (табл. 4).

Напротив, из данных, представленных на рис. 3, следует, что стимуляции LPS или GMDP/LPS в обоих типах нокаутных клеток приводит к снижению относительного уровня мРНК IL-1β по сравнению с исходными клетками, т.е. обе молекулы – NOD2 и/или YB-1 необходимы для индукции оптимального иммунного ответа. Важно отметить, что при стимуляции клеток либо только GMDP, либо только LPS, в обоих случаях оказывались задействованными рецепторы TLR4 и NOD2 и фактор транскрипции YB-1, а также адапторные молекулы RIP2 (NOD2) и MyD88 (TLR4).

Рис. 3.

Относительные уровни экспрессии мРНК провоспалительного цитокина IL-1β, рецепторов NOD2 и TLR4, адапторных молекул RIP2 и MyD88 и субъединиц р105/р50 и p100/p52 фактора транскрипции NF-kB при стимуляции LPS и GMDP/LPS в клетках линии ТНР-1 с инактивированными генами NOD2 (koNOD2) и YB-1 (koYB-1).

В целом, полученные результаты показывают, что инактивация YB-1 повышает чувствительность клеток к GMDP и LPS, проявляющуюся в увеличении уровней относительной экспрессии всех проанализированных молекул; единственными исключениями были мРНК p100/p52 при стимуляции LPS и мРНК TLR4 и p100/p52 при стимуляции GMDP/LPS. Таким образом, показано, что фактор транскрипции YB-1 участвует в процессе формирования сигнала от рецепторов врожденного иммунитета и влияет на уровень мРНК как рецепторов NOD2 и TLR4, так и их адапторных молекул RIP2 и MyD88. Мы предполагаем, что белок YB-1 может функционировать как негативный регулятор активности NOD2-рецептора, хотя данный вывод противоречит результатам предыдущей работы [8], где добавление YB-1 стимулировало продукцию фактора Nf-kB2 (p52) и хемокина Cxcr4 в клеточной линии моноцитов мышей WEHI-3; разрешение данного противоречия требует дополнительных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные подтверждают, что фактор транскрипции YB-1 ингибирует активацию синтеза провоспалительного цитокина IL-1β, индуцированную GMDP через NOD2-рецептор и LPS через TLR4-рецептор и связанные с ними молекулы. Но при пониженном уровне экспрессии YB-1 наблюдалось снижение иммунного ответа по сравнению с исходными клетками в ответ на стимуляцию LPS или GMDP/LPS. Конкретные механизмы взаимодействия всех указанных молекул требуют дальнейшего исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. В работе были использованы: GMDP, предоставленный ЗАО “Пептек”; LPS, E. coli Serotype 055:B5, Sigma; рекомбинантный белок YB-1 был экспрессирован в Escherichia coli и очищен как описано ранее в [20].

Клетки. Работа выполнена на клеточной линии лейкемических моноцитов человека ТНР-1, полученной из коллекции Института цитологии РАН, Санкт-Петербург. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной фетальной сыворотки, при 37°С и 5% СО₂.

Для проведения эксперимента клетки вносили в лунки 12-луночного планшета в концентрации 2 × 10⁶ клеток в 3 мл среды на лунку. К клеткам добавляли GMDP в концентрации 10 мкг/мл, и/или LPS в концентрации 0.1 мкг/мл и/или рекомбинантный белок YB-1 в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали клетки в течение 4 ч.

ПЦР. Тотальную РНК из клеток выделяли реагентом TRIzol® (Invitrogen, США) по протоколу фирмы-производителя.

Для синтеза кДНК осуществляли реакцию обратной транскрипции с использованием фермента Mint (Евроген, Россия) и poly(Т)-праймера по стандартному протоколу фирмы-производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере CX96 (BioRad, США). Реакционная смесь объемом 12.5 мкл содержала: 1 мкг кДНК, 2.5 мкл готовой 5-кратной реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия), в которую входят Taq-ДНК-полимеразы со специфическими моноклональными антителами, краситель SYBR Green I, смесь нуклеозидтрифосфатов, MgCl₂, ПЦР-буфер, и по 10 пмоль каждого из двух специфичных олигонуклеотидов.

Протокол амплификации включал: 1 цикл продолжительностью 4 мин денатурации при 94°С, 40 циклов: по 20 с при 94°С для денатурации цепей ДНК, 20 с при 60°С для отжига праймеров с матрицей) и 40 с при 72°С для синтеза комплементарных цепей ДНК, и 1 цикл завершающего синтеза в течение 3 мин при 72°С. Расчет относительного уровня мРНК целевых генов был выполнен с использованием 2^–ΔΔCt-метода [21]. Относительная концентрация субстрата была нормализована по усредненным данным амплификации двух эндогенных генов сравнения — HPRT1 и В2М: deltaCt = Ct(target gene) – Ct(reference gene), где Сt – количество циклов, требуемых для достижения порогового значения флуоресценции. Все реакции проводили в двух повторностях и включали негативный контроль без обратной транскриптазы.

ИФА. Для определения содержания белка р65 клетки вносили в лунки 12-луночного планшета из расчета 1 × 10⁶ клеток/лунку в 1 мл среды. В лунки к клеткам добавляли различные комбинации лигандов, взятых в следующих концентрациях: LPS – 0.1 мкг/мл; GMDP – 10 мкг/мл; рекомбинантный белок YB-1 – 1 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 30 или 45 мин и далее определяли содержание белка р65 методом “сэндвич”-ИФА с помощью набора Imgenex (США) по протоколу фирмы-производителя.

Клетки с инактивированными генами NOD2 и YB-1. Клетки с инактивированными генами, кодирующими белки NOD2 и YB-1, получены с использованием технологии Knockout Inducible RNAi Systems, Clontech Laboratories, которая обеспечивает экспрессию малой интерферирующей РНК (миРНК) и ее эффективную доставку в клетки различных типов [22, 23]. Последовательности олигонуклеотидов, кодирующие специфическую антисмысловую РНК: 5'-GGGTCCTCCACGCAATTAC-3' для YB-1 [8] и 5'-TTGATCTCGCTGCGGTGAA-3' для NOD2 [9], вводили после Pol III-промотора. Полученные плазмиды были использованы для стабильной трансфекции клеток, которую проводили методом электропорации; для селекции клонов клетки культивировали в присутствии 250 мкг/мл гигромицина. Ингибирование функции целевых генов оценивали по снижению относительного содержания их мРНК методом количественного ПЦР-анализа.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта 16-04-01152а.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.