Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 753-760

ВВЕДЕНИЕ

Производство различных рекомбинантных белков, отдельных субъединиц, а также полипептидов обусловливает развитие биотехнологических подходов, обеспечивающих быстрый и дешевый метод их выделения в нативном виде. В рутинных экспериментальных исследованиях часто используют различные аффинные сорбенты для жидкостной хроматографии, которые позволяют быстро и эффективно очищать рекомбинантные белки с последующим удалением необходимых для хроматографии этих белков “тэгов” специфическими протеазами. Одним из широко используемых вариантов является введение участков узнавания тромбином. Тромбин (фактор свертывания II) является компонентом системы свертывания крови млекопитающих и функционирует как сайт специфическая сериновая протеаза, нечувствительная к буферным растворам, содержащим различные детергенты [1]. Этот белок распознает сайт LVPR^GS и вносит разрыв между аргинином и глицином [2]. Для изучения генеза HlyII в бактериальных клетках и взаимодействия токсина с клетками эукариот создана панель МА к С-терминальному домену порообразующего белка HlyII [3]. Данная работа посвящена описанию HlyIIC-15, которое эффективно связывается с тромбиновым сайтом гибридного белка, но не с другими пептидными участками рекомбинантного CTD.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика аминокислотной последовательности HlyIICTD. Одним из факторов вирулентности условно-патогенного микроорганизма B. cereus является порообразующий токсин гемолизин II (HlyII) [4]. Гемолизин II со структурой типа β‑баррель имеет высокую гомологию с альфа-токсином S. aureus и отличается от него наличием С‑терминальной аминокислотной избыточности из 94 остатков [5]. Этот участок при ЯМР-анализе продемонстрировал не описанную ранее уникальную пространственную структуру [6]. Участок гена клонирован и HlyIICTD очищен как описано в работе Руденко с соавторами [3]. Аминокислотная последовательность HlyIICTD состоит из аминокислотных остатков C-концевой избыточности HlyII, тромбинового сайта, шести остатков гистидина и линкера (рис. 1).

Рис. 1.

Аминокислотная последовательность HlyIICTD клонированная из HlyII B. cereus ATCC 14579 в pET29b. Молекулярная масса клонированного CTD, 13906.59 Da. Жирными буквами выделен тромбиновый сайт, / указывает место протеолитической атаки тромбином. Курсивом обозначен участок с шестью гистидинами.

Особенности взаимодействия HlyIICTD c эритроцитами, выявляемые МА HlyIIC-15. В составе панели моноклональных антител против HlyIICTD обнаружено МА номер 15 (HlyIIC-15), которое не способно узнавать антиген в момент его взаимодействия с мембранами как эритроцитов [3], так и липосом [7]. Неспособность взаимодействия HlyIIC-15 со связавшимся с эритроцитами CTD, по-видимому, определяется стерическим расположением эпитопа для этого антитела и его недоступностью относительно точки узнавания мембраны антигеном.

В работе Miles с соавторами [8] было продемонстрировано, что нативный гемолизин II и делеционный вариант, лишенный С-концевого домена, эффективно олигомеризуется как в присутствии эритроцитов, так и липосом. В связи с этим проверена возможность олигомеризации CTD в присутствии эритроцитов и липосом. На рис. 2 показан иммуноблоттинг с использованием МА HlyIIC-15. Как видно из этого рисунка HlyIICTD в присутствии эритроцитов кролика и липосом переходит в тетрамерную форму. До добавления эритроцитов и липосом кроме мономерных форм HlyIICTD видны слабоокрашенные димерные и тетрамерные формы HlyIICTD (рис. 2, дорожка 2). При инкубировании HlyIICTD с эритроцитами МА HlyIIC-15 выявляло тетрамерные формы, в то время как мономерные формы не видны (рис. 2, дорожка 3). Аналогичные результаты были получены при инкубировании HlyIICTD с липосомами (рис. 2, дорожка 4). Таким образом, HlyIIC-15 способно эффективно взаимодействовать с CTD, а эпитоп, узнаваемый этим антителом, расположен на поверхности и доступен MA HlyIIC-15 как у мономерных форм антигена, так и его тетрамерных форм.

Рис. 2.

Иммунноблоттинг HlyIICTD до (2) и после (3) инкубации с эритроцитами и с липосомами (4). Окрашено МА HlyIIC-15. (1) – маркеры молекулярных масс.

Пептидный фаговый дисплей. Особенности взаимодействия HlyIICTD с эритроцитами, выявленные с помощью HlyIIC-15, поставили задачу определения эпитопа, узнаваемого этим антителом. Антигенную детерминанту HlyIICTD, узнаваемую МА HlyIIC-15, определяли методом пептидного фагового дисплея. В этом методе возможные пептидные варианты экспрессируется на поверхности фагового вириона. Отбор фагов, несущих пептидные аминокислотные последовательности, специфически взаимодействующие с МА HlyIIC-15, проводили по способности взаимодействовать друг с другом. Было проведено три раунда селекции. ДНК отобранных индивидуальных фаговых клонов секвенировали. С помощью программы GeneRuner проведен анализ полученных нуклеотидных последовательностей и определены аминокислотные последовательности пептидов, узнаваемых МА HlyIIC‑15 и экспонированных в составе белка pIII бактериофагов.

После трех раундов аффинной селекции из неамплифицированного элюата последнего раунда отобраны 30 фаговых клонов. После анализа их взаимодействия с МА HlyIIC-15 отобрано 12 клонов, в которых определена последовательность экспонируемого фагом пептида. Аминокислотные последовательности всех пептидов были выравнены и обнаружено четыре консенсусных аминокислотных остатка (а.о.) LVPR. Причем в клонах 7 и 9 данная консенсусная последовательность непосредственно примыкает к глициновому линкеру, с помощью которого пептиды соединены с последовательностью структурного белка pIII бактериофага. Следовательно, протяженность участка узнавания МА HlyIIC-15 может включать либо четыре LVPR, либо пять а.о. – LVPRG. Остаток глицина является искусственно привнесенным в рекомбинантный белок пептидным фрагментом и выявленный пептид почти полностью соответствующим участку узнавания тромбина LVPR^GS.

Экспериментальное подтверждение локализации эпитопа, узнаваемого МА HlyIIC-15 методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. С помощью иммуноферментного анализа сравнивали взаимодействие МА HlyIIC-15 со следующими препаратами: HlyIICTD, нативным делеционным вариантом HlyIIΔС (без С-терминального участка), содержащим тромбиновый сайт, а также с нативным препаратом HlyII, не содержащим тромбиновый сайт. HlyIIΔС и HlyIICTD, содержали шесть гистидиновых аминокислотных остатков. HlyII содержал интактный район, соответствующий С-концевой избыточности порообразующего токсина HlyII B. cereus. В результате иммуноферментного анализа показано, что при эффективном взаимодействии с HlyIICTD и HlyIIΔС, МА HlyIIC-15 не узнавали нативный HlyII, не содержащий тромбиновый сайт, что подтверждает результаты, полученные фаговым дисплеем о том, что эпитоп, узнаваемый HlyIIC-15 включает в себя сайт, узнаваемый тромбином.

Для подтверждения эпитопа узнаваемого HlyIIC-15 использовали иммуноблоттинг, в котором проверяли взаимодействие антител наряду с HlyIICTD с рекомбинатными белками PlcR [9], HlyII, делеционным вариантом HlyIIΔС и HlyIIR (репрессор гемолизина II) [10], а также нативным гемолизином II B cereus B771, клонированным в Bacillus subtilus BD170 (табл. 2). На рис. 3 продемонстрировано, что МА HlyIIC-15 способно образовывать иммунный комплекс с образцами, содержащими тромбиновый сайт и дополнительных шесть гистидиновых остатков, но не образует подобных комплексов с полноразмерным HlyII дикого типа, не содержащего ни тромбиновый сайт ни шесть гистидиновых аминокислотных остатков. Итак, для образования иммунного комплекса, исследуемого антитела с С-концевым участком HlyII в рекомбинантном белке, необходимо присутствие дополнительных районов, включающих шесть гистидиновых остатков, пептидный линкер и сайт, узнаваемый тромбином. Это предположение было подтверждено способностью МА HlyIIC-15 узнавать рекомбинантный транскрипционный регулятор PlcR B. cereus, содержащий тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок в N-концевой части этого белка. Дополнительным доказательством узнавания MA HlyIIC-15 района, расположенного за пределами C‑концевого домена HlyII, является способность образовывать иммунный комплекс рекомбинантного белка, лишенного CTD, но содержащего тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок в С-концевой части этого белка. В связи с тем, что HlyIIR, содержащий шесть гистидиновых остатков в N-концевой части, не способен образовывать иммунный комплекс с MA HlyIIC-15 можно заключить, что для узнавания МА своего антигена необходима область тромбинового сайта.

Рис. 3.

Иммуноблоттинг с использованием HlyIIC‑15. 1 – белки молекулярной массы, 2 – CTD, 3 – HlyII∆C, 4 – Гемолизин II B. cereus B771, клонированный в Bacilus subtilis, 5 – HlyII6His, 6 – HlyIIR, 7 – PlcR, 8 – PlcR, обработанный тромбином.

Рекомбинантные белки, содержащие тромбиновый сайт (HlyIICTD и PlcR) были обработаны тромбином. После чего электрофоретическая подвижность белков изменялась в сторону уменьшения молекулярного веса. Интенсивность окрашивания PlcR МА HlyIIC-15 также уменьшалась, что может свидетельствовать о снижении степени связывания антитела с антигеном при удалении части аминокислотных остатков, входящих в эпитоп. Анализ возможности взаимодействия рекомбинантных белков, содержащих тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок на разных концах рекомбинантных белков после обработки тромбином позволил подтвердить, что район узнавания MA HlyIIC-15 расположен в области тромбинового сайта. Как видно из рисунка PlcR, содержащий тромбиновый сайт с линкером и шестью гистидиновыми остатками на N-конце, после обработки тромбином снижает, но сохраняет способность окрашиваться HlyIIC-15, это позволило заключить, что MA HlyIIC-15 способно узнавать более широкий участок, чем определено фаговым дисплеем. Аналогичный результат получен после обработки тромбином HlyIICTD. По-видимому, ключевыми аминокислотными остатками эпитопа являются составляющие сайта узнавания тромбином и плюс, возможно, часть из района окружения этого сайта (рис. 4). После протеолиза тромбином рекомбинантного HlyIICTD, содержащего тромбиновый сайт с линкером и шестью гистидиновыми остатками на С-конце белок взаимодействовал с МА HlyIIC-15, что может однозначно указывать на узнавание этим антителом как минимум четырех аминокислотных оснований LVPR, входящих в состав тромбинового сайта (данные не приведены).

Рис. 4.

Сравнение участков аминокислотных последовательностей при их различной локализации: С-концевая локализация тромбинового сайта и N-концевая локализация тромбинового сайта. Жирными буквами обозначен сайт узнавания тромбином. / –указывает место протеолитической атаки тромбином. Заглавными буквами обозначен участок, содержащий шесть гистидиновых остатков.

Таким образом, район расположения экспериментально детектируемого эпитопа подтверждает определение этого эпитопа пептидным фаговым дисплеем. Четырех аминокислот LVPR достаточно для узнавания МА HlyIIC-15.

ОБСУЖДЕНИЕ

В течение долгого времени очистка и получение высокоочищенных белков было довольно затратным как по времени, так и затратам, особенно это касалось белков, взаимодействующих с мембранами. Применение современных генно-инженерных технологий частично решило эту проблему. Для получения рекомбинантных белков созданы многочисленные экспрессионные системы с промоторами, обеспечивающими высокий уровень транскрипции гибридных генов в различных бактериальных и грибных системах. В связи с тем, что вопрос как о потенциальной токсичности химических индукторов экспрессии, так и токсичности конечных искомых продуктов до сих пор остается открытым, широко используются ранее описанные варианты инициации биосинтеза, посредством индуктора или температурного сдвига. В этом случае последовательность целевого гена помещается под контроль эффективных фаговых промоторов [11–13]. Для повышения растворимости, уровня экспрессии, а также эффективной очистки аффинной хроматографией к N- или С-концам рекомбинантных белков присоединяют короткие маркерные аминокислотные последовательности, получившие название “fusion tags” [14]. Получение рекомбинантного белка в растворимой форме иногда удается решить присоединением вспомогательной последовательности – хорошо растворимого белка-партнера [15]. Однако, как в первом, так и во втором случае конечный продукт отягощен дополнительными белковыми участками и не является нативным продуктом. На передний план выходит цель в производстве различных рекомбинантных белков, отдельных субъединиц, а также полипептидов, восстановление конечных продуктов в нативном виде. Эта цель достигается введением дополнительных пептидных районов, узнаваемых высоко специфическими протеазами, которые способны отщеплять используемые тэги и восстанавливать рекомбинантные белки практически до нативного состояния. Создание технологии получения рекомбинантных белков или пептидов с использованием протеолитического расщепления всегда является задачей, требующей индивидуального решения для каждого продукта. Одной из часто используемых высокоспецифичных протеаз является тромбин. После фермент-зависимого протеолиза тромбин может быть легко удален посредством жидкостной хроматографии, предназначенной для очистки или удаления сериновых протеаз. Однако использование тромбина ограничивается лабораторными исследованиями [16]. Наиболее существенным недостатком протеазы является способ ее получения из плазмы крови млекопитающих.

Таким образом, в данной работе описано МА HlyIIC-15, выявляющее тромбиновый сайт за пределами структурной части клонированного белка, содержащего этот сайт. Результаты данной работы предполагают расширение возможностей использования тромбина и сайта его узнавания не только для отсечения дополнительных пептидных участков, но и в качестве маркера для идентификации и отслеживания различных рекомбинантных белков.

Учитывая, что тромбин активирует факторы свертывания крови V, VIII, VII, XI, XIII, протеин С, тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза [17], то есть они имеют в своем составе пептидные участки, узнаваемые этим белком, МА HlyIIС-15, связывающееся с участком разрезания тромбином, можно использовать для массового анализа образцов при исследовании различных патологий системы свертывания крови. Медицинская практика последних месяцев показала, что при инфекции COVID-19 у пациентов в тяжелой форме наблюдается образование странных тромбов в крови [18]. У ряда больных отмечались признаки сгущения крови и образования тромбов в разных органах. Нейрохирурги отмечают резкий всплеск инсультов из-за тромбов, а патологоанатомы наблюдали при вскрытии легкие, наполненные сотнями микротромбов. В связи с этим использование МА HlyII-15, может оказаться удачным инструментом в изучении и понимании процессов свертывания крови в ходе инфекции COVID-19.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы плазмиды и белки. E. coli BL21(DE3) (Novagen, Германия) была использована для трансформации pET29b(+) (Novagen, Германия), E. coli ER2738 для афинной селекции фагов.

Среды и растворы. Среды: 2YT (16 г/л бакто-триптон, 1 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, рН 7.0), 1.5% агар и 0.7% агар на основе 2YT. Растворы: 1000× IPTG/X-gal 1.25 г IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) и 1 г X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) в 25 мл DMF (dimethyl formamide), тетрациклин 20 мг/мл в 50% этаноле, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), PBST–PBS, содержащий 0.1% Tween-20, блокирующий раствор 1% желатин на основе PBS-T, преципитирующий раствор PEG/NaCl (20% (w/v) полиэтиленгликоль-6000, 2.5 M NaCl). Белковые маркеры (Abcam, Англия) и ДНК электрофорезные маркеры (Fermentas, Литва), конъюгат антител козла с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США), конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США).

Фаговая пептидная библиотека. В работе для определения эпитопа на молекуле HlyIICTD использовали библиотеку случайных пептидов из 12 аминокислотных остатков (New England Biolabs), отображаемых на фаге M13KE [21]. 12-Мерная фаговая пептидная библиотека имеет репертуар 10⁹, пептиды экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка pIII. Каждый клон в библиотеке представлен ~1000 копий.

Аффинная селекция бактериофагов, специфически взаимодействующих с МА HlyIIC-15, проводилась в соответствии с инструкцией к фаговой библиотеке с некоторыми модификациями. Для проведения всех трех раундов селекции МА HlyIIC-15 сорбировали на планшеты для иммуноферментного анализа (Greiner, high binding, США) из концентрации 10 мкг/мл в объеме 100 мкл в Na-карбонатном буфере рН 9.6, в течение ночи, при 4°С. Для каждого раунда использовали по 8 лунок. Для предотвращения возможной неспецифической сорбции иммунопланшеты инкубировали с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее к экспериментальным лункам добавляли по 10 мкл фаговой библиотеки с концентрацией частиц 3.8 × 10¹² частиц/мл. Инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации с фаговыми частицами иммунопланшеты отмывали не менее 10 раз PBST. Элюцию связавшихся фагов проводили добавлением в лунки 100 мкл суспензии клеток E. coli (штамм ER2738), находящихся в экспоненциальной фазе роста (OD₆₀₀ ~ 0.5) с последующей инкубацией при 37°С в течение 45 минут, на этом этапе происходило инфицирование клеток бактериофагами. Далее E. coli собирали из лунок и переносили в колбы с 20 мл среды 2YТ, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина и культивировали в течение ночи на качалке при 200 об./мин и 37°С для амплификации элюированных бактериофагов. Параллельно с этим определяли количество элюированных бактериофагов методом выращивания в полужидком агаре. После третьего раунда элюат не амплифицировали. Для изоляции отдельных фагов его титровали на чувствительной культуре и переносили индивидуальные негативные колонии фаговых клонов в пробирки с 5 мл среды 2YT, содержащей разведенную 1 : 100 ночную культуру ER2738. Проводили раздельную амплификацию фаговых клонов в течение ночи на термошейкере при 37°С.

Фаговые клоны, взаимодействующие с МА HlyIIC-15 наилучшим образом, были выбраны по результатам твердофазного иммуноферментного анализа их взаимодействия с сорбированными МА HlyIIC-15. Взаимодействие выявляли с помощью кроличьих поликлональных антител против М13 и антител козла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена. Бактериофаги этих клонов были использованы для выделения и секвенирования ДНК.

Выращивание бактериофагов в полужидком агаре. 5 мл среды 2YT с тетрациклином инокулировали 50 мкл ночной культуры E. coli (штамм ER2738) и культивировали при 37°С до плотности суспензии, соответствующей OD₆₀₀ ~ 0.5. Готовили чашки Петри с агаризованной средой (1.5% агар на основе 2YT) с IPTG/X-gal и тетрациклином. Полужидкий агар расплавляли на водяной бане и разливали по 3 мл в стерильные культуральные пробирки, поддерживая температуру 45°C. К 3 мл полужидкого агара добавляли 20 мкл суспензии E. coli в экспоненциальной фазе роста и 50 мкл препарата, содержащего бактериофаги (на этапе проведения раундов селекции – инфицированные клетки). В случае необходимости предварительно делали серийные разведения препаратов бактериофагов. Полученную смесь быстро выливали и распределяли поверх агаризованной среды. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С, после чего подсчитывали количество негативных колоний фаговых клонов – бляшек.

Выделение ДНК бактериофагов. Ночную культуру E. coli зараженных индивидуальными клонами бактериофагов центрифугировали 10 минут при 5000 × g, 4°C. Бактериофаги выделяли из супернатанта путем осаждения полиэтиленгликолем MW 6000 в присутствии высокой концентрации NaCl [21]. Концентрацию фаговых частиц в супернатанте определяли спектрофотометрически при длине волны 269 нм и рассчитывали по формуле [ф.ч.] = (2 × 10¹⁴ × А₂₆₉)/30. Одноцепочечную ДНК индивидуальных клонов выделяли методом фенольной экстракции с последующим осаждением этиловым спиртом [22].

Секвенирование ДНК. Анализ последовательностей ДНК потомков фаговых клонов для определения последовательностей встроек проводили в компании Евроген. Обработка результатов секвенирования производилась в программах Gene Runner, ClustalW.

Наработка липосом. Липосомы готовили из раствора лецитина в концентрации 1 мг/мл в смеси хлороформа и метанола (молярное отношение, 2 : 1). После сушки под вакуумом, липидную пленку ресуспендировали в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 7.2, 100 мМ КСl) до общей концентрации липидов 1 мг/мл. Липосомы получали обработкой ультразвуком в течение 30 мин на льду [4]. Олигомерные формы HlyIICTD выявляли после электрофоретического разделения смеси HlyIICTD (9 мкМ) с липосомами, предварительно инкубированными в течение 1 часа, при 37°С, и переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующим окрашиванием МА HlyIIC-15.

Иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение белков в исследуемых препаратах проводили в присутствии β-меркаптоэтанола как в работе [23]. Перенос на нитроцеллюлозную мембрану проводили в течение 15 ч при силе тока 20 мА в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 0.25 М глицин, 0.1% додецилсульфат натрия, 20% метанол, pH 8.3. Центры неспецифической сорбции блокировали добавлением 1% (w/v) раствора желатина в PBST в течение 30 мин. Далее мембраны инкубировали в течение 2 ч с МА HlyIIC‑15 (10 мкг/мл). После инкубации с антителами мембраны обрабатывали 1 ч конъюгатом пероксидазы хрена с кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши в разведении согласно рекомендации производителя (Thermo Scientific, США) в PBST. На каждой стадии нитроцеллюлозные мембраны тщательно отмывали PBST. Мембрану окрашивали раствором, содержащим 3 мМ диаминобензидина-3,3 тетрагидрохлорида (Sigma-Aldrich, США) и 0.03% перекиси водорода.