Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 746-752

Кластеризация

В данной работе мы заново проанализировали опубликованные ранее данные [3, 10], полученные с использованием гликанового эррея, включающего 211 синтетических гликанов. Поскольку количество кластеров нам заранее было неизвестно, был использован метод иерархической кластеризации. В качестве матрицы расстояний брали матрицу Q = 1 – cor(X)[i,j], где cor(X)[i,j] – коэффициент корреляции между гликанами i и j. Для выделения достоверных кластеров мы использовали метод бутстрепинга [11]. Вычисления производились с помощью R-пакета pvclust; число случайно сгенерированных выборок на основе имеющихся данных (бутстреп ресамплинг) составляло 20 000. В качестве кластеров рассматривали группы гликанов, для которых величина p ≥ 0.99. Всего было выявлено 23 кластера, внутри которых АГАТ достоверно коррелировали (табл. 1).

Порог объединения в кластер определяется значением р, при этом внутри кластера гликаны не обязательно очень хорошо коррелируют между собой, как это видно из табл. 1; здесь рассматривались корреляции вплоть до ~0.5. Более важно было отличие на уровне целых кластеров, то есть одного кластера от другого.

Приведенные выше корреляции, как между кластерами, так и между индивидуальными АГАТ внутри них, были положительны. Общую картину как положительных, так и отрицательных корреляций можно увидеть на гистограмме (рис. 1), которая говорит о редкой встречаемости высоких корреляций.

Рис. 1.

Позитивные и, в особенности, негативные корреляции между АГАТ являются редкими событиями.

Большая часть этих 23 кластеров тривиальна, к этой категории мы относим следующие случаи.

1) Антитела к гликанам, отличающихся только спейсером, как, например, кластеры # 15 и 17;

2) Антитела к гомополимерам, таким как хитоолигосахариды (# 13 и 14);

3) Антитела к производному N-гликолилнейраминовой кислоты в паре с производным N-ацетилнейраминовой кислоты (кластер #3);

Корреляции внутри кластеров этих трех типов высоки.

4) Антитела к гликанам, имеющих общий моносахаридный остаток, например, кластер #22, в который вошли два гликана с коровым остатком Galβ и, собственно, Galβ, а также кластер #2, объединяющий молекулы с коровым мотивом 3Galβ1-4GlcNAcβ; коэффициенты корреляции в таких случаях могут быть как низкими (очень небольшой эпитоп, кластер #22), так и высокими (#2).

Наибольший интерес представляют такие кластеры АГАТ, в которых структуры гликанов совсем непохожи. Можно предположить два механизма корреляции антител к непохожим антигенам. Первый – одни и те же антитела связываются со взаимно мимикрирующими антигенами. Второй – не структурная, а функциональная сцепленность, например, антитела к разным молекулам одного и того же патогена. Высокая нетривиальная корреляция обнаружилась лишь одна, между гликанами кластера #1, в который вошли GalNAcα1-4(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ-sp3 и (GlcNAcβ1)₃-3,4,6-GalNAcα-sp3. Оба гликана являются неприродными, поэтому предполагать их функциональную сцепленность бессмысленно. Что касается взаимного мимикрирования, то можно предположить, что антитела узнают определенное пространственное расположение метильных групп, которых в первом гликане три, а во втором четыре, и они размещены довольно компактно. Ранее мы нашли похожий эффект при узнавании естественными антителами человека структурно совершенно разных сильно метилированных полисахаридов [12].

Существует ли корреляция между антителами групп крови A и B?

По имеющейся выборке доноров коэффициент корреляции Пирсона между двумя гликанами GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ (A тип 2) и Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ (B тип 2) оказался равен 0.43, что говорит о наличии слабой положительной корреляции. Наличие или отсутствие антител к этим гликанам определяет группу крови человека по системе АВО. Насколько она достоверна с биологической точки зрения?

Рис. 2 показывает, что когорта из 106 изученных доноров разбивается на четыре группы по интенсивности сигналов к гликанам A тип 2 и B тип 2. Эти группы (доноров четвертой группы было только двое, что согласуется с известной низкой частотой встречаемости²² индивидуумов группы крови АВ) соответствуют четырем группам системы АВО. С математической точки зрения, корреляция предполагает наличие обоих параметров, которые однонаправленно изменяются. В случае с антителами к антигенам групп крови, один из параметров равен нулю (так, у доноров группы крови В уровень анти-А антител широко варьируется, а анти-В антител нет вовсе), поэтому отрицательной корреляции быть не может, а положительная корреляция возникла вследствие того, что в рассматриваемой когорте преобладающее большинство индивидуумов имеет, по-видимому, группу I(0), для которой характерно наличие ненулевых уровней антител к обоим рассматриваемым антигенам, флуктуация в сигналах к которым и позволила выявить математическую (но не биологическую) взаимосвязь. То же самое следует ожидать и для других связанных с углеводными антигенами систем групп крови, таких как Lewis и Pp (есть и другие системы, но там представленность одного из параметров, то есть фенотипа, составляет около 0.99).

Рис. 2.

Встречаемость антител, направленных к тетрасахаридам групп крови GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ (A тип 2) и Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ (B тип 2). По осям абсцисс и ординат – относительные единицы флуоресценции, уменьшенные в тысячу раз. Зеленые точки соответствуют группе крови III(B), красные – II(А), голубые – I(O), черные – IV(AB).

Взаимодействия между кластерами

Было оценено также и межкластерное взаимодействие (рис. 3). Поскольку мы задали высокое пороговое значение р, алгоритм не объединил кластеры похожих гликанов в общий кластер большего размера. Тем не менее, есть кластеры, которые можно было бы объединить в более крупный, например, кластеры #7 и #8, коэффициент корреляции между ними составил 0.71, в то время как внутри этих малых кластеров корреляция была 0.91 и 0.89 соответственно. Подобная ситуация наблюдается для пары #13 и #14, коэффициент корреляции между ними 0.50. Структурная схожесть гликанов в обоих случаях очевидна (табл. 1).

Рис. 3.

Межкластерное взаимодействие обнаруженных 23 кластеров. Точки на диагонали обозначают величину коэффициента корреляции внутри кластера i (i – номер строки/столбца). Точки вне диагонали обозначают среднюю величину коэффициента корреляции между кластерами. Синий цвет соответствует положительной, а коричневый – отрицательной корреляции, градация цвета приведена справа.

Существуют ли отрицательные корреляции?

Оказалось, что на уровне кластеров наблюдается отрицательная корреляция между #6 и #2 (коэффициент корреляции составил –0.36, это лучшая из обнаруженных величин). На уровне отдельных пар гликанов также найдено несколько примеров (табл. 2), и корреляция в них находилась в интервале –0.44…–0.47, т.е. приближалась к корреляциям средней силы.

Все четыре пары имеют очевидный общий структурный мотив, отличающий “левые” гликаны от “правых”, а именно, гликаны из левого столбца основаны на так называемом коре 2, то есть, N-ацетиллактозамине (LN) [13], а гликаны из правого столбца относятся к кору 1, то есть к Galβ1-3GlcNAc (Le^C) [14]. Отметим, что эта закономерность проявляется только для незамещенных олиголактозаминовых цепей, и что единичного LN для связывания антител недостаточно. Важно также, что антитела, связывающиеся на чипе с гликанами 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ и Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ, на самом деле почти идентичны антителам к “родительскому” дисахариду Le^C, что было показано с помощью их аффинного выделения [15]. Имея в виду все вышесказанное, мы выбрали для дальнейшего рассмотрения первую пару из табл. 2.

Чтобы наглядно продемонстрировать наличие реципрокных взаимоотношений, мы приводим диаграмму (рис. 4), на которой видно, что уровни антител к двум гликанам (пример из табл. 2) редко оказываются вблизи диагонали.

Рис. 4.

Реципрокные взаимоотношения между анти-3-O-Su-Galβ1-3GlcNAc и анти-GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc антителами. По осям абсцисс и ординат – относительные единицы флуоресценции, уменьшенные в тысячу раз.

Биологический смысл антагонизма между анти-Galβ1-3GlcNAc (Le^C) and анти-Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc (LN₂) антителами пока неясен. Вряд ли это “физическая” конкуренция за связывание антител с двумя соседними эпитопами одной и той же молекулы, это больше похоже на функциональный антагонизм. Антитела к Le^C выполняют функцию надзора за возникновением опухолевых клеток, у больных раком молочной железы наблюдается их дефицит [16, 17]. Возможно, анти-LN₂ восполняют этот дефицит, в пользу чего говорят данные о повышенной экспрессии линейных полилактозаминовых цепей при карциномах (а в нормальных тканях они представлены слабо) [18, 19]. Наличие антител к полилактозаминам является фактором риска, они относятся к так называемым холодовым агглютининам (ауто-антителам), а у беременных могут вызвать ответ к плоду, так как полилактозаминовые цепи широко представлены у эмбриона (после рождения они трансформируются в разветвленные), иными словами, являются онко-эмбриональными антигенами [17]. То есть, при дефиците антител к Le^C, антитела к полилактозаминам появляются (точнее, не исчезают при взрослении) как их суррогат. Более убедительной гипотезы у нас нет.

Таким образом, при изучении антигликановых естественных антител в большой когорте доноров выявляются как положительные, так и отрицательные корреляции между антителами, которые бывают нетривиальными, когда коррелирующие антитела направлены к гликанам неродственной структуры. Причины возникновения таких корреляций предстоит выяснить.