Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 6, стр. 664-672

ВВЕДЕНИЕ

Тритерпеноиды и тритерпеноидные сапонины в течение многих лет являются привлекательными объектами для разработки препаратов для лечения заболеваний печени. Например, глицирризиновая кислота (ГК) в составе препарата “SNМС” используется в Японии для лечения пациентов с хроническим гепатитом и циррозом печени, снижая уровень трансаминаз [1]. 18α-Глицирретовая и олеаноловая кислоты применяются в Китае для лечения заболеваний печени [2, 3]. Препарат “Глицирам” (моноаммонийная соль ГК) обладает гепатозащитным эффектом, восстанавливая метаболическую функцию печени у животных, пораженных CCl₄ [4]. Натриевая соль ГК входит в состав препарата “Фосфоглив”, который более эффективно, чем эссенциале, восстанавливает синтез белка и РНК в клетках печени при циррозе, вызванном действием CCl₄ [4]. Препарат карбеноксолон (динатриевая соль гемисукцинилглицирретовой кислоты) считается одним из лучших средств для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки [5]. Гликозиды корня женьшеня Panax ginseng (гинзенозиды, агликонами которых являются протопанаксадиол, протопанаксатриол ) положительно влияют на регуляцию функций печени (острое и хроническое токсическое поражение печени, гепатит, фиброзирующий гепатит или цирроз, гепатоцеллюлярная карцинома) [6].

К наиболее известным представителям лупановых тритерпеноидов относятся лупеол, бетулин, бетулиновая кислота. Среди даммарановых тритерпеноидов широко известны протопанаксадиол, протопанаксатриол, даммареноловая кислота. Диптерокарпол (20(S)-гидроксидаммар-24-ен) – один из основных метаболитов живицы тропического дерева Dipterocarpus alatus.

Влияние лупановых и даммарановых тритерпеноидов на органы гепатобилиарной системы хорошо известно [7], однако лекарственные препараты на их основе до сих пор не внедрены в практику; на сегодняшний день получили распространение только БАДы отечественного и импортного производства [8]. К соединениям-лидерам по гепатопротекторной активности можно отнести различные ацилаты бетулина, превосходящие активность препаратов сравнения карсила и карбеноксолона [9, 10]. Данные по активности производных даммаранового тритерпеноида диптерокарпола в литературе практически не представлены.

Причинами отсутствия лекарственных препаратов на основе лупановых и даммарановых тритерпеноидов может быть недостаточное количество примеров их синтетических производных с выраженной фармакологической активностью и неэкологичность способов их синтеза и др.

В настоящей работе мы представляем данные по гепатопротекторной активности группы производных бетулина и диптерокарпола, синтез их ацилатов с использованием дициклогексилкарбодиимидного метода.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экологичность и экономичность процессов синтеза лекарственных средств является одним из важных аспектов для фармпромышленности, что достигается сокращением количества стадий (в том числе за счет введения защитных групп, не входящих в состав конечного продукта), использованием нетоксичных растворителей и т.д. [11]. Наиболее распространенный метод получения ацилатов состоит из двух стадий и включает использование “агрессивных” хлорсодержащих реагентов (таких как оксалилхлорид, хлористый тионил, пентахлорид фосфора и др.) на стадии образования хлорангидридов и их последующее взаимодействие со спиртами [12]. Ангидридный метод требует использования сильного органического основания. Ранее хлорангидридным и ангидридным методами получены ацилаты бетулина (бисникотинат, бисизоникотинат, бисгемифталат) с выраженной гепатопротекторной активностью [10, 14, 15].

В настоящей работе мы провели ацилирование бетулина (I) никотиновой и изоникотиновой кислотами в среде СH₂Cl₂ с использованием в качестве дегидратирующего агента дициклогексилкарбодиимида (DCC) и каталитического количества 4-диметиламинопиридина (DMAP). В результате реакций получили 3,28-бисэфиры (II), (III) и 28-монопроизводное (IV) (схема 1 ). Селективность образования ди- и монопроизводного зависела от количества ацилирующего агента, температуры и времени реакции. Так, бисэфиры (II) и (III) получены с использованием 2.5-кратного избытка никотиновой или изоникотиновой кислот при перемешивании реакционной массы при комнатной температуре в течение 24 ч. Использование эквимольного количества изоникотиновой кислоты при 0–5°С и выдерживание в течение 6 ч позволило провести реакцию региоселективно с образованием 28-О-изоникотиноилбетулина (IV), количество минорных соединений (I) и (II), отделяемых перекристаллизацией, не превышало 10%. Таким образом, нами предложен дициклогексилкарбодиимидный экологичный метод получения бисацилатов бетулина (II) и (III), альтернативный описанному ранее [10, 14, 15], а также региоселективный способ получения 28-О-изоникотиноилбетулина (IV).

Схема 1 . Условия. i – никотиновая (для II)/изоникотиновая (для III, IV) кислота; DCC; CH₂Cl₂; DMAP; перемешивание 24 ч, 25°C (для II, III), перемешивание 6 ч, 5°C (для IV).

Вторая группа изученных соединений представляла собой производные диптерокарпола (V), модифицированные по положениям С3 и боковой цепи.

Ранее описанные соединения синтезировали в результате окисления диптерокарпола (V) озоном в среде ацетона [16] и взаимодействием с NH₂OH · · HCl при кипячении в пиридине [17] (рис. 1).

Рис. 1.

Структуры ранее описанных соединений (V)–(VII).

Мы в данной работе синтезировали 3β-O-гемисукцинилдиптерокарпол (IX) с выходом 81% методом, разработанным для получения производных бетулина, который заключался в ацилировании 3β-гидроксидиптерокарпола (VIII) [17] янтарным ангидридом в течении 6 ч в присутствии DCC и DMAP (схема 2 ).

Схема 2 . Условия. i – янтарный ангидрид, DCC, CH₂Cl₂, DMAP, перемешивание 24 ч, 25°C.

Структура синтезированных соединений установлена методом ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР отражали модификацию ацилатов (II)–(IV) по положениям структуры С3 и С28, о чем свидетельствовало изменение химических сдвигов указанных атомов и появление соответствующих сигналов никотиноильных фрагментов. Сигналы пиридинового кольца соединений (II)–(IV) проявлялись при δ 7.25–9.21 м.д. (ЯМР ¹H) и при δ 122.8–153.4 м.д. (ЯМР ¹³C). Сигналы сложноэфирных связей обнаруживались в области δ 165.3–165.8 м.д. (ЯМР ¹³C). Об образовании С28-моноацилата судили по сигналам сложноэфирной связи при δ 165.3 м.д. и сигналу гидроксильной группы С3 при δ 78.0 м.д. В спектрe ЯМР ¹³С соединения (IX) наблюдались характерные сигналы ‒СH₂–CH₂– группы в области δ 29.1 и 29.4 м.д., а сигнал карбоксильной группы – при δ 171.8 м.д.

Задача фармакологических исследований соединений (II)–(IX) состояла в сравнении гепатопротекторной активности ранее изученных ацилатов бетулина (II), (III) [9, 10] с новым соединением – 28-изоникотиноатом бетулина (IV), а также оценить гепатопротекторную активность производных нативного диптерокарпола (V).

Гепатопротекторное действие соединений (II)–(IX) изучали на модели гепатитогепатоза, вызванного внутрибрюшинным введением крысам 50%-го масляного раствора тетрахлорметана. Результаты опытов представлены в табл. 1, 2.

Экспериментально установлено, что трехкратное (один раз в два дня) внутрибрюшинное введение 50%-го масляного раствора тетрахлорметана крысам из расчета 4 мл/кг живой массы тела без дополнительной фармакокоррекции (группа отрицательного контроля) приводит к развитию острого гепатитогепатоза, характеризующегося значительными изменениями морфологического и биохимического состава крови. Так, на седьмой день после первой инъекции тетрахлорметана в крови крыс группы отрицательного контроля отмечено выраженное увеличение уровня органоспецифических маркеров, представленных аланинаминотрансферазой, аспартатаминотрансферазой (АЛТ и АСТ) и щелочной фосфатазой, способных характеризовать цитолиз гепатоцитов [20]. Активность щелочной фосфатазы возросла на 78.37% (с 109.52 ± 2.85 ед./л в первый день до 195.35 ± 17.69 ед./л к седьмому дню исследований). Активность АЛТ и АСТ при этом увеличилась на 216.47 и 107.88% по сравнению с изначальными значениями, составлявшими 55.68 ± 3.01 и 63.74 ± 3.36 ед./л соответственно. Коэффициент де Ритиса [24] понизился до 0.75 ± 0.02 в сравнении с изначальным значением (1.15 ± 0.08), что также указывает на повышение гепато-цитолитических реакций, развивающихся в организме крыс группы “Отрицательный контроль”. Подтверждением гепатотоксического влияния CCl₄ явилось также развитие холестатического синдрома, выразившегося в повышении уровня холестерина (в 2.9 раза) с 2.14 ± 0.08 до 6.22 ± ± 0.08 ммоль/л, и общего билирубина (в 4.69 раз) с 0.39 ± 0.01 до 1.83 ± 0.03 мкмоль/л. Одновременно с этим нами отмечено существенное нарушение глюкогенеза, отразившееся в понижении в 1.6 раза уровня глюкозы в сыворотке крови – с изначальных 8.76 ± 0.46 до 5.43 ммоль/л. Уровень общего белка в сыворотке крови крыс группы “Отрицательный контроль” понизился с 85.58 ± 2.36 до 69.45 ± 2.45 г/л, указывая, совокупно с предыдущими показателями, на нарушение белоксинтезирующей функции печени. Понижение числа эритроцитов с 5.84 ± 0.08 × 10¹²/л до 3.86 ± 0.14 × 10¹²/л, уровня гемоглобина с 112.18 ± 3.17 до 75.65 ± ± 3.72 г/л, а также числа лейкоцитов с 11.01 ± 0.12 × × 10⁹/л до 8.21 ± 0.24 × 10⁹/л, указывает как на ухудшение течения процессов гемопоэза, развивающегося на фоне гепатитогепатозного состояния, так и на явления общетоксического влияния тетрахлорметана, а также понижение осмотической резистентности клеток крови на фоне повышенного уровня общего билирубина.

Согласно полученным данным и с учетом предлагаемой нами фармакокоррекции, наиболее выраженные гепатозащитные свойства были выявлены при лечебно-профилактическом применении соединений (II), (III), (VIII) и препарата сравнения “Карсил” (положительный контроль). При этом выраженность гепатозащитных свойств соединения (II) в дозах 50 и 10 мг/кг, а также соединения (III) во всех испытуемых дозах, оказалась выше этих же свойств препарата “Карсил” в рекомендуемой дозе 25 мг/кг. Выраженность гепатопротекторных свойств соединения (VIII) в дозе 100 мг/кг, соединения (VI) в дозах 50 и 100 мг/кг была в достоверных пределах и сравнима с активностью препарата сравнения “Карсил” в дозе 25 мг/кг, а у остальных соединений гепатопротекторная активность была ниже.

Анализируя выраженность гепатозащитных свойств соединения (II) в дозе 100 мг/кг и соединения (III) в дозе 25 мг/кг, можно отметить, что активность органоспецифических ферментов АЛТ и АСТ, как и их соотношение, выраженное коэффициентом де Ритиса, не выходили за пределы допустимых референтных значений. При этом активность АСТ и АЛТ были соответственно на ~29.48 и ~37.33% ниже в сравнении с активностью этих же ферментов в крови крыс, получавших препарат “Карсил”. Уровень холестерина и билирубина в крови крыс, получавших соединение (II) в дозе 100 мг/кг и соединение (III) в дозе 25 мг/кг было на ~14.00 и ~24.56% ниже в сравнении с их уровнем в крови крыс, получавших препарат сравнения “Карсил” в тех же дозах. Гематологические исследования крови крыс при лечебно-профилактическом воздействии соединения (III) в дозе 25 мг/кг указали на более выраженное улучшение гемопоэза, глюкогенеза и белоксинтезирующей функции печени в сравнении с препаратом “Карсил”. Так, число эритроцитов, лейкоцитов и уровень гемоглобина в крови крыс, получавших соединения (II) в дозе 100 мг/кг и соединение (III) в дозе 25 мг/кг были соответственно на ~7.7, ~7.6 и ~5.3% выше аналогичных показателей в крови крыс положительного контроля и на столько же ниже, с учетом референтных значений, по сравнению со значениями морфологического и биохимического состава крови крыс до начала введения тетрахлорметана.

Активность соединения (II) в дозе 25 мг/кг; соединения (IV) в дозах 25, 50 и 100 мг/кг; соединения (VIII) в дозе 50 мг/кг с учетом анализа результатов морфологического и биохимического состава крови, оказалась на ~9.5–11.0% ниже активности препарата “Карсил” в дозе 25 мг/кг. Отметим, что повышение доз соединений (II), (V) и (VI) с 25 до 50 мг/кг, а также соединения (VIII) с 25 до 100 мг/кг способствует улучшению показателей крови, тем самым, повышая гепатопротекторный эффект. Повышение доз соединений (II), (V) и (VI) с 50 до 100 мг/кг, а также соединения (III) с 25 до 50 мг/кг не приводит к достоверному улучшению гематологических показателей. Морфологический и биохимический состав крови крыс опытных групп, получавших соединения (IV), (VII) и (IX), хотя и были лучше в сравнении с составом крови группы “Отрицательный контроль”, но не достигали значений группы “Положительный контроль” и не показывали положительной или отрицательной динамики при увеличении доз с 25 до 50 и 100 мг/кг.

Таким образом, с использованием дициклогексилкарбодиимидного метода синтезированы ранее описанные в литературе 3,28-бисникотинат и 3,28-бисизоникотинат бетулина, а также новые 28-моноизоникотинат бетулина и 3β-гемисукцинилдиптерокапрол. Показано, что бисацилаты бетулина (II), (III) превосходят по своей активности моноацилат (IV); 3β-гидроксидиптерокарпол (VIII) оказался наиболее активным в ряду изученных производных даммарановых тритерпеноидов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Температуры плавления определяли на микростолике “Boetius”. Оптическое вращение измеряли на поляриметре “Perkin-Elmer 241 MC” (Германия) в трубке длиной 1 дм. ТСХ-анализ проводили на пластинках Сорбфил (ЗАО Сорбполимер, Россия), используя систему растворителей хлороформ–этилацетат, 40 : 1. Вещества обнаруживали 10% раствором серной кислоты с последующим нагреванием при 100–120°С в течение 2–3 мин. Элементный анализ осуществляли на СHNS-анализаторе Eurо EA-3000, основной стандарт ацетанилид. Колоночную хроматографию проводили на Al₂O₃ (Реахим). Спектры ЯМР ²Н, ¹³С (δ, м.д.; J, Гц) зарегистрированы для растворов в CDCl₃ на ЯМР-спектрометре высокого разрешения “Bruker” AvanceIII с рабочей частотой 500.13 МГц (¹H) и 125.47 МГц (¹³C) с использованием 5-мм датчика с Z-градиентом PABBO при постоянной температуре образца 298 K. Химические сдвиги приведены в миллионных долях относительно сигнала внутреннего стандарта тетраметилсилана. Спектры ¹H-, ¹³C-ЯМР соединений получены с использованием оборудования Центра коллективного пользования “Химия” УфИХ УФИЦ РАН.

Бетулин (I) и диптерокарпол (V) выделяли из Betula pendula и Dipterocarpus alatus в соответствии c работами [18, 19]. Соединения (VI) [16], (VII), (VIII) [17] синтезировали, как описано ранее.

Синтез соединений (II), (III) (IX). К раствору 1 ммоль (0.44 г) соединения (I) или (0.42 г) соединения (V) в 20 мл CH₂Cl₂ и 2 ммоль (0.42 г) DCC добавляли 2.6 ммоль (0.36 г) никотиновой кислоты (в синтезе (II)) или 2.5 ммоль (0.36 г) изоникотиновой кислоты (в синтезе (III)), 1.3 ммоль (0.13 г) янтарного ангидрида (в синтезе (IX)) и каталитическое количество DMAP, реакционную массу перемешивали 24 ч при 22°С, отфильтровывали, промывали водой (3 × 20 мл), сушили над MgSO₄, растворитель упаривали в вакууме. Продукт реакции выделяли кристаллизацией из этанола.

3β,28-Ди-О-никотинат бетулина (II). Выход 0.59 г (95%). $[\alpha ]_{D}^{{20}}$ +12° (с 0.1, CHCl₃). Т. пл. 119°C, Т. пл. 116–118°C [14], спектральные характеристики соответствуют [14].

3β,28-Ди-О-изоникотинат бетулина (III). Выход 0.58 г (93%). $[\alpha ]_{D}^{{20}}$ +37° (с 0.1, CHCl₃). Т. пл. 121°C. Т. пл. 119°C [10], спектральные характеристики соответствуют [10].

3β-O-Гемисукцинилдиптерокарпол (IX). Выход 0.43 г (81%). Т. пл. 103–105 °С. $[\alpha ]_{D}^{{20}}$ +35° (c 0.01, CHCl₃). Найдено C 74.58; H 10.15. C₃₄H₅₆O₅. Вычислено C 74.96, H 10.36. (M_r 544.81). Спектр ¹H-ЯМР: 0.82, 0.89, 0.85, 0.95, 1.12, 1.14 (18Н, 6с, 6СН₃), 1.10–1.80 (25Н, м, СН₂, СН), 2.53–2.71 (8H, м, СH, CH₂), 2.67 (4Н, т, ООССН₂СН₂СООН, J 7.2, J 7.5, Н1', H2'), 5.12 (1H, уш.с, Н24). Спектр ¹³С-ЯМР: 15.5, 16.3, 16.5, 17.7, 18.1, 21.6, 22.6, 23.6, 24.8, 25.3, 25.7, 27.5, 27.9, 29.1 и 29.4 (‒СН₂–СН₂–), 31.2, 35.2, 37.0, 37.8, 38.7, 40.4, 40.5, 42.3, 49.8, 50.0, 50.6, 55.9, 64.6, 81.5, 124.7, 128.3, 131.5, 171.8 (СOOH), 177.3 (–О–С=О).

3β-Гидрокси-28-О-изоникотиноиллупа-20(29)-ен (IV). К раствору 1 ммоль (0.44 г) бетулина (I) в 20 мл CH₂Cl₂ и 1 ммоль (0.21 г) DCC добавляли 1.3 ммоль (0.18 г) изоникотиновой кислоты, каталитическое количество DMAP, реакционную массу перемешивали 6 ч при 5°C. Осадок отфильтровывали, органический слой промывали водой (3 × 20 мл), сушили CaCl₂, растворитель упаривали в вакууме. Продукт реакции перекристаллизовывали из EtOH. Выход 0.53 г (90%). Т. пл. 118°C. $[\alpha ]_{D}^{{20}}$ +21° (с 0.1, CHCl₃). Найдено C 77.67; H 8.89; N 2.01. C₃₆H₅₃N₃O. Вычислено C 78.93; H 9.75; N 2.58. (М_r 547.81). Спектр ¹H-ЯМР: 0.80, 0.81, 0.83, 0.97, 1.03 (15Н, 5с, 5СН₃), 1.10–2.00 (26Н, м, СН₂, СН), 1.67 (3Н, с, СН₃), 4.09 и 4.54 (2Н, оба д, J 11.0, Н28), 4.49 (1Н, дд, J 5.4, J 9.6, Н3), 4.58 и 4.69 (2Н, оба уш сигнала, Н29), 7.36 (1Н, дд, J 3.0, J 4.9, H3'), 8.27 (1Н, ддд, J 4.9, J 1.8, J 1.9, Н4'), 8.74 (1Н, дд, J 1.6, J 4.8, Н2'), 9.21 (1Н, д, J 1.7, Н1'). Спектр ¹³C-ЯМР: 14.8, 16.0, 16.1, 16.5, 28.2, 20.8, 21.2, 23.7, 25.2, 27.1, 27.9, 29.6, 29.9, 34.2, 34.6, 37.1, 37.7, 37.8, 38.4, 40.9, 42.8, 46.7, 47.8, 48.9, 50.3, 55.4, 63.8, 78.0, 110.0, 123.2, 126.3, 136.9, 150.9, 153.4, 149.8, 165.3 (–О–С=О).