1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 46, № 1, 2020

Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 1, стр. 106-109

Синтез и оптические свойства нового аналога хромофора белка Kaede

С. О. Зайцева *, Э. Р. Зайцева *, **, А. Ю. Смирнов *, Н. С. Балеева *, М. С. Баранов *, ***

* Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

** Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, Россия, 125047, Москва, Миусская площадь, 9

*** Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, Россия, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Поступила в редакцию 28.08.2019
После доработки 02.09.2019
Принята к публикации 16.09.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Синтезировано новое производное хромофора белка Kaede (Z)-2-(4-метоксибензилиден)-7-фенилимидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-он. Сравнение оптических свойств нового соединения и его известного аналога (5-((Z)-4-метоксибензилиден)-3-метил-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он) показало, что максимумы поглощения и эмиссии нового соединения оказываются смещенными в более длинноволновую область благодаря увеличению сопряженной π-системы имидазолонового фрагмента молекулы.

Ключевые слова: имидазолоны, хромофоры, флуоресцентные красители, зеленый флуоресцентный белок, GFP, Kaede, оптические свойства

Одним из важнейших современных методов исследования биологических объектов является флуоресцентная микроскопия. Активное развитие данного направления требует все возрастающего количества красителей с различными оптическими свойствами. Бензилиденимидазолоны – производные хромофоров многих флуоресцентных белков, в частности зеленых флуоресцентных белков (GFP), – одних из самых распространенных и многочисленных представителей флуоресцентных белковых красителей [1]. Причиной тому являются узкие пики испускания и поглощения, небольшой размер, низкая токсичность, водорастворимость, а также простота синтеза бензилиденимидазолонов и возможность значительно изменить оптические свойства производных варьированием заместителей [2–5]. Известно, что большинство живых объектов поглощают коротковолновое излучение, в малой степени поглощают длинноволновое излучение и почти полностью пропускают инфракрасное. Классические хромофоры GFP требуют для флуоресценции облучения фототоксичным синим или даже ультрафиолетовым светом, что ограничивает применение подобных соединений в биологических исследованиях, а потому актуальной задачей является поиск аналогов хромофора GFP со значительным батохромным сдвигом. Часто этого можно добиться увеличением размера сопряженной π-системы бензилиденимидазолонового остатка молекулы красителя. Например, бензилиденимидазолон со стирольным заместителем во втором положении имидазолонового цикла является хромофором белка Kaede (см. соединение (V), схема 1 ) с заметным батохромным смещением в сравнении с аналогичным хромофором GFP [6]. В частности, ранее в своих работах мы показали, что пиридиновые аналоги хромофора белка Kaede могут использоваться в качестве флуоресцентных меток в биологических объектах [7, 8]. Очевидно, что дальнейшее увеличение сопряженной π-системы приведет к смещению максимумов абсорбции и эмиссии в еще более длинноволновую область.

Схема 1 . Схема синтеза производного (IV).

В данной работе мы решили сравнить оптические свойства классического хромофора белка Kaede с впервые синтезированным соединением (IV) малоизученного типа ауроноподобных красителей (схема 1 ). Известно, что подобные вещества могут быть эффективно использованы для мечения внутриклеточных объектов, а также имеют длинноволновые пики испускания и поглощения [9].

Соединение (IV) было синтезировано в соответствии с литературной методикой [10] получения йодпроизводного (III) с последующим арилированием. Сначала нами из 4-йодопиридин-2-амина был синтезирован этил-(4-иодопиридин-2-ил)глицинат (I), который затем подвергался кислотному гидролизу. Полученное соединение (II) конденсировали с анисовым альдегидом, в результате чего нами было выделено йодпроизводное (III). Затем в результате проведения стандартной реакции Сузуки-Мияуры в результате взаимодействия с фенилбороновой кислотой PhB(OH)2 нами было синтезировано целевое соединение (IV).

Изучение оптических свойств полученного соединения (IV) (рис. 1 , максимумы адсорбции и эмиссии 503 и 559 нм соответственно) в сравнении со свойствами производного (V) (максимумы адсорбции и эмиссии 424 и 540 нм соответственно) показало, что увеличение π-системы имидазолонового фрагмента приводит к значительному батохромному смещению максимумов абсорбции и эмиссии. Хотя cтоксов сдвиг нового соединения оказался ниже, чем у образца сравнения, необходимо отметить, что его возбуждение при использовании в качестве флуоресцентной метки будет требовать более длинноволнового воздействия, которое меньше поглощается биологическими объектами и обладает меньшей фототоксичностью.

Таким образом, нами был получен новый фенилимидазопиридиновый аналог хромофора Kaede. Максимумы абсорбции и эмиссии данного соединения лежат в более длинноволновой области, чем у аналогичного хромофора Kaede (V), за счет создания дополнительных сопряженных π-связей в имидазолоновом фрагменте.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) зарегистрированы на приборе Bruker Avance III (700 МГц, США) при 303 K в DMSO-d6 (внутренний стандарт –Me4Si). Спектры поглощения в УФ и видимом диапазоне регистрировали на спектрофотометре Varian Cary 100 Bio (США); спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse (США). Температуры плавления определены на приборе SMP 30 (Великобритания) и не исправлены. Масс-спектры высокого разрешения записаны на приборе Bruker micrOTOF II, ионизация электрораспылением. Соединение (V) было получено по литературной методике [11].

4-Йодопиридин-2-амин. 2-Аминопиридин (4.7 г, 50 ммоль) растворяли в предварительно охлажденной до комнатной температуры смеси воды (6 мл), ледяной уксусной (120 мл) и концентрированной серной кислот (1 мл). При перемешивании добавляли йод (6 г, 23.6 ммоль) и NaIO4 (1.6 г, 7.5 ммоль). Полученную смесь выдерживали при 80°C в течение 4 ч, после чего добавляли или 200 мл 10% раствора тиосульфата натрия и экстрагировали этилацетатом (3 × 150 мл). Органическую фазу промывали 10% раствором гидроксида натрия (3 × 60 мл) и рассолом (2 × 50 мл), сушили над безводным Na2SO4, упаривали и очищали методом флеш-хроматографии (элюент – хлороформ–этиловый спирт, 50 : 1). Фиолетовый порошок (10.3 г, 94%); 1H-ЯМР: 8.04 (д, J2 2.1, 1H), 7.58 (дд, J2 8.6, 2.2, 1H), 6.35 (д, J2 8.6, 1H), 6.10 (уш.с., 2H).

Этил-N-(4-йодопиридин-2-ил)глицинат (I). 4-Йодопиридин-2-амин (5.50 г, 25 ммоль) растворяли в смеси хлорной кислоты (50%, 12.5 мл), воды (14 мл) и этилового спирта (28 мл), добавили глиоксаль (1.45 г, 25 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 9 ч, за прохождением реакции следили методом ТСХ в системе этилацетат–гексан, 1 : 1. По истечению указанного времени колбу охлаждали ледяной бане до 0°С, нейтрализовали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия до рН 7 и экстрагировали хлороформом (3 × × 100 мл). Экстракт сушили над безводным Na2S-O4, упаривали и очищали методом флеш-хроматографии (элюент – хлороформ). Розовый порошок (1.76 г, 23%); т. пл. 56–59°C; 1H-ЯМР: 8.11 (д, J2 2.1, 1H), 7.63 (дд, J2 8.8, 2.2, 1H), 7.19 (т, J2 6.0, 1H), 6.50 (д, J2 8.8, 1H), 4.07 (к, J2 7.1, 2H), 3.97 (д, J2 6.1, 2H), 1.17 (т, J2 7.1, 3H); 13C-ЯМР: 170.9, 157.1, 152.5, 143.9, 111.5, 76.6, 60.1, 42.4, 14.1; HRMS (ESI), m/z: найдено М, 306.9938; рассчитано для C9H12IN2O$_{2}^{ + }$, [M + H]+ 306.9938.

N-(4-Йодопиридин-2-ил)глицин гидрохлорид (II). Этил (4-иодопиридин-2-ил)глицинат (I) (1.33 г, 4.3 ммоль) растворяли в 8.5 мл 5 М соляной кислоты и кипятили 6 ч. Реакционную смесь упаривали, полученный твердый остаток промывали диэтиловым эфиром (4 × 15 мл) и сушили. Белый порошок (1.02 г, 75%); т. пл. около 165°C с разложением; 1H-ЯМР: 8.16 (с, 1H), 7.95 (д, J2 8.4, 1H), 6.85 (д, J2 9.0, 1H), 4.12 (с, 2H); 13C-ЯМР: 170.2, 153.2, 148.9, 142.7, 114.6, 74.9, 43.4; HRMS (ESI) m/z: найдено М 278.9623; рассчитано для C7H8IN2${\text{O}}_{2}^{ + },$ [M–Cl]+ 278.9625.

Рис. 1.

Спектры поглощения и эмиссии соединений (IV) и (V) в ацетонитриле.

(Z)-7-Йодо-2-(4-метоксибензилиден)имидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-он (III). (4-Йодопиридин-2-ил)глицин гидрохлорид (II) (350 мг, 1.1  ммоль) помещали в колбу Шленка, которую вакуумировали, заполняли аргоном и затем добавляли в нее 2 мл трихлорида фосфора (22.9 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 3 ч, после чего упаривали в вакууме водоструйного насоса. К светло-голубому остатку в токе аргона добавляли анисовый альдегид (0.16 мл, 1.3 ммоль), пиридин (1.6 мл) и триэтиламин (0.45 мл). Реакционную смесь выдерживали при 80°С в течение 3 ч, а затем упаривали. Полученный остаток растворяли в хлороформе (50 мл), промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (20 мл), сушили над безводным Na2SO4 и упаривали. Полученный продукт был очищен флеш-хроматографией (элюент – хлороформ–гексан, 1 : 1). Красный порошок (21 мг, 5%); т. пл. около 260°C с разложением; 1H-ЯМР: 8.29 (д, J2 8.8, 2H), 7.99 (с, 1H), 7.42 (д, J2 9.7 1H), 7.25 (с, 1H), 7.06 (д, J2 8.8, 2H), 6.88 (д, J2 9.7, 1H), 3.84 (с, 3H); 13C-ЯМР: 165.2, 161.4, 153.2, 144.5, 135.8, 134.7, 130.8, 128.4, 127.3, 120.0, 114.5, 72.2, 55.4; HRMS (ESI), m/z: найдено М 378.9933; рассчитано для C15H12IN2${\text{O}}_{2}^{ + },$ [M + H]+ 378.9938.

(Z)-2-(4-Метоксибензилиден)-7-фенилимидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-он (IV). В колбу Шленка насыпали (Z)-7-йодо-2-(4-метоксибензилиден)имидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-он (III; 28 мг, 0.07 ммоль), фенилбороновую кислоту (12 мг, 0.10 ммоль) и карбонат цезия (120 мг, 0.37 ммоль). Колбу вакуумировали, заполнили аргоном, в токе аргона добавляли толуол (2 мл) и Pd(PPh3)4 (9 мг, 0.01 ммоль). Реакционную смесь выдерживали при 75°С 4 ч, затем добавляли хлористый метилен (50 мл) и промывали водой (2 × 80 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na2SO4 и упаривали. Продукт очищали флеш-хроматографией (элюент – хлористый метилен). Красный порошок (12 мг, 52%); т. пл. около 300°C с разложением; 1H-ЯМР: 8.33 (д, J2 8.8, 2H, H2'', H6''), 7.98 (д, J2 0.8 1H, H6), 7.75 (дд, J2 9.6, 1.8, 1H, H9), 7.69 (д, J2 7.2, 2H, H2', H6'), 7.46 (т, J2 7.5, 2H, H3', H5'), 7.38 (т, J2 7.4, 1H, H4'), 7.28 (с, 1H, H7'), 7.15 (дд, J2 9.6, 0.8, 1H, H8'), 7.07 (д, J2 8.8, 2H, H3'', H5''), 3.85 (с, 3H, OCH3); 13C-ЯМР: 166.5 (C4), 161.3 (C4''), 154.3 (C2), 138.0 (C7), 136.7 (C7'), 135.1 (C5), 134.6 (C1'), 129.0 (C2'', C6''), 127.8 (C3', C5'), 127.8 (C2', C6'), 127.4 (C4'), 125.7 (C1''), 122.2 (C9), 122.0 (C6), 118.8 (C8), 114.5 (C3'', C5''), 55.4 (OCH3); HRMS (ESI) m/z: найдено M 329.1284; рассчитано для C21H17N2${\text{O}}_{2}^{ + },$ [M + H]+ 329.1285.

Список литературы

  1. Walker C.L., Lukyanov K.A., Yampolsky I. V, Mishin A.S., Bommarius A.S., Duraj-Thatte A.M., Azizi B., Tolbert L.M., Solntsev K.M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2015. V. 27. P. 64–74.

  2. Ge S., Deng H., Su Y., Zhu X. // RSC Adv. 2017. V. 7. P. 17 980–17 987.

  3. Povarova N.V, Bozhanova N.G., Sarkisyan K.S., Gritcenko R., Baranov M.S., Yampolsky I.V., Lukyanov K.A., Mishin A.S. // J. Mater. Chem. C. 2016. V. 4. P. 3036–3040.

  4. Chen C., Baranov M.S., Zhu L., Baleeva N.S., Smirnov A.Y., Zaitseva S.O., Yampolsky I.V., Solntsev K.M., Fang C. // Chem. Communs. 2019. V. 55 P. 2537–2540.

  5. Feng G., Luo C., Yi H., Yuan L., Lin B., Luo X., Hu X., Wang H., Lei C., Nie Z., Yao S. // Nucl. Acids Res. 2017. V. 45. P. 10380–10392.

  6. Yampolsky I. V, Kislukhin A.A., Amatov T.T., Shcherbo D., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2008. V. 36. P. 96–104.

  7. Baleeva N.S., Myannik K.A., Yampolsky I.V., Baranov M.S. // Eur. J. Org. Chem. 2015. V. 26. P. 5716–5721.

  8. Ermakova Y.G., Sen T., Bogdanova Y.A., Smirnov A.Y., Baleeva N.S., Krylov A.I., Baranov M.S. // J. Phys. Chem. Lett. 2018. V. 9. P. 1958–1963.

  9. Ermakova Y.G., Bogdanova Y.A., Baleeva N.S., Zaitseva S.O., Guglya E.B., Smirnov A.Y., Zagudaylova M.B., Baranov M.S. // Dye. Pigment. 2019. V. 170. P. 107 5550.

  10. Knott E.B. // J. Chem. Soc. 1956. P. 1360–1364.

  11. Muselli M., Colombeau L., Hédouin J., Hoarau C., Bischoff L. // Synlett. 2016. V. 27. P. 2819–2825.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал