Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 3, стр. 261-268

ВВЕДЕНИЕ

Мультиспецифические антитела на основе вариабельных доменов неканонических антител мозоленогих, так называемых наноантител (VHH), имеют большой потенциал в качестве диагностических и терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной природы. Специфичность антител по отношению к двум и более типам молекул позволяет точно локализовать терапевтическую мишень, тем самым повысить эффективность борьбы с резистентными или быстро мутирующими штаммами вирусов, например, вирусом гриппа [1]. Кроме того, обеспечивая направленное связывание целевой молекулы (например, опухолевого маркера) и эффекторной клетки, можно повысить эффективность терапии онкологических заболеваний за счет активации механизмов клеточного лизиса [2]. Структура наноантител открывает широкие возможности для их форматирования путем слияния как идентичных, так и различных мономерных блоков для увеличения авидности или же сопутствующей блокировки нескольких неперекрывающихся эпитопов [3]. Это позволяет увеличить эффективность мультивалентных комплексов по сравнению с моновалентными наноантителами [4, 5]. Так, например, перспективными для терапии аутоиммунных заболеваний могут быть биспецифические наноантитела, одновременно связывающие два различных провоспалительных цитокина, например, TNF и IL‑17 [6] или IL-1 и IL-17A [7], что усиливает терапевтический эффект по сравнению с антителами против одного цитокина.

Помимо цитокинов мишенью для второй специфичности в составе мультиспецифичных конструкций могут быть различные рецепторы на клетках, участвующих в развитии воспалительного процесса [8], например, поверхностные молекулы клеток, обеспечивающих максимальный вклад в усиление воспалительного ответа в ходе развития того или иного заболевания. Ранее было показано, что основным источником провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF) в модели аутоиммунного артрита являются миелоидные клетки, при этом подавление Т-клеточного TNF приводило к усугублению заболевания. Плейотропные свойства данного цитокина, обеспечивающие как защитное, так и “патогенное” воздействие на функции организма, легли в основу концепции о необходимости селективной нейтрализации TNF [9–11]. На ее основе были разработаны биспецифические антитела, позволяющие селективно нейтрализовать TNF из определенных клеточных источников, не препятствуя при этом реализации защитных функций данного цитокина, тем самым, увеличивая эффективность анти-TNF-терапии. Так, созданные на основе наноантител биспецифические агенты, связывающие и блокирующие человеческий TNF на поверхности миелоидных клеток за счет взаимодействия с маркерной молекулой F4/80, показали высокую эффективность на культуре макрофагов in vitro и в модели острого септического шока in vivo на гуманизированных по гену TNF мышах [12]. Однако перенос данной модели на человека осложнен тем фактом, что человеческий ортолог F4/80 (EMR1) экспрессируется не только моноцитами/макрофагами, но в большей степени гранулоцитарными клетками [13]. Поэтому важной задачей для создания новых биспецифических антител является поиск дополнительных молекул-мишеней на миелоидных клетках. В качестве одной из таких молекул-мишеней была рассмотрена молекула CD11b [14], ортолог которой (Mac-1) характерен для популяции моноцитов/макрофагов человека и не продуцируется эозинофилами. Однако ранее полученные анти-TNF антитела, способные связываться с молекулой CD11b, обладали более низкой эффективностью нейтрализации TNF по сравнению с анти-F4/80 VHH-содержащими белками [15], поэтому для увеличения эффективности биспецифических антител в настоящей статье мы рассмотрели возможность введения в их доменный состав дополнительного TNF-узнающего модуля (Vhh41), связывающего TNF с высокой аффинностью [16]. Таким образом, нами были созданы и изучены трехдоменные антитела, обладающие специфичностью в отношении TNF за счет наличия двух различных анти-TNF VHH-доменов: ahTNFVHH [4] и Vhh41 [16], а также в отношении поверхностных маркеров миелоидных клеток F4/80 и CD11b за счет наличия aF4/80 VHH, либо aCD11bVHH доменов соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе работы были сконструированы генетические конструкции для продукции трехдоменных антител TFV и TCV в бактериальной системе, структура которых схематически представлена на рис. 1. Дизайн генетических конструкций и получение белков подробно описаны в разделе “Экспериментальная часть”. Анализ гомогенности полученных белков проводили с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ (рис. 2а, 2б) и вестерн-блоттинга (рис. 2в).

Рис. 1.

Схема доменного состава биспецифических белков ahTNFVHH–aF4/80VHH–Vhh41 (TFV) и ahTNFVHH–aCD11bVHH–Vhh41 (TCV).

Рис. 2.

Примеры типичной электрофореграммы (SDS-ПААГ) и вестерн-блоттинга трехдоменных антител: М – маркер молекулярных масс (Page Ruler Unstained Protein Ladder, кат. № 26614, Thermo Fisher Scientific). а – образцы с разных стадий очистки белков на примере TFV методом металл-хелатной аффинной хроматографии: 1 – лизат клеток, 2 – фракция не связавшихся в ходе хроматографии белков, 3 – элюируемый белок TFV. б – образцы очищенных белков TCV (дорожка 1) и TFV (дорожка 2). в – вестерн блоттинг образцов белков TFV (дорожка 1) и TCV (дорожка 2).

Эффективность связывания полученных трехдоменных антител с молекулами F4/80 и CD11b на поверхности макрофагов оценивали с помощью метода проточной цитофлуориметрии. В эксперименте использовали макрофаги, полученные из костного мозга гуманизированных по гену TNF мышей, у которых человеческий TNF (hTNF) продуцируется вместо мышиного. В ходе эксперимента анализировали уровень флуоресцентного сигнала от макрофагов, проинкубированных с трех- или с аналогичными им двухдоменными белками, затем с рекомбинантным hTNF, и, наконец, с детектирующими флуоресцентно-меченными антителами к hTNF. Интенсивность флуоресцентного сигнала была пропорциональна количеству макрофагов, связанных с белками-блокаторами. Таким образом, уровень сигнала косвенно характеризовал эффективность связывания белков с ФНО и поверхностными белками на макрофагах. Было показано, что введение дополнительного модуля способствует повышению эффективности взаимодействия антител TFV и TCV с макрофагами по сравнению с MYSTI-2 и MYSTI-3, в 10 и 6 раз соответственно (рис. 3).

Рис. 3.

Эффективность связывания биспецифических белков-блокаторов TNF с макрофагами гуманизированных по гену TNF (huTNFKI) мышей. Уровень флуоресцентного сигнала пропорционален количеству связавшихся с клетками анализируемых белков. Cравнительный анализ флуоресценции клеток, инкубированных с: TFV или MYSTI-2 (а), TCV или MYSTI-3 (б). К – уровень автофлуоресцентного сигнала от клеток, обработанных мечеными PE-антителами против человеческого TNF.

Способность трехдоменных антител удерживать на поверхности мышиных макрофагов продуцируемый ими TNF оценивали, анализируя количество свободного TNF в культуральной среде клеток методом иммуноферментного анализа. Эффективность удержания цитокина связанными с клетками биспецифическими антителами в данном эксперименте обратно пропорциональна его уровню в супернатанте (рис. 4). В случае контрольных образцов (культуральной среды макрофагов без добавления биспецифических антител) при инкубации с липополисахаридом происходило резкое увеличение концентрации TNF в среде (рис. 4). Для всех исследуемых белков наблюдался более низкий уровень TNF по сравнению с контролем, причем количество TNF в среде повышалось с понижением концентрации биспецифических белков (рис. 4б). Кроме того, трехдоменные блокаторы TNF оказались способны удерживать этот цитокин на поверхности макрофагов с эффективностью, сравнимой с эффективностью двухдоменного белка MYSTI-2 и превышающей эффективность белка MYSTI-3.

Рис. 4.

Сравнение количества свободного TNF в культуральной среде макрофагов, проинкубированных с 1 мкМ (а) и 0.25 мкМ (б) биспецифических белков и липополисахаридом. На диаграмме представлены средние значения со стандартными отклонениями. * ‒ статистически значимые отличия (p < 0.05), n.s. ‒ статистически не значимые отличия.

Биологическую активность белков in vitro исследовали в ходе цитотоксического (МТТ) теста на клетках линии WEHI-164 (рис. 5). Наиболее показательными характеристиками биологической активности в данном эксперименте являются значения IC₅₀, которые для белков MYSTI-3 и TCV составили: 3.451 и 0.536 нМ, а для MYSTI-2 и TFV – 4.5 и 21.9 нМ соответственно. Таким образом, эффективность трехдоменного белка, содержащего aCD11b VHH-домен, оказалась выше эффективности его двухдоменного аналога.

Рис. 5.

Графики зависимости выживаемости клеток WEHI-164 от концентрации биспецифических антител, нейтрализующих действие экзогенного TNF в ходе цитотоксического (МТТ) теста. Сравнительный анализ TNF-нейтрализующей активности белков TFV и MYSTI-2 (а), а также белков TCV и MYSTI-3 (б).

Таким образом, введение дополнительного TNF-узнающего модуля (Vhh41) в доменный состав биспецифических белков позволило существенно увеличить эффективность удержания фактора некроза опухоли на поверхности макрофагов гуманизированных мышей, и, кроме того, в составе anti-CD11b VHH-содержащего антитела увеличило TNF-нейтрализующий потенциал мультиспецифической конструкции по сравнению с его двухдоменным аналогом MYSTI-3 в тестах in vitro.

В целом, результаты исследования показали, что идея конструирования биспецифических антител с увеличенным количеством TNF-связывающих участков является перспективной: эта особенность трехдоменных антител впоследствии может быть использована для создания прототипов лекарств для терапии воспалительных заболеваний, связанных с гиперэкспрессией данного цитокина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Штамм DH5α E. coli с генотипом F^– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(${\text{r}}_{{\text{K}}}^{ - },\,\,{\text{m}}_{{\text{K}}}^{ + }$) phoA supE44 λ^– thi-1 gy‑rA96 relA1, Rosetta2(DE3)ΔSlyD/X E. coli с генотипом F^– ompT hsdS_B(${\text{r}}_{{\text{B}}}^{ - }\,\,{\text{m}}_{{\text{B}}}^{ - }$) gal dcm ΔSlyD/X (DE3) pRARE2 (Cam^R), плазмидный вектор pET28b+ (Novagen), бактотриптон (Amresco, США); хлорид натрия (Helicon, Россия); хлорид никеля (Helicon, Россия); дрожжевой экстракт (Amresco, США); бакто-агар “Difco” (США); агароза (Helicon, Россия); β-меркаптоэтанол (Helicon, Россия); Triton X-100 (Panreac Applichem, Германия); акриламид и метиленбисакриламид (Helicon, Россия); ИПТГ (Helicon, Россия); ЭДТА (Serva, Германия); SDS (Panreac Applichem, Германия); имидазол (Panreac Applichem, Германия); диметилсульфоксид (Panreac Applichem, Германия); персульфат аммония (Panreac Applichem, Германия); ТЕМЕD (Panreac Applichem, Германия); глицерин – “PanReac” (Германия); канамицин (ПАО “Биохимик”, Россия); хлорамфеникол (Sigma-Aldrich, США); смола для металл-аффинной хроматографии – “Ni-NTA Superflow” фирмы “GE Healthcare” (Великобритания); Tris (Amresco, США); HEPES (Amresco, США); L-аргинин (Диаэм), гуанидина гидрохлорид (Amresco, США); глутатион окисленный (Amresco, США); глутатион восстановленный (Amresco, США); бычий сывороточный альбумин (Panreac Applichem, Германия); сухое обезжиренное молоко (Nonfat dried milk powder, Panreac Applichem); наборы стандартов молекулярного веса ДНК (“Thermo Scientific”, США); наборы стандартов молекулярного веса белков (“Thermo Scientific”, США); набор для проведения клонирования по методу Гибсона Gibson assambly cloning kit (NEB), набор реактивов для секвенирования: BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (“Thermo Scientific”, США); набор для иммуноферментного анализа Human TNFα ELISA Ready-SET-Go! (eBioscience, США); anti-4His-HRP антитела (MACS, Miltenyi Biotec, Германия); наборы West Dura Extended Duration Substrate (SuperSignal, США) и ECL Western Blotting Substrate (Promega, США); DPBS (1×) (Gibco), RPMI Medium 1640 (1×) (Gibco), DMEM (1×) (Gibco), HS (hourse serum, Gibco), L-глутамин (ПанЭко, Россия), смесь антибиотиков пенициллин/стрeптомицин (ПанЭко, Россия).

Дизайн генетических конструкций TCV и TFV, кодирующих блокаторы TNF с трехдоменной структурой, осуществляли с использованием пакета программ DNA Star Lasergene (DNA Star Madison, WI, USA) (рис. 1). Получение ДНК-конструкций целевых белков проводили с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Экспрессионные плазмиды были получены на основе вектора pET28b (Novagene). Последовательности олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) были синтезированы компанией ООО “ДНК-синтез” (г. Москва). Анализ последовательностей ДНК отдельных клонов клеток, трансформированных продуктом реакции, проводили с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле с последующим секвенированием плазмидной ДНК (ABI Prism 310 Genetic Analyzer). Полученные генетические конструкции использовали для трансформации клеток экспрессионного штамма Rosetta2(DE3)ΔSlyD/X E. coli [17].

Получение белков. Колонии Rosetta2(DE3)ΔSlyD/ X E.coli культивировали в жидкой среде LB, содержащей селективные антибиотики, в течение ночи при 37°С и 150–200 об./мин, затем переносили в соотношении 1 : 10 в свежую среду LB и культивировали в течение 1.5 ч при 37°С и 150 об./мин до достижения оптической плотности суспензии 0.6–0.7 ОЕ при 600 нм. Индукцию экспрессии проводили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (0.5 мМ) в течение 19–20 ч при 20°С и 150 об./мин. Затем культуру осаждали центрифугированием при 9000 об./мин в течение 15 мин и проводили выделение белков. Полученный осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 25 мМ HEPES (pH 7.0), 500 мМ хлорида натрия, 6 М гидрохлорида гуанидина, 10% глицерина, 1% TritonX-100, 5 мМ имидазола, 1 мМ 2-меркаптоэтанола. Полученную суспензию дезинтегрировали с помощью QSonica Q55 (QSonica sonicators, США), далее центрифугировали лизат в течение 20–30 мин при 9000 об./мин и проводили очистку методом аффинной хроматографии с помощью сорбента Ni-NTA Superflow (GEHealthcare, Великобритания). Для удаления несвязавшихся с хроматографическим матриксом белков использовали раствор, содержащий 15 мМ имидазола. Далее осуществляли рефолдинг белков на колонке путем формирования ступенчатого градиента гидрохлорида гуанидина от 6 М до 0 М с использованием буферных растворов, содержащих 25 мМ HEPES (pH 7.0), 500 мМ хлорида натрия, 10% глицерина, 0.4 М L-аргинина, 1 мМ восстановленного глутатиона и 0.1 мМ окисленного глутатиона. После полного удаления хаотропного агента проводили элюцию белков, используя буферный раствор состава: 25 мМ HEPES (pH 7.0), 500 мМ хлорида натрия, 10% глицерина, 0.4 М L-аргинина, 500 мМ имидазола, 1 мМ 2-меркаптоэтанола. Элюат диализовали против буфера, содержащего 25 мМ HEPES (pH 7.0), 150 мМ хлорида натрия, 5% глицерина, 1 мМ 2-меркаптоэтанола. Препараты белков после диализа концентрировали с помощью концентраторов Amicon Ultra 15 (Merck Millipore Ltd) с MWCO 5000 Da. Белковые препараты анализировали стандартным методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле с последующей окраской раствором CoomassieR250 [16], а также методом Вестерн-блоттинга с использованием антител anti-4His-HRP (MACS, Miltenyi Biotec, Германия). Для визуализации результатов использовали West Dura Extended Duration Substrate (SuperSignal, США).

Оценка связывания антител с лигандами методом проточной цитофлуориметрии. Макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM) гуманизированных по гену TNF мышей [18, 19], культивировали в чашках Петри в течение 10 дней в среде DMEM, содержащей 20% (об./об.) лошадиной сыворотки, 30% (об./об.) кондиционированной среды от клеток L929, L-глутамин (292 мкг/мл), пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Клетки промывали и удаляли с поверхности чашек ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS), подсчитывали количество клеток с помощью камеры Горяева (погибшие клетки отличали от живых окрашиванием трипановым синим). Блокировку Fcγ-рецепторов осуществляли специфическими антителами TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) Antibody (кат. № 101 319, Biolegend, США), затем клетки последовательно инкубировали (30 мин, 4°C) с полученными антителами (4 мкМ), рекомбинантным человеческим TNF (100 мкг/мл) (30 мин, 4°C) и c мечеными фикоэритрином (PE) антителами против человеческого TNF-α (Biolegend, США) (30 мин, 4°C). Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Cytoflex S (Beckman Coulter, США) с использованием программного обеспечения CytExpert 2.0 (Beckman Coulter, США).

Оценка удержания TNF активированными макрофагами. Макрофаги, полученные описанным выше методом, культивировали в 96-луночных планшетах (Corning^® 96-WellMicroplates, Corning, США) из расчета 10⁵ клеток на лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. После промывания полной средой DMEM клетки инкубировали с анализируемыми белками (2 мкМ) или DMEM (30 мин, 37°C, 5% CO₂) в качестве контроля. Затем клетки стимулировали (4 ч, 37°C, 5% CO₂) липополисахаридом (LPS, Sigma-Aldrich, L2630) в дозе 100 нг/мл для продукции клетками фактора некроза опухоли (TNF). После этого супернатант переносили в лунки 96-луночного планшета (Corning Costar, Corning, США) и измеряли концентрацию TNF с помощью набора HumanTNF-αELISAReady-SET-Go® (eBioscience, США) согласно протоколу производителя.

Цитотоксический МТТ-тест. Исследование TNF-ингибирующей активности полученных рекомбинантных белков проводили с помощью цитотоксического МТТ-теста на клеточной линии WEHI-164, чувствительной к действию человеческого TNF [20]. Клетки переносили в 96-луночные культуральные планшеты (Corning^® 3788 96-Well Polystyrene Microplates, Corning, США) из расчета 2 × 10³ клеток на лунку. Рекомбинантный hTNF добавляли в концентрации 100 ед./мл, исследуемые антитела – в серийных разведениях 1 мМ–2 пМ. После 24 ч инкубации добавляли 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (MTT) (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 4 мкг/мл и инкубировали в течение 4 ч, после чего кристаллы формазана растворяли в 10% (мас./об.) SDS в ДМСО с добавлением уксусной кислоты, и измеряли оптическую плотность (OD) при 570 нм с помощью спектрофотометра Multiskan EX (ThermoFisher Scientific, США). Далее рассчитывали процент живых клеток и отображали полученные значения на кривых нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Prism 5 (GraphPad, США).

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия между группами при уровне значимости p < 0.05.