Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 5, стр. 451-465

ВВЕДЕНИЕ

Коралловые рифы служат домом для многих видов донных и пелагических морских организмов [1]. Структурную основу рифа составляют твердые, или рифообразующие, кораллы (шестилучевые коралловые полипы, Anthozoa: Hexacorallia: Scleractinia), которые имеют твердый известковый экзоскелет. Отмершие участки колоний твердых кораллов заселяют мягкие кораллы (восьмилучевые коралловые полипы, Anthozoa: Octocorallia), которые можно разделить на горгонарии (Gorgonacea), имеющие внутри колоний кератиноподобный осевой скелет, и альционарии (Alcyonacea), содержащие внутри колонии мелкие известковые спикулы. На коралловом рифе часто встречаются другие представители шестилучевых коралловых полипов – зоантарии (Anthozoa: Hexacorallia: Zoanthidea), колонии которых, в отличие от твердых кораллов, не имеют экзоскелета, но, подобно альционариям, содержат известковые спикулы. Большинство видов коралловых полипов являются симбиотическими животными, которые содержат внутриклеточные симбиотические микроводоросли (динофлагелляты семейства Symbiodiniaceae) или зооксантеллы.

Ткани коралловых полипов богаты липидами, которые составляют до 30% сухой массы тканей колоний кораллов [2]. Более половины общих липидов кораллов составляют нейтральные липиды (НЛ) [3], к которым относятся триацилглицериды (ТГ), моноалкилдиацилглицериды (МАДАГ), сложные эфиры алифатических спиртов и жирных кислот (ЖК), или воски (ЭВ), а также стерины и эфиры стеринов [2, 4, 5]. В липидах зооксантелл содержится ряд гликолипидов (ГЛ): моно-, дигалактозилдиацилглицериды (МГДГ и ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилглицериды (СХДГ), которые характерны для мембран фотосинтетического аппарата растений [6]. А также характерные для растительных клеток бетаиновые липиды (БЛ). Фосфорсодержащие липиды (ФЛ) составляют 13–50% от общих липидов тропических кораллов [2, 7]. В состав ФЛ кораллов входят этаноламин-, холин-, серин- и инозитглицерофосфолипиды (ФЭ, ФХ, ФС и ФИ соответственно), лизофосфатидилхолин (ЛФХ), лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ), а также фосфонолипид – церамидаминоэтилфосфонат (ЦАЭФ) [8, 9]. В коралловых полипах НЛ служат основным резервом энергии, а ФЛ и стерины выполняют структурную функцию и составляют основу клеточных мембран [10].

Общие липиды коралловых полипов содержат более десяти основных классов липидов, однако каждый класс липидов представляют собой сложную смесь индивидуальных молекул, неполярная часть которых различается по остаткам ЖК и алифатических спиртов. Кораллы, как и другие биологические объекты, содержат сотни молекулярных видов липидов. По аналогии с геномом, протеомом и метаболомом, общий спектр липидных молекул биологической системы определяется как липидóм, а картирование спектра липидов и определение их биологической роли называется липидомикой [11].

Существование симбиотических видов коралловых полипов полностью зависит от наличия зооксантелл, которые в процессе фотосинтеза вырабатывают питательные вещества, обеспечивая до 90% энергии, необходимой организму-хозяину [12]. При температуре воды выше 32°С зооксантеллы покидают своего хозяина; потеря зооксантелл называется обесцвечиванием (bleaching). Полное обесцвечивание под действием температурного стресса приводит к гибели не только отдельных животных, но и целых морских экосистем, основой которых являются симбиотические животные, в частности, экосистем коралловых рифов. В процессе обесцвечивания в организме коралла происходят существенные изменения, которые также отражаются и на их липидном профиле. Исследования, касающиеся изменений липидных показателей в процессе обесцвечивания кораллов [5, 13–15] и их симбионтов [16–19] не многочисленны, и лишь недавно было проведено детальное исследование изменений, происходящих в полном липидоме мягкого коралла Sinularia sp., в условиях экспериментального температурного стресса [20].

В настоящее время, благодаря появлению новых инструментальных методов, липидомный анализ широко применяется для диагностики многих заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена [21, 22]. При этом количество опубликованных научных работ по липидому человека и высших наземных животных на два порядка превышает количество исследований липидома морских организмов. Данные о полном липидоме кораллов и других видов морских беспозвоночных очень ограниченные и разрозненные. Переход от классических интегральных липидных показателей к липидомному анализу может открыть новые возможности в изучении биохимии и экологии кораллов. Фундаментом для такого рода исследований является расшифровка полного липидома коралловых полипов. Целью настоящей работы является обобщение информации, касающейся изучения липидных профилей кораллов, а также их симбионтов, и изменений липидных показателей при неблагоприятных условиях окружающей среды.

СИМБИОТИЧЕСКИЙ ОРГАНИЗМ КОРАЛЛА И ЕГО ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ

Почти половина беспозвоночных животных типа Cnidaria, к которым относится класс коралловых полипов (Anthozoa), содержит фотосинтетические микроорганизмы (зооксантеллы), которые придают им свойства растений – это привело к рождению концепции голобионта или метаорганизма. Такая ассоциация растительных симбионтов и животного организма-хозяина коралла сформировала целую экосистему кораллового рифа, который считается “оазисом в пустынном океане”. Огромная важность экосистем коралловых рифов и реальная угроза их исчезновения стали поводом для тщательного изучения книдарий [23].

Симбиотические динофлагелляты семейства Symbiodiniaceae обычно расположены внутри клеток гастродермикса кишечнополостного организма-хозяина (то есть, самого внутреннего тканевого слоя, который граничит с гастроваскулярной полостью), где они связаны мембранным комплексом, состоящим из мембраны водорослевого происхождения и наружной мембраны животного организма-хозяина [24, 25]. Зооксантеллы могут передаваться по наследству [26] или, чаще всего, захватываются из окружающей среды [27].

В дополнение к высокой освещенности и убежищу зооксантеллы, в обмен на фотосинтетически фиксируемый углерод, получают от организма-хозяина неорганический азот, фосфор и углерод [28]. В случае твердых кораллов симбиоз также тесно связан со способностью кораллов образовывать массивные известковые скелеты, которые образуют коралловые рифы. Партнерство книдарии–динофлагелляты имеет особое экологическое значение в среде тропических коралловых рифов, в которой недостаточно экзогенного питания организма-хозяина коралла, и питательные вещества, получаемые симбионтами с помощью процесса фотосинтеза, поддерживают метаболизм, рост, размножение и выживание колоний кораллов [29, 30].

Клетки Symbiodiniaceae имеют золотисто-коричневый цвет из-за присутствия различных пигментов в их хлоропластах. Здоровые кораллы содержат миллионы клеток зооксантелл на квадратный сантиметр ткани и поэтому имеют такой же золотисто-коричневый оттенок. Обесцвечивание кораллов называется так из-за потери цвета тканей организма-хозяина коралла и обнажения лежащего в основе белого известкового скелета. Эта потеря цвета чаще всего обусловлена дисфункцией симбиоза, то есть потерей симбионтов тканями полипа [31]. Обесцвечивание – это реакция на стресс, вызванный изменениями окружающей среды, например, повышения температуры поверхности моря, связанного с глобальным потеплением, в сочетании с высокой степенью солнечной радиации [32]. Симбиотический организм коралла очень чувствителен к температуре, даже умеренное повышение температуры на 1–2°C может привести к обесцвечиванию всего рифа [32].

Начинается процесс обесцвечивания в хлоропластах зооксантелл, повышенная температура и высокий уровень солнечной радиации вызывают фотоингибирование, повреждение хлоропластов и фотосинтетических аппаратов клеток, что ведет к взаимосвязанным процессам запуска каскада обесцвечивания [28, 33]. В каскадном механизме обесцвечивания самого организма-хозяина ключевую роль играет окислительный стресс, который в животном организме модулирует гибель/ выживание клеток [34] и связан с врожденным иммунитетом организма [35]. При окислительном стрессе происходит накопление монооксида азота (NO), который участвует в межпартнерском взаимодействии и задействован в иммунном ответе коралла [35, 36]. Взаимодействие хозяин-микроорганизм обусловлено способностью вторгающихся микроорганизмов уклоняться от иммунного ответа хозяина и контролировать его, а также способностью хозяина обнаружить и уничтожить патогенные микроорганизмы [37]. Мутуализм книдарии – динофлагелляты можно рассматривать как контролируемую инфекцию, благодаря которой симбионты успешно модулируют иммунный ответ хозяина. Таким образом, можно сказать, что обесцвечивание – это процесс обнаружения патогенных зооксантелл и уничтожение их организмом-хозяином коралла. Симбионты сигнализируют о своем присутствии выработкой реактивных форм кислорода (АФК) при фотоингибировании, а организм-хозяин, в свою очередь, вырабатывая NO, запускает иммунный ответ для избавления от патогенных микроорганизмов [37].

В стрессовых условиях наблюдается и запрограммированная (апоптоз), и неконтролируемая (некроз) гибель клеток [38, 39]; кроме того сам организм-хозяин уничтожает зооксантеллы. Дан и коллеги предположили, что с помощью апоптоза организм, удаляя поврежденные клетки симбиосом, смягчает повреждения тканей от АФК и тем самым поддерживает гомеостаз тканей [38]. Существует переход от апоптоза при умеренном и коротком температурном стрессе к некрозу при более жестких стрессовых условиях [40, 41]. Другая форма гибели клеток, аутофагия, также участвует в процессе обесцвечивания кораллов [42]. Стресс приводит к изменениям в созревании лизосом и слиянию их с симбиосомами, предположительно, приводящему к перевариванию симбионта [43]. Предполагается, что существует взаимосвязь между двумя формами гибели клеток, при этом, когда одна форма ингибируется, другая – индуцируется. Подобная связь между апоптозом и аутофагией наблюдается у позвоночных [44].

ЛИПИДНЫЙ ПРОФИЛЬ КОРАЛЛОВ

Измерение интегральных липидных показателей (уровня общих липидов, содержания основных классов липидов и состава ЖК) до недавнего времени было одним из основных методических подходов при изучении эффективности репродуктивной стратегии кораллов, степени повреждения и скорости восстановления частично обесцвеченных рифов, пищевых и симбиотических отношений кораллов, а также транспорта органического углерода между симбионтами и организмом-хозяином [15, 45–49]. Со времени первых скрининговых исследований кораллов [50], накоплена обширная информация о составе общих липидов и ЖК, полученных гидролизом общих липидов или их классов [51–53]. В последние 10 лет благодаря развитию современных физико-химических методов анализа липидов, которые позволяют установить структуры молекул липидов в нативном виде, стали применять липидомный подход в изучении липидов книдарий и их зооксантелл [19, 20, 54–57]. Появились первые результаты в области липидомики морских организмов, например, макроводорослей [58], кальмаров [59], актиний [60] и гидрокораллов [57]. Среди коралловых полипов, насчитывающих более 20 тысяч видов, описан состав молекулярных видов ФЛ четырех альционарий [54–56], профиль ФХ рифообразующего коралла Seriatopora caliendrum [61–63], полные липидомы мягкого коралла Sinularia seaesensis [64] и зоантарии Palythoa sp. [65], а также изучены изменения липидома мягкого коралла Sinularia sp., происходящие под действием повышенной температуры [20].

ИЗМЕНЕНИЕ ЛИПИДНОГО ПРОФИЛЯ КОРАЛЛОВ И ИХ СИМБИОНТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА

Еще в самых ранних работах по обесцвечиванию кораллов [13, 14] акцент был сделан именно на липидах, поскольку они играют важную роль в этом процессе. Неблагоприятные условия внешней среды или заболевания оказывают существенное влияние на содержание общих липидов в кораллах. В работе по изучению влияния обесцвечивания в естественной среде обитания на уровень липидов рифообразующего коралла Pocilopora damicornis было замечено двукратное снижение уровня липидов в обесцвеченных колониях коралла относительно здоровых колоний (с 0.59 до 0.28% от сухого веса) [13]. Обесцвечивание коралловых рифов на о. Сесоко (Япония) привело к заметному понижению количества липидов в рифообразующих кораллах с 26.5 ± 2.3 до 9.0 ± 1.5% от мокрого веса колонии [5].

Основной причиной обесцвечивания является повышенная температура, которая действует синергически с повышенным уровнем солнечной радиации. Так, в работе по изучению влияние различной интенсивности света и температуры на ЖК профиль организма-хозяина и симбионтов коралла Montipora digitata было замечено, что снижение доли ПНЖК наблюдается в ответ на повышение интенсивности света только лишь в сочетании с повышенной температурой [96]. Большинство изменений были замечены в самом полипе M. digitata, что свидетельствует о том, что либо сам организм-хозяин более восприимчив к изменениям окружающей среды, чем его симбионты, либо хозяин защищает симбионтов от воздействия неблагоприятных факторов [96].

Степень и характер нарушений, происходящих в симбиотическом организме коралла в ответ на тепловой стресс, зависит от таксономической принадлежности коралла. В работе [15] обнаружено, что рифообразующий коралл Acropora intermedia является более восприимчивым к экспериментальному тепловому стрессу, чем альционария Sinularia capitalis и рифообразующий коралл Montipora digitata. В данной работе была изучена динамика изменений содержания различных классов липидов и ЖК профилей различных таксономических групп кораллов при гипертермическом воздействии. Во всех исследуемых образцах существенно снижалось содержание общих липидов (на 17% для S. capitalis и 35% для A. intermedia после 24-х часов инкубирования, на 40% для M. digitata после 30-ти часов инкубирования); наблюдались изменения в содержание различных классов липидов. Липидные профили кораллов S. capitalis после 24-х часов инкубации и M. digitata после 30-ти часов инкубации были схожи, за исключением ТГ, количество которых в M. digitata уменьшилась на 67% относительно контрольных значений. В A. intermedia количества ФЛ и СТ уменьшилось в два раза после 10-ти часов тепловой обработки, в то время как количество восков увеличилось на 40% относительно контроля, а затем снова снизилось. Профиль ЖК оставался неизменным в течение 24-х часов эксперимента, но к концу эксперимента (48 часов для S. capitalis и A. intermedia и 30 часов для M. digitata) все виды кораллов продемонстрировали снижение количества ПНЖК на 80–90%; меньшее снижение было отмечено для предельных (60%) и моноеновых ЖК (60%).

Известно, что процесс обесцвечивания запускается в клетках симбионтов, что отражается на липидном профиле зооксантелл кораллов. Определенные клады зооксантелл более устойчивы к повышенным температурам. В работе [16] было проведено сравнительное исследование состава липидов тилакоидных мембран культивированных зооксантелл из различных видов рифообразующих кораллов. Было показано, что отношение ЖК 18:1n-9/18:4n-3 значительно выше в тех культурах симбионтов, которые более устойчивы к повышению температуры окружающей среды. Авторы предполагают, что большое количество ПНЖК в составе липидов тилакоидных мембран зооксантелл при действии повышенной температуры приводит к их окислению и к повышению проницаемости мембран, что нарушает работу фотосинтетического аппарата и, в конечном итоге, ведет к потере зооксантелл и гибели колонии коралла [16].

В более поздних работах [17, 18] также было показано, что различные типы зооксантелл по-разному реагируют на температурный стресс, что отражается на профиле их липидного состава. В работе [18] было проведено сравнительное исследование состава липидов и ЖК культур зооксантелл Symbiodinium goreauii клад C1 и Symbiodinium sp. клад D1 при различных температурах. Длительное воздействие повышенной температуры вело к уменьшению относительного количества С₁₈ ПНЖК в липидах зооксантелл обоих типов, но видимый тепловой порог изменений липидов был ниже для C1.

В работе [17] было изучено изменение профиля ЖК липидов симбиотических динофлагеллят различных филогенетических типов (Symbiodinium kawagutii (тип F1), S. pilosum (тип A2), S. microadriaticum (тип A1), Symbiodinium sp. (тип B1) и Symbiodinium sp. (тип C1)), выделенных из тканей различных видов кораллов и культивированных при нормальной (24°C) и повышенной (32°C) температурах. Для изучения способов акклиматизации, были исследованы изменения ЖК двух типов термочувствительных динофлагеллят кладов C1 и A1. Симбионты по-разному реагировали на повышение температуры. Для Symbiodinium sp. С1 высокая температура не приводила к значительному изменению состава жирных кислот, а у S. microadriaticum A1 наблюдались значительные изменения состава ЖК. Увеличилось содержание 18:1 и 18:3, при этом уменьшился относительный процент 16:0, 18:1, 18:4 и 22:6. В ЖК зооксантелл, культивированных при 32°С, содержание 18:3 увеличилось в пять раз по сравнению с ЖК зооксантелл, культивированных при 24°С, а 18:1n-9 – удвоилось. Для фракции фотосинтетических мембран относительная пропорция 18:1n-9 также удвоилась, процентное содержание 22:6 сократилось в два раза и снизилась доля 16:0. Отношение насыщенных и ненасыщенных ЖК липидов фотосинтетических мембран Symbiodinium sp. С1 составило 1.17 при 24°С, увеличилось до 1.23 при 32°С, тогда как для S. microadriaticum A1 это отношение заметно снизилось с 1.55 при 24°С до 1.28 при 32°С. Изменение длины углеродной цепи ЖК также сыграло роль в изменении состава мембран S. microadriaticum A1, культивируемых при высокой температуре. В ответ на повышение температуры содержание С₁₈ ЖК увеличивалось как в общих липидах, так и в липидах фотосинтетических мембран, при этом уменьшались количества C₁₆ и C₂₂ ЖК. Интересно, что профиль ЖК Symbiodinium sp. С1 имел другую картину: увеличилось содержание С₂₂ ЖК в целых клетках, выращенных при высокой температуре. Так как культура Symbiodinium sp. С1 росла гораздо лучше при более высокой температуре культивирования, было сделано предположение, что изменение длины ЖК для S. microadriaticum A1 не отражает физиологическую адаптацию к акклиматизации, но, скорее всего, отражает степень повреждений. У каждого типа зооксантелл, по-видимому, разные механизмы акклиматизации: Symbiodinium sp. С1 был способен расти при 32°С без значительных изменений в составе ЖК клеточных мембран, хотя температура плавления культур, выращенных при 32°С, была на 3.5°С выше. Анализируя состав мембран и изменения, вызванные реакцией акклиматизации, авторы предположили, что мембраны S. microadriaticum A1 имеют более высокую текучесть при 24°C, с более высокой долей ПНЖК. После повышения температуры культивации в липидах S. microadriaticum A1 изменился состав ЖК, но этих изменений оказалось недостаточно для обеспечения устойчивого роста культуры при 32°С. В итоге, авторами был сделан вывод о том, что степень ненасыщенности ЖК тилакоидных мембран зооксантелл на прямую не влияет на обесцвечивание и не может быть использована, как надежный инструмент для диагностики термочувствительности симбиотических кораллов [17].

В работе [19] были изучены происходящие под действием повышенной температуры изменения структурных липидов (БЛ, ФЛ и ГЛ) двух видов зооксантелл: более термически устойчивого Durusdinium trenchii и более термически восприимчивого вида Cladocopium C3; выделенных из рифообразующего коралла Acropora valida. Результаты исследования показали, для того чтобы справиться с повышенной температурой симбиотические водоросли могут применять несколько стратегий, включающих изменения липидного строения их мембран.

По сравнению с Cladocopium, D. trenchii характеризовался более высоким уровням лизо-ДГКХ. Накопление лизо-липидов может представлять собой отдельный механизм, участвующий в устойчивости к тепловому стрессу D. trenchii [19]. Так же было показано, что увеличивается насыщенность липидов МГДГ, ДГДГ, СХДГ, ФХ, лизо-ФХ у термочувствительного клада зооксантелл Cladocopium C3, что является ответной реакцией клеток фотосинтезирующих организмов для снижения текучести биологических мембран при высоких температурах. У D. trenchii таких изменений не было замечено, видимо подобный стресс для них не является критичным. МГДГ, ДГКХ, лизо-ДГКХ и лизо-ФХ у D. trenchii имели более высокую степень ненасыщенности по сравнению с Cladocopium C3, независимо от температуры эксперимента, а ФХ, ФГ и СХДГ были значительно более насыщенными. Под действием температуры наблюдалось увеличение степени насыщенности СХДГ и лизо-ФХ у D. trenchii. Эти результаты позволяют предположить, что более высокая термоустойчивость D. trenchii не происходит за счет общего повышенного насыщения мембранных липидов в организме зооксантелл, как упоминалось ранее [16], а центральную роль в ответ на температурный стресс занимает СХДГ и их степень насыщенности, поскольку индекс ненасыщенности снижается у D. trenchii при температуре окружающей среды, и разница с Cladocopium C3 еще больше увеличивается при температурном стрессе [19]. Интересно, что соотношение ДГДГ/ МГДГ у D. trenchii по сравнению с симбионтами Cladocopium было больше. Соотношение ДГДГ/ МГДГ в мембране имеет решающее значение для правильного физиологического функционирования, поскольку ДГДГ являются бислойобразующим липидом, а МГДГ нет [97]. Повышенная термостойкость D. trenchii может быть напрямую связана с более высокими соотношениями ДГДГ/ МГДГ даже в отсутствие теплового стресса. Напротив, восприимчивость Cladocopium C3 может быть связана с обычно более низкими отношениями ДГДГ/МГДГ в сочетании с неспособностью реконструировать галактолипидный профиль его хлоропластов в ответ на повышение температуры [19].

Недавно был проведен эксперимент по экспериментальному обесцвечиванию мягкого коралла Sinularia sp. при кратковременном (36 часов) действии повышенной температуры [20]. Были замечены резкие изменения в липидоме тропической альционарии. Если содержание основных запасных (ТГ, МАДАГ и ЭВ) и структурных липидов (ФЛ) достоверно не изменилось относительно контрольных образцов, то уровни хлорофилла, гликолипидов, ФИ и ФХ с C_16–18 ПНЖК существенно снизились [20]. Была нарушена естественная суточная цикличность в уровне некоторых молекулярных видов гликолипидов, что говорит о нарушениях фотосинтетического аппарата зооксантелл, происходящих при термическом стрессе [20]. Среди молекулярных видов липидов достоверные изменения наблюдались в профилях ФХ и ФЭ. Мы полагаем, что ФЭ является основной мишенью процесса обесцвечивания, о чем свидетельствуют снижение уровня ФЭ, замещение алкил/ацильных молекулярных видов ФЭ на диацильные, появление продуктов гидролиза (ЛФЭ) и окисленных производных ФЭ (окФЭ) [20]. Известно, что колонии кораллов содержат разнообразные молекулярные виды лизоглицерофосфолипидов [63], которые связаны с модуляцией мембранных свойств клеток кораллов [83], однако окисленные фосфолипиды в частично обесцвеченных кораллах обнаружены не были. Положение sn-2 в остатке глицерина таких фосфолипидов содержит окисленные ПНЖК. Липиды схожей структуры участвуют в регуляции воспаления, тромбоза, ангиогенеза и других важных процессов у высших животных [98]. Окисленные фосфолипиды могут нарушать структуру клеточных мембран, поскольку окисленные ацильные цепи обращены в водную среду, что делает их физически доступными для участия в сигнальных событиях, включая и распознание макрофагами [99]. Предположительно окФЭ может быть синтезирован путем прямого окисления молекул ФЭ или этерификацией ЛФЭ окисленными ПНЖК. Одновременное появление лизо-ФЭ и окФЭ при обесцвечивании Sinularia sp. указывает на возможную биосинтетическую связь между лизо-ФЭ и окФЭ [20].