Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 1, стр. 3-28

ВВЕДЕНИЕ

Грамположительные бактерии Streptococcus pneumoniae (пневмококк) вызывают тяжелые инвазивные и неивазивные заболевания у детей и взрослых и способны персистировать на слизистой оболочке носоглотки здоровых носителей, не вызывая клинических проявлений инфекции. Большая часть штаммов пневмококка окружена полисахаридной капсулой. На основе структурно различающихся между собой капсулярных полисахаридов (КП), экспрессируемых S. pneumoniae, идентифицировано более 90 серотипов пневмококка [1–3].

По критерию тяжести течения пневмококковые инфекции можно разделить на инвазивные и неинвазивные. К инвазивным пневмококковым инфекциям традиционно относят бактериемию, менингит, пневмонию и другие патологические состояния, при которых возбудитель выделяют из обычно стерильных органов и тканей (кровь, цереброспинальная жидкость, реже – синовиальная, плевральная и перикардиальная жидкости). Среди неинвазивных форм болезни выделяют инфекции верхних дыхательных путей (средний отит, параназальный синусит), нижних дыхательных путей (бронхит), а также другие относительно редко регистрируемые инфекции (конъюнктивит, перитонит, артрит, полиартрит и др.). Инвазивные пневмококковые заболевания могут завершаться летально, особенно у детей младшего возраста, пожилых людей и иммунокомпрометированных лиц [4, 5]. Тяжесть течения пневмококковой инфекции зависит от серотипа S. pneumoniae [6–11]. Так, S. pneumoniae серотипов 3, 6B, 19A, 19F и 23F имеют хорошо развитую капсулу, относятся к серотипам с низкой инвазивной активностью и вызывают заболевания, ассоциированные с высоким риском летального исхода, преимущественно у иммунокомпрометированных лиц. Серотипы 1, 7F, 4, 9N, 9V и 14 со средним или высоким инвазивным потенциалом и тонкой капсулой наиболее часто вызывают заболевания у здоровых лиц, действуя как первичные патогены [12, 13].

Эпидемиология S. pneumoniae. Частота распространения различных серотипов пневмококка зависит от локализации инфекции, географического местоположения, возраста [6]. Серотипы пневмококка значительно различаются по вирулентности [6, 7, 14–17]. По данным ВОЗ, в 2007 г. ~80–90% всех пневмококковых заболеваний вызывали 20 серотипов S. pneumoniae [18, 19].

В ряде публикаций приведены данные о распространенности различных серотипов пневмококка в США, Азии, Африке, Европе, Латинской Америке, Австралии, Новой Зеландии, Беларуси, Украине и России в разные годы среди детей и взрослых [20–28]. В 2012 г. проведено масштабное эпидемиологическое исследование в шести странах Юго-Восточной Азии по изучению распространенности различных серотипов S. pneumoniae. Наиболее часто выделяли серотипы 1, 3, 6B, 14, 19A, 19F и 23F. Существенных различий в доминировании того или иного серотипа в зависимости от региона не выявлено [29].

Показано, что из крови пациентов выделяли преимущественно серотипы 1 и 14, из цереброспинальной жидкости – серотипы 6, 10 и 23, из отделяемого среднего уха детей – серотипы 3, 19 и 23 [8]. Серотипы 6A, 6B, 14, 19F и 23 рассматривают как основные “педиатрические” штаммы пневмококка [4, 30]. В США у детей младшего возраста 80% менингитов вызывали серотипы 14, 6В, 19F, 18С, 23F и 9V, а у детей старше 6 лет на их долю приходилось лишь 50% всех изолятов [6, 31–34].

В Японии с 2011 по 2013 гг. у взрослых с заболеваниями респираторного тракта обнаруживали серотипы 3, 4, 19F и 23F [35]. В двух других исследованиях, проведенных в этом же географическом регионе, доминировал серотип 3 [36, 37]. В 2014–2016 гг. на юго-востоке Аравийского полуострова при инвазивных пневмококковых заболеваниях преобладали серотипы 3, 12, 15, 19A и 19F [38].

В Корее и Испании наиболее часто выявляли штаммы серотипов 3, 6, 11, 19 и 23 [39, 40]. В другом исследовании показано, что в Испании с 2001–2014 гг. преобладали серотипы 1, 3, 7F и 19A. Чаще всего у пациентов с осложнениями, развившимися в период пребывания в стационаре, выявляли S. pneumoniae серотипа 3. Наиболее часто из серотипов, не входящих в состав вакцины Prevnar 13^® (Pfizer), выявляли серотип 22F. Показано, что значительная часть взрослых, вакцинированных в детстве против пневмококка, болела внебольничной пневмонией, вызванной серотипами, входящими в состав вакцин, которыми они были привиты в детском возрасте. Это определяет необходимость разработки стратегии вакцинации для снижения заболеваемости у взрослых [41]. В США причиной среднего отита чаще всего были серотипы 3, 6, 14, 18, 19 и 23 [30, 42].

При оценке распространенности различных серотипов пневмококка на территории России у детей при носительстве доминировали серотипы 3, 6, 9, 14, 19, 23, в меньшей степени – серотипы 7 и 18 [21]. При остром среднем отите с наибольшей частотой обнаруживали серотип 19, реже серотипы 3, 4, 6, 8, 9, 14, 15, 20, 22 и 23. Преобладающими у детей с внебольничной пневмонией были серотипы 19, в меньшей степени – серотипы 6, 14 и 23; при инвазивной пневмококковой инфекции – серотипы 5 и 1, выделенные из ткани легкого. Преобладающими серотипами, вызывающими инвазивные инфекции, были 8, 19 в заметно меньшей степени, 1, 5 и 23. Распространение серотипов 3, 6, 15 и 19 среди детей с пневмококковыми инфекциями также было отмечено и в других исследованиях [43]. Штаммы были чувствительны к пенициллину, за исключением всех штаммов, относящихся к серотипу 19 [21]. Это согласуется с данными других авторов, которые свидетельствуют о том, что современные штаммы S. pneumoniae чувствительны к пенициллину, но устойчивы к макролидам (эритромицин) [38].

Сведения о серотиповом пейзаже пневмококков в Москве ограничены. В Москве в 2000–2007 гг. среди штаммов пневмококка, полученных от больных пневмококковым менингитом, во всех возрастных категориях доминировали серотипы 3, 6 и 19. Ведущими серотипами на территории Москвы являлись серотипы 1, 3, 4, 6B, 6A, 7F, 15A, 15B, 18C и 19F, на долю которых приходилось 63% исследованных штаммов. Сравнение серотипового пейзажа возбудителей, выделенных в 1980–1999 гг., со штаммами 2000–2012 гг. показало различие структуры и долевого участия доминирующих серотипов. Если среди штаммов 1980–1999 гг. преобладающими серотипами (в порядке уменьшения значимости) были 1, 3, 19F, 6A, 7F, 12F, 18C и 19A, то среди культур 2000–2012 гг. доминировали серотипы 3, 19F, 6B, 7F, 15A, 15B, 1, 4 и 6A [44].

Таким образом, сегодня в мире наибольшее клиническое значение имеют серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6A/B, 7F, 8, 9, 11, 12, 14, 15A/B, 18C, 19A/F, 20, 22 и 23F, в России – серотипы 1, 3, 4, 6A/B, 7F, 12, 14, 15A/B, 18C и 19F (серотипы, выделенные жирным шрифтом, встречаются с наибольшей частотой). Очевидно, что этот набор штаммов может со временем изменяться, в том числе расширяться из-за увеличения эпидемиологической значимости других серотипов пневмококков.

Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции. Успех вакцинопрофилактики инфекций, вызываемых S. pneumoniae, во многом зависит от степени соответствия серотипного состава вакцины спектру циркулирующих штаммов пневмококка в регионе применения вакцины. В контролируемом испытании 13-валентной конъюгированной пневмококковой вакцины у детей уровни сывороточных антител ко всем серотипам, входящим в состав вакцины, увеличивались после иммунизации во всех возрастных группах. Образование антител, индуцированных к КП серотипов 6A, 14, 19F и 23F, было слабым у детей до 4.5 лет [45].

При проведении первой фазы клинических испытаний 20-валентной конъюгированной пневмококковой вакцины, содержащей семь новых серотипов пневмококка (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F и 33F) и предназначенной для расширения спектра действия уже существующих конъюгированных вакцин (Prevnar 7^®, Synflorix^® (GSK) и Prevnar 13^®), отмечено повышение опсонофагоцитарной активности и концентрации IgG-антител к КП всех серотипов пневмококка, входящих в состав соответствующей вакцины [46].

При проведении клинических испытаний у детей 10-валентной конъюгированной пневмококковой вакцины Synflorix^® (зарегистрирована в России), содержащей в своем составе КП S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F и 23F, каждый из которых был индивидуально конъюгирован с протеином D, выделенным из Haemophilus influenzae, существенно повышалась концентрация IgG-антител к КП серотипов, входящих в состав вакцины [47]. Вакцинация способствовала уменьшению количества эпизодов инфекции, вызванных вакцинными штаммами, но существенно не влияла на возникновение заболеваний, вызванных невакцинными серотипами пневмококка.

Наибольшее количество эпизодов пневмококкового отита вызвали серотипы 3 (37 случаев), 6B (27 случаев), 14 (23 случая), 19F (67 случаев) и 23F (23 случая). В отношении всех серотипов, за исключением серотипа 3, установлен существенный защитный эффект вакцинации, который варьировал от минимального (в отношении серотипа 19F – 44.4%) до максимального (в отношении серотипа 14 – 95.5%). Что касается серотипа 3, то общее количество эпизодов острого среднего отита в группе, получавшей пневмококковую вакцину, и в контрольной группе составило 20 и 17 соответственно [48]. Отмечено повышение титров антител к КП пневмококка и их опсонизирующей активности [49]. Показано, что в предупреждении острого среднего отита ключевое значение имеют антитела IgG с высокой опсонофагоцитарной активностью, тогда как титр антител не является достаточно информативным показателем [50]. Shiramoto et al. показали, что иммуногенность вакцин Prevnar 13^® и Pneumovax^® 23 (Merck) у лиц пожилого возраста, которую оценивали по титру антител и их опсонофагоцитарной активности, была ниже для КП серотипа 3 по сравнению с другими серотипами пневмококка, причем при введении обеих исследованных вакцин [51]. При иммунизации полисахаридной пневмококковой вакциной не наблюдалось повышения титра антител к КП S. pneumoniae серотипа 3 у лиц старше 65 лет и взрослых лиц молодого возраста, тогда как к другим исследованным серотипам (1, 5, 6B, 8, и 14) титр антител в обеих группах повышался [52]. На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что иммуногенность КП различных серотипов пневмококка неодинакова [53].

СТРОЕНИЕ КАПСУЛЯРНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ S. pneumoniae И СИНТЕЗ РОДСТВЕННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН

Разрешенные сегодня к применению пневмококковые вакцины производят при использовании бактериальных КП актуальных серотипов пневмококка или конъюгируют КП с белком-носителем с последующим добавлением адъюванта. КП выделяют из культуральной среды после инактивации патогена [54]. Недостатком традиционных вакцин на основе КП пневмококка является необходимость работы с микробной культурой вирулентных штаммов пневмококка. Очистка КП от бактериальных примесей является весьма трудоемкой, а конъюгация с белком-носителем, необходимая для индукции Т-зависимого иммунного ответа с образованием опсонизирующих IgG-антител и иммунологической памяти – не всегда успешной. Выделенный из культуральной среды КП, даже после проведения очистки, содержит примесь антигенов бактериальной клетки, таких как полисахарид клеточной стенки (тейхоевая кислота или С-полисахарид), нуклеиновые кислоты и др. В результате получают продукт, который химически неоднороден, что может служить препятствием при последующей его конъюгации с белком-носителем [54, 55].

Бактериальные КП состоят из повторяющихся олигосахаридных звеньев различной длины [56], состоящих в случае S. pneumoniae, например, из двух (серотип 3) или восьми (серотип 17А) моносахаридных остатков [57]. Антитела, индуцированные к одному эпитопу КП, могут быть протективными, а к другому – нет. Низкая эффективность КП может быть связана в ряде случаев с индивидуальными особенностями отдельных КП, в том числе с возможными различиями конформационных характеристик КП в составе бактериальной капсулы и в составе вакцины. Это, в свою очередь, может приводить к различию эпитопной специфичности антител, индуцируемых пневмококком и вакциной.

Эпитопы КП S. pneumonie могут быть представлены на синтетических олигосахаридах [30], которые также конъюгируют с белком-носителем традиционными химическими методами для получения полусинтетической вакцины. В настоящее время синтезированы олигосахариды для серотипов 1–4, 6А/B, 7F, 8, 9A/V, 12, 14, 17F, 18C, 19A/F, 22F, 23F, 27 и 29 [58, 59]. Для получения олигосахаридов, содержащих несколько повторяющихся единиц, соответствующих структуре КП, используют методы гидролиза КП, химический синтез и биосинтез [58, 59]. Некоторые олигосахариды успешно получены путем гидролиза. Недостатком этого метода являются трудности контролируемого получения олигосахаридов с точки зрения химической структуры, длины олигосахарида и присутствия бактериальных примесей. Химический синтез нескольких повторяющихся звеньев олигосахарида стал доступным, но он достаточно сложный и требует проведения большого количества стадий синтеза. Комбинация химического синтеза и биосинтеза является альтернативным методом, который позволяет получать большие количества олигосахаридов с большой длиной цепи. Информация о биосинтезе синтетических аналогов КП серотипов 3, 14 и 19F известна [58].

Иммунный ответ на олигосахариды является высокоспецифичным. Интересно, что некоторые олигосахариды, конъюгированные с белком-носителем, индуцируют даже более высокий титр антител к КП, чем соответствующие конъюгаты КП [60]. Идентификация иммуногенных гликотопов КП S. pneumoniae, обеспечивающих протективные свойства гликоконъюгатных пневмококковых вакцин, является способом повышения их эффективности. Использование коротких олигосахаридов, полученных путем химического синтеза, дает лучшую, чем в случае крупных олигосахаридов или полисахаридов, возможность провести контролируемую конъюгацию и оценить иммуногенность вакцин при варьировании их специфических структурных параметров, например, длины олигосахаридного фрагмента и соотношения углевод/белок [61]. Таким образом, синтетические олигосахариды являются привлекательной альтернативной гетерогенным препаратам очищенных бактериальных КП, на основе которых получены первые коммерческие пневмококковые вакцины [62, 63]. Иммуногенные свойства гликоконъюгатов могут быть оптимизированы за счет использования синтетических антигенных структур, способных вызывать образование протективных антител [52].

В 2015 г. нами был опубликован обзор, посвященный подходам к созданию пневмококовых вакцин на основе синтетических олигосахаридных лигандов, относящихся к углеводным вакцинам третьего поколения [55]. В последние годы работы в данном направлении активно развиваются, и в настоящем обзоре мы рассматриваем все серотипы пневмококка, для которых получены синтетические фрагменты КП и проводятся иммунологические исследования с их участием. Особое внимание уделено наиболее “проблемным” КП некоторых актуальных серотипов пневмококка с большим акцентом на исследования последних лет.

S. pneumoniae серотипа 1. КП высокоинвазивного серотипа 1 имеет особое химическое строение и содержит редкий моносахарид – 2-ацетамидо-4-амино-2,4,6-тридеокси-D-галактозу (D-AAT) (1) [64] (рис. 1). Отмечают, что КП серотипа 1 в составе пневмококковых вакцин является недостаточно эффективным [65]. Показано, что коммерческая гликоконъюгатная вакцина Prevnar 13^® индуцирует низкий уровень функциональных антител к КП серотипа 1 (1) вследствие возможной модификации протективных эпитопов КП (в частности, аминогрупп) в процессе химической активации и конъюгации с белком-носителем. При химической обработке КП серотипа 1 (1) может происходить его деполимеризация и, как следствие, снижение эффективности КП (1) в составе пневмококковых вакцин. Установлено, что при конъюгации белка-носителя с моносахаридом (1) существует риск деструкции иммуногенных эпитопов [54, 66].

Синтетические олигосахаридные антигены могут быть получены таким образом, что при конъюгации с белком-носителем протективные эпитопы остаются интактными. Олигосахариды (2–5), соответствующие фрагментам цепи КП серотипа 1 (рис. 1), были синтезированы рядом авторов [67–71]. Показано, что остаток D-AAT важен для распознавания КП (1). Так, в опытах по изучению взаимодействия синтетических лигандов (2–5) с антителами сыворотки, специфичной к КП (1), установлено, что наилучшим образом связывался именно трисахарид (4), соответствующий полному повторяющемуся звену, в то время как дисахарид (5), не содержащий остатка D-AAT, связывался значительно слабее, а моносахариды (2) и (3) не связывались совсем.

Восстановлением дисульфидной группы в трисахаридном производном (4) до тиольной и последующим взаимодействием с белком CRM197 был получен вакцинный гликоконъюгат (6). В используемых условиях не затрагивается аминогруппа в составе D-AAT. При иммунизации кроликов конъюгат (6) индуцировал образование высоких титров антител, специфичных к КП (1), трисахариду (4), а также связывающихся непосредственно с D-AAT (3). При этом титры антител к КП (1) при иммунизации конъюгатом (6) оказались выше, чем в контрольных опытах с Prevnar 13^® [64]. С помощью проточной цитометрии показано, что антитела, индуцированные конъюгатом (6), лучше связываются с пневмококками серотипа 1, чем антитела, полученные после иммунизации с помощью Prevnar 13^®. Антигенсвязывающая способность антител коррелировала с опсонофагоцитарной киллерной активностью. Так, пуловая сыворотка кроликов к конъюгату (6) обладала более высокой активностью в отношении пневмококков серотипа 1, чем сыворотка к Prevnar 13^®. Более того, антитела, индуцированные конъюгатом (6), обладали лучшей опсонизирующей способностью, чем стандартная сыворотка 007sp, рекомендуемая ВОЗ для оценки эффективности пневмококковых вакцин [72]. Антитела к белку-носителю (CRM197) не связывались с S. pneumoniae серотипа 1.

Протективную активность иммунных сывороток оценивали в опытах по пассивной иммунизации мышей, подсчитывая количество бактериальных клеток в крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости после заражения. В качестве групп сравнения использовали сыворотку кроликов, иммунизированных Prevnar 13^® и CRM197. При анализе крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости введение сыворотки к конъюгату (6) выявило существенное снижение бактериальной нагрузки по сравнению с сыворотками к Prevnar 13^® и CRM197. Таким образом, синтезированный конъюгат (6) является перспективным кандидатом для вакцины против S. pneumoniae серотипа 1 и превосходит по своим протективным характеристикам конъюгат соответствующего КП в составе коммерческой вакцины Prevnar 13^® [64].

S. pneumoniae серотипа 2. S. pneumoniae серотипа 2 относится к инвазивным штаммам пневмококка, но его КП (7) не входит в состав коммерческих конъюгированных пневмококковых вакцин. Для определения структуры протективного олигосахаридного эпитопа была синтезирована серия фрагментов (8a–13a) повторяющегося звена, а также гексасахарид (14a), соответствующий одному повторяющемуся звену КП серотипа 2 [73] (рис. 2). В экспериментах по связыванию этих олигосахаридов с сыворотками, специфичными к КП серотипа 2 (7), было показано, что для эффективного взаимодействия важно присутствие боковой цепи α-D-GlcA-(1→6)-α-D-Glc-(1→2) (8a). Был получен конъюгат гексасахарида (14a) с CRM197 (14b), который стимулировал Т-зависимый и В-клеточный ответ с образованием опсонизирующих антител у мышей, что приводило к киллингу инкапсулированных бактерий вследствие усиления активности фагоцитов. Подкожная имммунизация гликоконъюгатом (14b) защищала мышей от интраназального заражения высоковирулентным штаммом серотипа 2 NCTC 7466, снижая бактериальную нагрузку в легочной ткани и крови [73].

S. pneumoniae серотипа 3. КП этого серотипа пневмококка (15) характеризуется низкой иммуногенностью [52, 53, 74]. Одной из причин низкой иммуногенности КП серотипа 3, по мнению Choi et al., является необычный путь синтеза его КП (15) [75] (рис. 3). В настоящее время установлен механизм синтеза КП для всех известных 94 серотипов пневмококка. Существуют два пути синтеза КП: синтаза-зависимый и wzy-зависимый [76–79]. Главное различие между ними состоит в том, что при wzy-зависимом синтезе КП ковалентно связан с пептидогликаном клеточной стенки бактерий, тогда как при синтаза-зависимом пути он может отделяться от клеточной стенки. Для большинства серотипов S. pneumoniae синтез КП происходит по wzy-зависимому пути, и штаммы только двух серотипов 3 и 37 синтезируют КП по синтаза-зависимому пути [77, 80]. S. pneumoniae серотипа 37 крайне редко встречается у человека, тогда как серотип 3 является клинически значимым [81]. Показано, что КП S. pneumoniae серотипа 3 (15) может быть связан с бактериальной стенкой и одновременно находится в растворенном состоянии в культуральной среде [82]. При культивировании in vitro S. pneumoniae серотипа 3 и при заражении мышей происходит высвобождение в окружающую среду большего количества КП по сравнению с другими серотипами пневмококка, что приводит к уменьшению антителозависимого киллинга бактерий и снижению защиты от заражения путем связывания свободных антител с КП. Не исключено, что КП, с которым связались антитела, также может отделиться от бактерии и поступить в окружающую среду, снижая защитные свойства антител.

Изменения в структуре бактериального КП S. pneumoniae серотипа 3 (15) могут отразиться на качестве вакцинных препаратов. Для устранения этого недостатка перспективным является использование синтетических олигосахаридов – фрагментов КП S. pneumoniae серотипа 3 (15), конъюгированных с белком-носителем.

Работы по синтезу фрагментов КП пневмококков серотипа 3 (15) были фактически первыми исследованиями в области полусинтетических конъюгированных углеводных вакцин [55]. Показано, что для выработки протективного иммунитета необходимо присутствие в вакцинном конъюгате остатка глюкуроновой кислоты [55, 83]. Позднее были получены конъюгаты с белком-носителем CRM197 синтетических моносахаридов (16a) и (17a), дисахарида (19a), трисахарида (20a) и тетрасахарида (22a), соответствующих фрагментам повторяющихся звеньев КП S. pneumoniae серотипа 3 [61] (рис. 3). Все мыши, иммунизированные синтезированными конъюгатами (20b) и (22b), продуцировали IgG-антитела, способные связываться с КП (15). Сравнимые титры специфичных антител в случае конъюгата дисахаридного лиганда (19b) наблюдались у 75% исследованных мышей. Все животные, в сыворотке которых присутствовали антитела к КП (15), выжили после заражения летальной дозой S. pneumoniae серотипа 3. Таким образом, было подтверждено, что дисахаридный фрагмент (19) достаточен для выработки защитного иммунитета к пневмококкам серотипа 3 у мышей.

Следует отметить, что в отличие от мышей, для индукции оптимального иммунного ответа у человека требуются более длинные олигосахариды, в первую очередь потому, что конформационные эпитопы лучше презентируются клеткам иммунной системы [84]. В то же время возможность индукции Т-зависимого иммунного ответа увеличивается с уменьшением длины олигосахаридной цепи. Поэтому для наилучшей презентации олигосахаридные эпитопы должны иметь и иммуногенную конформацию, и оптимальную длину. При этом длина олигосахаридов должна быть, с одной стороны, достаточной для экспрессии конформационных эпитопов, с другой стороны – не слишком большой для индукции Т-зависимого ответа [30].

В другом исследовании была синтезирована группа лигандов (16a–22a), которые были иммобилизованы на подложке с образованием соответствующего гликоряда (GlycoArray). C использованием этого инструмента был проведен автоматизированный скрининг (Glucan Array Assay) двух протективных моноклональных антител (mAb), специфичных к КП S. pneumoniae серотипа 3 (15) [62]. Оба антитела распознавали КП S. pneumoniae серотипа 3 в ходе автоматизированного скрининга, а наилучшее связывание обоих mAb наблюдали в случае тетрасахарида (22a). Несколько слабее рассматриваемые mAb связывались с трисахаридами (20a) и (21a), при этом наблюдалось различие в специфичности между двумя mAb. Однако ни одно из mAb не связывалось с дисахаридами (18a) и (19a). Поэтому в дальнейшем в качестве возможной вакцины исследования были проведены с тетрасахаридным конъюгатом (22b).

Иммунизация конъюгатом (22b) приводила к выработке защитных антител, что было показано в тестах на опсонизирующую способность и на модели экспериментальной пневмонии при пассивной иммунизации мышей с последующим заражением S. pneumoniae серотипа 3. По данным MALDI-TOFF-масс-спектрометрии, полученный конъюгат (22b) содержал в среднем шесть тетрасахаридных гаптенов на одну молекулу CRM197 [85]. Для определения иммуногенности тетрасахарида мышей иммунизировали подкожно с интервалом 28 дней двумя дозами гликоконъюгата (22b) с адъювантом Фрейнда или с гидроксидом алюминия. Использование гидроксида алюминия является предпочтительным по сравнению с фосфатом алюминия, который входит в состав гликоконъюгатных вакцин, т.к. гидроксид при нейтральных значениях рН лучше адсорбирует конъюгат CRM197, содержащий отрицательно заряженные олигосахариды S. pneumoniae серотипа 3 [86].

Иммунизированные мыши вырабатывали IgG-антитела, которые специфически связывались с тетрасахаридом (22c), что демонстрирует иммуногенность выбранного лиганда. Переключение иммунного ответа с IgM на IgG в ответ на введение бустерной дозы указывали на образование Т‑зависимого иммунного ответа. Однако иммуногеннность конъюгированного тетрасахарида в значительной степени зависела от использованного адъюванта. Гликоконъюгат (22b) с адъювантом Фрейнда индуцировал образование более высокого титра антител по сравнению с использованием гидроксида алюминия [62].

Сыворотка, полученная от мышей, иммунизированных конъюгатом (22b), вызывала дозозависимый киллинг пневмококка, демонстрируя, что гликоконъюгат индуцирует образование опсонизирующих антител. Титр антипневмококковых антител, так же как и опсонофагоцитарная активность, зависел от использованного адъюванта. Адъювант Фрейнда вызывал образование более высокого титра антител с высокой киллерной активностью в тесте опсонофагоцитоза по сравнению с использованием гидроксида алюминия. Протективную активность тетрасахаридного конъюгата (22b) в отношении пневмококковой пневмонии исследовали при использовании известной модели [87, 88].

Поскольку адъювант Фрейнда не используют при создании вакцин, авторы вводили гликоконъюгат (22b), адсорбированный на гидроксиде алюминия, и гликоконъюгат (22b) без адъюванта. Иммунизация конъюгатом (22b), адсорбированным на гидроксиде алюминия, значительно уменьшала тяжесть течения заболевания. Пневмококковая пневмония существенно увеличивала проницаемость легких у контрольных животных и мышей, иммунизированных конъюгатом (22b) без адъюванта. Использование конъюгата (22b), адсорбированного на гидроксиде алюминия, сохраняло целостность альвеолярного барьера, снижало бактериальную нагрузку в легких, а также практически полностью предотвращало развитие бактериемии по сравнению с контролем и гликоконъюгатом (22b) без адъюванта. Антибактериальная защита сопровождалась увеличением количества лейкоцитов и снижением продукции цитокинов в альвеолярном компартменте (compartment) у инфицированных пневмококком мышей. Индукция длительного иммунитета является важным показателем успешной вакцинации. Через 4 месяца защита от инфекции была меньше, чем при заражении на 35-й день после иммунизации. Для изучения способности конъюгата (22b) индуцировать длительную иммунную защиту в отношении пневмококков серотипа 3 проводятся дополнительные испытания. Ранее было показано, что в некоторых случаях для возникновения длительной иммунной памяти необходимо удлинение углеводного лиганда [62].

Авторами данного обзора были также синтезированы олигосахариды (19a), (20a), (22a) и их конъюгаты с биотином (19с), (20с) и (22с) соответственно (статья готовится к печати). Было показано, что биотинилированные производные (19с), (20с) и (22с), предварительно иммобилизованные на покрытых стрептавидином микропланшетах, стимулировали продукцию IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFNγ, IL-17A и TNFα, но не IL-6 и GM-CSF, в монокультуре спленоцитов мышей. Конъюгат тетрасахарида (22с) наиболее эффективно стимулировал выработку IL-4, IL-5, IL-10 и IFNγ, которые способствуют экспрессии специфических изотипов иммуноглобулинов. Конъюгат с BSA (22d), адсорбированный на гидроксиде алюминия, вызывал образование высоких уровней антител классов IgM, IgG1, IgG2a и IgG2b. Определить содержание анти-КП-индуцированных антител можно было только с помощью биотинилированного тетрасахарида (22c). Конъюгат (22d) обладал самой высокой способность связывать IgG-антитела в иммунных сыворотках мышей к гликоконъюгатам и антибактериальной сыворотке кроликов. Сыворотки к конъюгату (22d) способствовали большему фагоцитозу бактерий нейтрофилами и моноцитами, чем антисыворотка к конъюгату полисахарида (15) КП–CRM197. Сыворотка мышей, иммунизированных конъюгатом тетрасахарида (22d), демонстрировала самый высокий титр IgG1-антител к КП по сравнению с сыворотками мышей, иммунизированных теми же дозами конъюгатов ди- (19d) и трисахарида (20d). При внутрибрюшинном заражении летальной дозой S. pneumoniae серотипа 3 конъюгаты три- (20d) и тетрасахарида (22d) защитили мышей с большей степенью достоверности по сравнению с конъюгатом дисахарида (19d). На основании проведенных исследований показано, что тетрасахаридный лиганд (22a) является оптимальным кандидатом для разработки полусинтетической вакцины против S. pneumoniae серотипа 3 и диагностических тест-систем.

Были также синтезированы более длинные фрагменты КП серотипа 3 (15), включающие в себя до четырех повторяющихся звеньев этого полисахарида (соединения (23a–26a)) [89]. Среди этих лигандов были олигосахариды, содержащие на невосстанавливающем конце как остаток глюкозы (23a, 24a), так и остаток глюкуроновой кислоты (25a, 26a). Были получены конъюгаты этих соединений с BSA (23d–26d) и столбнячным анатоксином (23e–26e). Конъюгаты (23e–26e) и свободные олигосахариды (23a–26a) были использованы для иммунизации мышей, в то время как конъюгаты с BSA (23d–26d) применялись как покрывающие антигены при анализе полученных после иммунизаций сывороток методом ИФА. Сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатами столбнячного анатоксина (23e–26e), содержали гораздо большие титры специфичных антител, чем антисыворотки к свободным олигосахаридам (23a–26a). Примечательно, что титры специфичных антител, индуцированных пента- и гексасахаридными конъюгатами (23e и 25e соответственно), существенно превосходили аналогичные титры, полученные в случае окта- и гептасахаридных конъюгатов (24a и 26a соответственно), что свидетельствует о том, что дальнейшее увеличение длины углеводных лигандов отрицательно сказывается на иммунологических свойствах конъюгатов [89].

S. pneumoniae серотипа 4. В структуре КП пневмококков серотипа 4 (27) содержится редкий и лабильный заместитель (циклический пируватный кеталь) на терминальном остатке галактозы на восстанавливающем конце. Недавно Seeberger et al. синтезировали большой набор фрагментов этого полисахарида (28a–35a) (рис. 4), среди которых были олигосахариды разной длины, а также соединения, с помощью которых предполагалось установить, насколько критичным является наличие пируватного заместителя [90, 91].

Антитела в референсной сыворотке человека, специфичной к КП серотипа 4 (27), распознавали в равной степени как олигосахариды, содержащие пируватный фрагмент, так и олигосахариды с незамещенными остатками галактозы. Тетрасахарид (35a) обладал наивысшей аффинностью и кросс-реактивностью в отношении КП (27) при исследовании сывороток мышей и человека, иммунизированных КП серотипа 4 (27). Поскольку антитела сыворотки человека распознавали также олигосахариды без пируватного заместителя (29a, 34a), исследователи предположили, что в природном КП также могут встречаться звенья, не несущие пируватного заместителя в остатке галактозы. Однако не содержащие пирувата эпитопы могут быть менее иммуногенными, о чем свидетельствует более слабое связывание антител с олигосахаридами (29a) и (34a) по сравнению с тетрасахаридом (35a), содержащим пируват. Для проверки этой гипотезы были синтезированы конъюгаты (29b) и (34b), лиганды которых не содержали пируватного заместителя. Антитела, полученные при иммунизации мышей конъюгатами (29b) и (34b), не распознавали КП серотипа 4, что свидетельствует о важности присутствия пирувата для выработки специфичного иммунитета [90, 91].

S. pneumoniae серотипа 5. Серотип 5 вызывает инвазивные пневмококковые заболевания у детей во всем мире [11, 92]. Коммерческие гликококонъюгатные вакцины производят из нативных или деполимеризованных КП [93] и конъюгируют с белком-носителем. Однако была выявлена их недостаточная эффективность в предупреждении инфекций, вызываемых серотипом 5 [94]. Повторяющееся звено КП серотипа 5 (36) (рис. 5) содержит два редких моносахаридных остатка: 2-ацетамидо-2,6-дидеокси-D-ксилоза-гексоза-4-улоза (Sugp) и N-ацетил-L-пневмозамин (L-PneupNAc). КП серотипа 5 (36), так же как КП серотипа 1 (1), является слабым звеном существующих пневмококковых вакцин (он входит в состав 10- и 13-валентных вакцин), т.к. в процессе его выделения из бактериальных источников и очистки для получения конъюгированной вакцины кетогруппа остатка Sugp подвергается частичному или полному восстановлению, что приводит к получению гетерогенного продукта со сниженной иммуногенностью по сравнению с нативным КП серотипа 5 (36) [95, 96].

Предварительные исследования с использованием большой группы моно- и дисахаридных фрагментов повторяющегося звена полисахарида (36) и стандартных сывороток кролика и человека для типирования пневмококков серотипа 5 показали, что наиболее важным для распознавания является ответвление GlcA-PneuNAc [95]. Попытки синтезировать повторяющееся звено КП (36) оказались неудачными, т.к. кетогруппа в остатке Sugp крайне нестабильна, и продукт не удалось выделить в чистом виде.

По данным проведенного автоматизированного скрининга, остаток Sugp не являлся иммунодоминантным, поэтому для получения вакцинных конъюгатов были синтезированы более стабильные олигосахариды с восстановленной кетогруппой (37a–39a), два из которых (38a, 39a) содержали остаток фукозамина, а также тетрасахарид (37a) с остатком хинавозамина на восстанавливающем конце [95] (рис. 5). Антитела в сыворотках, специфичных к КП серотипа 5 (36) (были использованы сыворотки кролика и человека для типирования данного серотипа, а также антисыворотка кролика к вакцине Prevnar 13^®), хорошо связывались с обоими пентасахаридами (37a, 38a) и несколько хуже – с тетрасахаридом (39a).

Поскольку химический синтез лиганда (37a) был достаточно трудоемким, для иммунологических экспериментов были получены только конъюгаты (38b) и (39b). Конъюгат (38b) стимулировал образование у кроликов более высоких титров кросс-реактивных антител, чем конъюгат тетрасахарида (39b). Индуцированные конъюгатом (38b) антисыворотки распознавали помимо самого пентасахаридного лиганда (38a) также пентасахарид (37a) и КП (36). Эти данные подчеркивают, что для получения иммуногенного вакцинного конъюгата необходимо использование полного повторяющегося звена КП серотипа 5 (36).

Оба конъюгата (38b, 39b) вызывали у кроликов образование антител, превосходящих по опсонизирующей способности антитела в сыворотке к мультивалентной вакцине Prevnar 13^®, при этом антитела к пентасахариду в составе конъюгата (38b) обладали более сильным антибактериальным действием in vitro, чем антитела к тетрасахаридному конъюгату (39b). Однако защитные функции антисывороток определяются не только титрами опсонизирующих антител, но и их авидностью по отношению к нативному КП на поверхности бактерий. Количественно определенные значения авидности к КП (36) в тестах с ингибированием связывания цианатом аммония показали, что авидность антител, индуцированных конъюгатом (38b), более чем в 4 раза превосходит авидность антисывороток к конъюгату (39b) и вакцине Prevnar 13^®.

Хотя активность полусинтетических конъюгатов (38b) и (39b) была сопоставлена со сравнимой дозировкой конъюгата КП серотипа 5 (36) в составе вакцины Prevnar 13^®, возможно, что присутствие дополнительных серотипов в мультивалентной вакцине снижает активность индивидуальных КП других серотипов, и поэтому такое сравнение не вполне корректно [97, 98]. Эффективные вакцины приводят к выработке длительного иммунного ответа и формированию В-клеток памяти. В данном исследовании титры специфичных антител у кроликов, иммунизированных конъюгатом (38b), снижались к 119-му дню после первичной иммунизации, однако введение бустерной дозы приводило к быстрому возрастанию уровня антител, что свидетельствует о сильной иммунологической памяти. Таким образом, пентасахаридный конъюгат (38b) является перспективным кандидатом для вакцины против пневмококков серотипа 5.

S. pneumoniae серотипа 6. S. pneumoniae серотипа 6В является частой причиной пневмококковых заболеваний, особенно у детей [99, 100], и его также ассоциируют с антибиотикорезистентностью [101–103]. КП S. pneumoniae серотипа 6В (41) (рис. 6) входит в состав как 23-валентных полисахаридных вакцин первого поколения Pneumovax 23^® (Merck Sharp & Dohme Corp.) и Pneumo 23^® (Sanof-i), так и в состав всех конъюгированных пневмококковых вакцин, выпускаемых в настоящее время. КП (41) содержит в своем составе фосфатную группу, и его конъюгация с белком-носителем не всегда проходит успешно. Индуцированные КП (41) антитела характеризуются медленным созреванием аффинности по сравнению с КП других серотипов пневмококка [104], и в связи с этим количество КП серотипа 6B (41) пневмококка в конъюгированных вакцинах увеличено в 2 раза по сравнению с КП других серотипов. S. pneumoniae серотипа 6В относится к серогруппе 6, включающей еще три сероварианта, полисахариды которых обладают незначительными различиями: 6A (40), 6C (42) и 6D (43) (рис. 6), однако наибольшее клиническое значение имеют S. pneumoniae серотипов 6А и 6В.

Вследствие незначительных структурных различий между КП серогруппы 6 антитела к КП S. pneumoniae серотипа 6В обладают перекрестной антигенной активностью в отношении S. pneumoniae серотипов 6А, 6D и 6С [105–107]. Это подтверждается тем, что случаи выявления серотипа 6А стали реже после начала применения конъюгированной пневмококковой вакцины, содержащей в своем составе КП 6В [55]. Однако это может быть связано и с тем, что генные мутации способны приводить к синтезу нескольких типов повторяющихся звеньев в составе одного КП. Так, были обнаружены пневмококки, способные продуцировать “смешанный” КП серотипа 6А/6В [108], что зависит от штамма-продуцента КП, состава питательной среды и условий культивирования штаммов S. pneumoniae.

Конъюгированные с белком-носителем синтетические аналоги КП, содержащие протективные эпитопы соответствующих серотипов пневмококка, могут приводить к образованию более высокого титра специфических антител, чем конъюгаты бактериальных КП [109, 110]. Это было продемонстрированно и с использованием олигосахаридов, соответствующих фрагментам цепи КП S. pneumoniae серогруппы 6, синтез которых был проведен несколькими исследовательскими лабораториями. Наиболее активными оказались олигосахариды, имеющие размер не менее полных повторяющихся звеньев [55]. Так, были синтезированы содержащие фосфаты тетрасахариды (44a) и (45a), а также тетрасахариды без фосфатной группы (46), (47) и (48) (рис. 6), имитирующие повторяющиеся звенья КП серотипов 6A, 6B и 6С соответственно [111–113]. Показано, что конъюгат фосфатсодержащего тетрасахарида с белком KLH (44b) вызывал у мышей и кроликов образование антител, способных перекрестно связываться с КП как серотипа 6В (41), так и серотипа 6А (40), а также стимулировать фагоцитоз микробных клеток пневмококка серотипов 6А и 6В [60].

В экспериментах по пассивной и активной иммунизации мышей антисыворотка кроликов к конъюгату (44b) защищала мышей от заражения пневмококком серотипов 6А и 6В. Это позволило сделать вывод о том, что тетрасахарид (44a), конъюгированный с белком-носителем (конъюгат 44b), является эффективным компонентом вакцины, способным индуцировать образование защитных антител к S. pneumoniae серотипов 6А и 6В [60]. Противоречащие данному выводу результаты получены в экспериментах по исследованию тетрасахарида (46a), в составе которого нет фосфатной группы. КП серотипа 6В не ингибировал взаимодействие антител кролика с конъюгатом (46b). Это может означать, что эпитопы, представленные в КП серотипа 6В, отличаются от представленных в нефосфорилированном тетрасахариде (46a) [114–116]. Таким образом, для получения эффективной конъюгированной вакцины против S. pneumoniae серогруппы 6 необходимо использовать фосфатсодержащие тетрасахариды, соответствующие повторяющемуся звену КП S. pneumoniae серотипов 6А и 6В.

S. pneumoniae серотипа 7F. S. pneumoniae серотипа 7F до 2012 г. был пятым по распространенности среди 97 серотипов, вызывающих инвазивные пневмококковые заболевания в Европе, однако с введением 13-валентной вакцины, в состав которой входит КП серотипа 7F (49) (рис. 7), количество пневмоний, обусловленных этим серотипом, уменьшилось [117]. Повторяющееся звено КП (49) содержит семь моносахаридных остатков, среди которых четыре в основной цепи, а также присутствуют два ответвления. Для определения минимального гликотопа, способного вызывать образование специфичного иммунного ответа в отношении КП серотипа 7 (49), был синтезирован ряд спейсерированных олигосахаридов (51–56) [117] (рис. 7), которые были выбраны таким образом, чтобы определить вклад каждого из ответвлений во взаимодействие со специфичными антителами. Гептасахарид, соответствующий полному повторяющемуся звену, не планировали синтезировать ввиду трудоемкости введения остатка α-N-aцетилглюкозамина.

Для установления эпитопов, ответственных за связывание с антителами человека, была использована автоматизированная система микроанализа, с помощью которой изучали взаимодействие олигосахаридов (51–56) с антителами референсной сыворотки человека 007sp [72]. Эта сыворотка связывалась с олигосахаридами (51–55), однако не связывалась с трисахаридом (56). Добавление КП серотипа 7F эффективно ингибировало взаимодействие сыворотки 007sp с олигосахаридами (51–56), нанесенными на поверхность микрочипа (наименьшее ингибирование наблюдали в случае тетрасахарида (52)). Родственный КП серотипа 7A (50), в котором отсутствует остаток галактозы в боковой цепи, также был способен ингибировать взаимодействие сыворотки 007sp с олигосахаридами (51–56), однако в меньшей степени, чем КП серотипа 7F (49). Авторами был сделан вывод, что оба боковых ответвления в структуре углеводного лиганда играют важную роль при распознавании специфичными антителами, и это нужно учитывать при дальнейшем конструировании полусинтетической конъюгированной вакцины. Кросс-реактивность, которую наблюдали в экспериментах ингибирования, дает основания полагать, что синтетические антигены, являющиеся фрагментами КП серотипа 7F (49), будут вызывать образование антител как к серотипу 7F, так и к серотипу 7A [117].

S. pneumoniae серотипа 8. Полисахарид этого серотипа был включен в состав 23-валентных полисахаридных вакцин Pneumovax 23^® и Pneumo 23^®, однако не является компонентом конъюгированных полисахаридных вакцин, выпущенных позднее. Встречаются штаммы данного серотипа, устойчивые к таким антибиотикам, как эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и ципрофлоксацин [118]. Более того, этот мультирезистентный серотип наиболее часто обнаруживают у ВИЧ-инфицированных пациентов [119].

Повторяющееся звено КП серотипа 8 (57) (рис. 8) представляет собой линейный тетрасахарид, который содержит дисахаридный фрагмент, соответствующий целлобиуроновой кислоте [β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glc], представленный также в КП пневмококков серотипа 3.

Для определения структуры протективного эпитопа Seeberger et al. была синтезирована серия тетрасахаридов (58a–61a) [119] (рис. 8), которые представляли все возможные моносахаридные последовательности (получены путем сдвига рамки считывания) для тетрасахаридного повторяющегося звена КП (57). С помощью автоматизированного микроанализа для панели антигенов (58a–62a) было установлено, что тетрасахарид (60a) наилучшим образом связывается с протективными моноклональными антителами, направленными на нативный полисахарид КП серотипа 8 (57).

Дальнейшее картирование защитных эпитопов в тетрасахариде (60a) было выполнено при помощи моноклональных антител, специфичных к лиганду (60а), отобранных после иммунизации мышей конъюгатом (60b). Оказалось, что наличие остатка глюкуроновой кислоты не играет решающей роли, т.к. тетрасахарид (62a), содержащий остаток глюкозы на невосстанавливающем конце, обладал профилем связывания, аналогичным тетрасахариду (60a). Конъюгаты (60b) и (62b) оказались малоиммуногенными у мышей, однако у кроликов оба конъюгата вызывали образование высоких титров антител, которые связывались как с КП серотипа 8 (57), так и с обоими тетрасахаридами (60a, 62a) [119].

Также были получены экспериментальные смешанные вакцины [119], состоящие из конъюгатов (60b) или (62b) в комплексе с коммерческой полисахаридной конъюгированной вакцине Prevnar 13^®, которая не содержит КП серотипа 8 (57). Оба 14-валентных вакцинных препарата вызывали у кроликов образование антител, связывающихся с КП серотипа 8 (57), чего не происходило в случае иммунизации отдельно вакциной Prevnar 13^®. Сыворотка кроликов, иммунизированных 14-валентными вакцинами, обладала опсонизирующей способностью в отношении пневмококков серотипа 8 in vitro, в отличие от сыворотки кроликов, иммунизированных только с помощью Prevnar 13^®. Также было показано, что одновременное введение полусинтетических конъюгированных вакцин (60b) или (62b) с вакциной Prevnar 13^® не приводит к снижению иммуногенности КП в составе коммерческой вакцины [119]. Таким образом, была продемонстрирована возможность эффективного применения конъюгатов синтетических олигосахаридных лигандов в сочетании с конъюгированными полисахаридными вакцинами. Это может быть полезно для наиболее проблемных серотипов, КП которых в составе вакцин недостаточно активны из-за структурных особенностей этих полисахаридов.

S. pneumoniae серотипа 9V. КП пневмококков серотипа 9V (64) (рис. 9) входит в состав вакцины Prevnar 13^®. В структуре этого КП присутствует лабильный O-ацетильный заместитель в остатке N-ацетилманнозамина (см. повторяющееся звено (63), не содержащее О-ацетильную группу), что осложняло выделение гомогенного полисахарида из бактериальных источников и долгое время не позволяло однозначно определить его химическое строение. Антитела, полученные против нативного КП (64), распознают как О-ацетилированную форму (64), так и ее О-деацетилированный аналог (63). Однако только антисыворотка, распознающая О-деацетилированный полисахарид (63), обладала опсонофагоцитарной активностью, что свидетельствует о том, что присутствие О‑ацетата в данном случае не является необходимым для выработки протективного иммунитета [120].

В другом исследовании [121] было показано, что моноклональные антитела к КП серотипа 9V (64) в равной степени связываются с обеими формами (63, 64), обладают опсонофагоцитарной активностью и при пассивной иммунизации способны защищать мышей от заражения пневмококком серотипа 9V. Для того чтобы прояснить влияние О-ацетилирования КП серотипа 9V на специфичность иммунного ответа, были синтезированы и исследованы пентасахариды как с О-ацетильной группой (66), так и без нее (65) [122] (рис. 9).

Структуры данных соединений, в которых на “невосстанавливающем” конце находится остаток глюкуроновой кислоты, были выбраны с учетом результатов исследований олигосахаридов, родственных КП серотипов 3 и 8, в которых была обнаружена необходимость присутствия именно концевого остатка глюкуроновой кислоты для наилучшего распознавания антителами, специфичными к соответствующим КП. С помощью полученных олигосахаридов (65, 66) было спектрально подтверждено наличие О-ацетильной группы при С6 остатка N-ацетилманнозамина в нативном полисахариде (64), и эти олигосахариды будут теперь использованы для иммунологических исследований [122].

S. pneumoniae серотипа 12F. КП серотипа 12F входит в состав пневмококковых 23-валентных полисахаридных вакцин Pneumovax 23^® и Pneumo 23^®, а также является компонентом готовящейся к лицензированию 20-валентной полисахаридной конъюгированной вакцины Prevnar 20^®. Серотипы 12F и 12A суммарно ответственны за 4% пневмококковых заболеваний [3]. Для проведения детальных иммунологических исследований (на момент написания данного обзора о них еще не сообщалось) был получен спейсерированный гексасахарид (68), представляющий собой одно повторяющееся звено полисахарида (67) [123] (рис. 10).

S. pneumoniae серотипа 14. Капсулярный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 (69) построен из разветвленных тетрасахаридных повторяющихся звеньев (рис. 11). К настоящему моменту получен ряд синтетических олигосахаридов, соответствующих участкам цепи КП S. pneumoniae серотипа 14, в том числе конъюгированных с белком-носителем [124–127]. Был также синтезирован капсулярный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 [125], который использовался в иммунологических исследованиях [128, 129].

В ходе исследования большой группы синтетических олигосахаридных фрагментов полисахарида (69) было установлено, что присутствие фрагмента β-Gal-(1→4)-β-Glc на невосстанавливающем конце олигосахаридного лиганда является необходимым для выработки антител, связывающихся с нативным КП (69) [55]. Так, конъюгаты (70b–74b) (рис. 11) в присутствии различных адъювантов (MPL и Quil-A) вызывали у мышей образование высоких титров антител, специфичных к КП (69), при этом фагоцитарная активность полученных антител находилась в прямой зависимости от величины титров антител к КП серотипа 14 (69). Было специально показано, что сыворотки, не содержащие антител, специфичных к полисахариду (69), не проявили никакой фагоцитарной активности в отношении пневмококков серотипа 14. По результатам сравнительных экспериментов были сделаны выводы, что тетрасахаридный лиганд в составе конъюгата (70b) содержит эпитопы, необходимые для выработки защитных антител, и является минимальным структурным мотивом для выработки опсонизирующих антител к повторяющемуся звену КП (69) [130]. В случае, если антитела к конъюгату (70b) будут обладать также и протективными свойствами в экспериментах на животных, такой конъюгат можно будет рассматривать в качестве перспективного кандидата на роль соответствующего серотипу 14 компонента поливалентной пневмококковой вакцины.

При исследовании эффекта второй иммунизации мышам сначала вводили конъюгат (70b), а вторую иммунизацию проводили этим же гликоконъюгатом или неконъюгированным бактериальным КП (69). В 1-й день после повторного введения конъюгированного тетрасахарида в сыворотке крови мышей повышался уровень IL-5, а на 7-е сутки появлялись специфические IgG-антитела в высоком титре. После иммунизации КП (69) не отмечали повышения уровня IL-5 и антител к КП. В опытах in vitro стимуляция спленоцитов конъюгатом (70b) приводила к продукции IL-4 и IL-5, что не отмечали при иммунизации неконъюгированным КП (69). Однако при стимуляции спленоцитов мышей, двукратно иммунизированных инактивированными клетками S. pneumoniaе серотипа 14, уровень IFNγ и IL-17 был выше при иммунизации бактериальным КП, чем у мышей, повторно иммунизированных конъюгатом синтетического тетрасахарида, и у неиммунизованных мышей. Это позволило заключить, что после второй иммунизации конъюгированным тетрасахаридом (70b) происходит активация клеток памяти и формируется выраженный иммунитет к S. pneumoniaе серотипа 14, тогда как повторная иммунизация конъюгированным бактериальным КП не приводит к образованию опсонизирующих антител, хотя и участвует в определенных регуляторных иммунологических механизмах [131].

Авторами данного обзора были получены и исследованы конъюгаты (70с), (72с) и (75с) [127, 128]. Способность иммунных сывороток мышей к конъюгатам тетра- (70c) и октасахарида (75с) индуцировать опсонофагоцитоз убитых нагреванием клеток S. pneumoniae серотипа 14 была выше, чем активность антисывороток к конъюгированному гексасахариду (72с). Впервые защитная активность BSA-гликоконъюгатов, адсорбированных на гидроксиде алюминия, была продемонстрирована на модели септической пневмококковой инфекции у мышей, зараженных S. pneumoniae серотипа 14. Наибольшую защитную активность проявлял конъюгат (70с), меньшую – конъюгат (75с), а наименьший защитный эффект получен при иммунизации конъюгатом (72b). После инокуляции неиммунизированным мышам пуловых сывороток, полученных от мышей, иммунизированных самой высокой испытуемой дозой каждого гликоконъюгата, различий в пассивной защите мышей от инфекции в зависимости от гликоконъюгата обнаружено не было. Показано, что в ответ на вакцинацию мышей CRM197–КП (69b) происходило образование IgG1-антител к тетрасахариду (70a). Образование большого количества специфических антител к тетрасахариду (70a) и его защитные свойства подтверждают, что тетрасахарид (70a) является перспективным кандидатом для создания конъюгированной вакцины против заболеваний, вызванных S. pneumoniae серотипа 14 [127, 128].

Для оценки действия гликоконъюгатов на молекулярно-клеточном уровне был выбран конъюгат (72c) с синтетическим гексасахаридным лигандом. Показано, что иммунизация конъюгатом (72c) без адъюванта увеличивала количество TLR2-экспрессирующих клеток и индуцировала созревание дендритных клеток (CD11c⁺, CD80⁺ и MHCII⁺), которые секретировали IL-1β, IL-6 и TNFα в культуральную среду. Уровень IL-1β, IL-10, IFNγ и TNFα в крови мышей повышался в течение 24 ч после однократного введения гликоконъюгата (72c) мышам. На 7-й день увеличивалось количество CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов в селезенке и В-лимфоцитов. Через 14 суток после второй иммунизации уровни CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов были ниже, чем в контроле, в то время как количество В-клеток, NK-клеток и MHCII-экспрессирующих клеток оставалось повышенным.

Добавление гидроксида алюминия к гликоконъюгату (72c) стимулировало выработку GM-CSF, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, IFNγ и TNFα. Титры IgG1-антител к КП S. pneumoniae серотипа 14 через 7 дней после второй иммунизации гликоконъюгатом с адъювантом были высокими. В этот период сохранялись нормальные уровни CD4⁺-Т-лимфоцитов в селезенке, тогда как наблюдалось снижение количества CD8⁺-Т-лимфоцитов и повышение уровня В-лимфоцитов, NK-клеток и клеток, экспрессирующих MHCII. Уровень IgG1-антител снижался к 92-му дню наблюдения. Бустерная иммунизация гликоконъюгатом (72c), адсорбированным на гидроксиде алюминия, стимулировала выработку IgG1-антител к КП, которые определялись в течение 97 дней. Выяснение специфических особенностей влияния синтетического гексасахаридного конъюгата (72c) на стимуляцию врожденного, клеточно-опосредованного иммунитета и антительного ответа может способствовать оптимизации конструкции гликоконъюгатной пневмококковой вакцины [129].

При создании синтетических вакцин против пневмококка также проводятся работы с использованием золотых нанокластеров в качестве носителей. В частности, были получены наночастицы (76) (рис. 11), несущие тетрасахаридный лиганд, являющийся повторяющимся звеном КП пневмококков серотипа 14 (69) [132]. Тетрасахарид (70d), содержащий терминальную тиольную группу для функционализации наночастицы, был конъюгирован вместе со стимулирующим Т-клетки пептидом (OVA_323–329) и D-глюкозным лигандом с образованием гибридных наночастиц (76) размером ~2 нм. Иммунологические исследования на мышах показали, что гликокластер (76) вызывает образование антител, специфичных к КП серотипа 14 (69). Полученные при иммунизации мышей наночастицами (76) антисыворотки были способны к опсонофагоцитозу пневмококков серотипа 14, однако менее эффективно, чем сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатом бактериального КП (69) с СRM197.

S. pneumoniae серотипа 17F. Капсулярный полисахарид S. pneumoniae серотипа 17F (77) (рис. 12) входит только в состав 23-валентных полисахаридных вакцин Pneumovax 23^® и Pneumo 23^®. Его повторяющееся звено содержит семь моносахаридных остатков и имеет достаточно сложное строение, в результате чего первоначально определение структуры (77) было сделано с ошибками. На основе ошибочной структуры КП серотипа 17F были синтезированы олигосахаридные лиганды (78a–80a) [133] (рис. 12). Также были получены соответствующие конъюгаты (78b–80b), которые использовали для иммунизаций мышей и кроликов. Конъюгаты ди- (78b) и трисахарида (79b) у обоих видов животных вызывали образование антител, специфичных к КП серотипа 17F (77), а также защищали мышей от инфицирования инкапсулированными штаммами S. pneumoniae серотипа 17F в опытах по активной иммунизации. Конъюгат тетрасахарида (80b) не был способен индуцировать специфичных к КП антител, а также не проявлял защитных свойств. Позднее, когда структура КП серотипа 17F (77) была уточнена, стало понятно, что в структуре тетрасахаридного лиганда (80a) присутствовали две ошибки (указаны стрелками на схеме) по сравнению с правильной химической структурой (77). Для трисахаридного лиганда (79a) наличие одной ошибки не сыграло роли. Это позводило сделать вывод, что в дисахариде (78a) уже содержится ключевой протективный эпитоп [134]. Для проверки этого предположения, конечно, требуется проведение более детальных исследований.

S. pneumoniae серотипа 19F. КП S. pneumoniae серотипа 19F (81) (рис. 13) входит в состав всех лицензированных пневмококковых вакцин. Был получен гликоконъюгатный нанокластер (83), который наряду с тетрасахаридным лигандом (70d) (отвечает серотипу 14) включает трисахаридный лиганд (82b), соответствующий повторяющемуся звену КП (81) [135]. При иммунизации мышей гликонаночастицами (83) были получены антитела, специфичные к КП серотипа 14 (69). При этом титры были более высокими, чем в случае частиц (76), содержащих только лиганд серотипа 14, однако выработки антител, специфичных к КП серотипа 19F, не наблюдали. Исследования в этом направлении продолжаются.

S. pneumoniae серотипа 23F. КП пневмококков серотипа 23F (83) (рис. 14) построен из тетрасахаридных повторяющихся звеньев и входит в состав 23-валентных пневмококковых полисахаридных вакцин Pneumovax 23^® и Pneumo 23^®. Для поиска оптимального олигосахаридного лиганда, применимого в создании соответствующего вакцинного кандидата, были синтезированы трисахаридный (84a) и тетрасахаридный (85a) (соответствует полному повторяющемуся звену) лиганды, а также их конъюгаты с белком-носителем KLH (84b, 85b) [136, 137] (рис. 14). Для анализа их иммуногенности использовался и конъюгат KLH с КП серотипа 23F.

Результаты иммунизации кроликов и мышей показали существенные различия в иммуногенности конъюгатов. Так, у кроликов конъюгат с тетрасахаридом (85b) вызывал образование антител, специфичных к КП серотипа 23F (83), в то время как в экспериментах на мышах тот же самый конъюгат оказался совершенно неиммуногенным [137]. В свою очередь, конъюгат трисахарида (84b) оказался малоиммуногенным у кроликов и не вызывал образования антител, связывающихся с бактериальным КП (83). С помощью экспериментов с перекрестным ингибированием было показано, что антитела, индуцируемые у кроликов конъюгатами КП серотипа 23F (83b) и его полного повторяющегося звена (85b), обладают одинаковой эпитопной специфичность, но отличаются по специфичности от антител человека, которые были получены в ответ на иммунизацию полисахаридом (83) в составе коммерческой 23-валентной полисахаридной пневмококковой вакцины [138].

Антисыворотки людей, иммунизированных КП (83), содержат высокие титры антител, связывающихся с КП серотипа 23F (83), однако это взаимодействие может лишь в незначительной степени быть проингибировано конъюгатами синтетических олигосахаридов (84b) и (85b). При этом рассматриваемая антисыворотка человека обладала в 5 раз более высокой опсонизирующей способностью в тестах in vitro, чем антисыворотка кролика к конъюгату полисахарида (83b). Сыворотка кроликов, иммунизированных конъюгатом тетрасахарида (85b), в этих же тестах оказалась в 2 раза менее активной, чем антисыворотка к конъюгату полисахарида (83b). Антитела, индуцированные конъюгатом трисахарида (84b), не вызывали опсонизации пневмококков серотипа 23F, что полностью согласуется с тем фактом, что антисыворотка к трисахаридному конъюгату (84b) не связывалась с нативным КП серотипа 23F (83) [138].

Результаты этой серии работ наглядно показывают, что иммуногенность, а также эпитопная специфичность иммунного ответа у различных лабораторных животных и человека могут существенно отличаться. Авторы высказали предположение, что IgG человека способны распознавать эпитопы большего размера (в том числе конформационные эпитопы у крупных углеводных антигенов), в отличие от антител кролика, которые распознают эпитопы меньшего размера, присутствующие в том числе в коротких олигосахаридных лигандах. Поэтому для оценки эффективности вакцин необходимо проводить детальное изучение иммунного ответа у людей [138].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотренные в обзоре серотипы S. pneumoniae широко распространены во всех географических регионах и относятся к числу серотипов пневмококка, наиболее часто вызывающих заболевания у детей и взрослых. Капсулярные полисахариды почти всех этих серотипов S. pneumoniae включены в состав лицензированных полисахаридных и конъюгатных пневмококковых вакцин. Однако, несмотря на эффективность используемых в настоящий момент вакцин, требуется постоянный контроль за распространением различных серотипов пневмококка и своевременное введение вакцинных препаратов, содержащих антигены для наиболее актуальных серотипов.

В настоящее время активно продолжается разработка полисахаридных конъюгированных вакцин, и компания Pfizer готовит к лицензированию 20-валентную вакцину (Prevnar 20^®, препарат проходит третью фазу клинических испытаний), которая содержит конъюгаты полисахаридов семи дополнительных серотипов по сравнению с активно используемой в настоящее время вакциной Prevnar 13^®. Распределение серотипов пневмококка в составе 7-, 13-, 20- и 23-валентных вакцинных препаратов суммировано на рис. 15.

Использование для получения конъюгированных вакцин полисахаридов, получаемых биотехнологическими методами, по-прежнему сопряжено с техническими сложностями. Среди рассмотренных в данном обзоре серотипов пневмококка многие КП содержат лабильные заместители или функциональные группы, которые модифицируются при выделении или в процессе конъюгации с белком-носителем, что ведет к искажению активных эпитопов и снижению иммуногенности соответствующих компонентов вакцины. Поэтому активно ведутся работы по синтезу фрагментов КП наиболее эпидемиологически актуальных серотипов и поиску эпитопов, ответственных за выработку защитных антител. Большой опыт исследований в этой области позволил создать определенные алгоритмы для эффективного отбора наиболее активных углеводных лигандов. Современные методы позволяют проводить автоматизированный скрининг углеводных лигандов, нанесенных на чипные слайды [54, 59, 62] и другие носители [139–145], для изучения эпитопной специфичности антител. Также были разработаны новые эффективные методы синтеза наиболее сложных типов олигосахаридов (см., например, работы [146–149]), в том числе автоматизированного синтеза олигосахаридов [150, 151], что существенно упрощает получение широких библиотек углеводных лигандов.

Проблемы, которые приходится решать при создании синтетических углеводных вакцин, во многом схожи со сложностями при разработке конъюгированных вакцин на основе бактериальных полисахаридов. Это и поиск оптимального метода конъюгации, и влияние связующего линкера на иммуногенность конъюгата, и правильный выбор адъюванта, а также несовпадение иммунных реакций на вводимые препараты у различных лабораторных животных и человека. Тем не менее в большинстве случае удается найти нужные условия для создания высокоиммуногенных конъюгатов синтетических олигосахаридов, вызывающих образование защитных антител.

Иммунологически активные олигосахариды вызывают выработку антител к капсулярным полисахаридам и усиливают комплемент-зависимый опсонофагоцитоз. Показано, что некоторые олигосахаридные конъюгаты вызывают даже более сильный антительный ответ, чем конъюгаты бактериальных КП отдельных серотипов. Это важное положение приводит к выводу о возможности замены КП таких серотипов в коммерческих вакцинах на синтетические олигосахариды с созданием поливалентной синтетической пневмококковой вакцины. Так, уже известен удачный пример совместного применения 13-валентной конъюгированной вакцины и конъюгата синтетического олигосахарида, отвечающего фрагменту капсулярного полисахарида S. pneumoniae серотипа 8 [119]. Тем не менее сегодняшний уровень возможностей олигосахаридного синтеза позволяет получать фактически любые олигосахаридные производные, что позволит в достаточно скором времени создать пневмококковую вакцину только на основе синтетических олигосахаридных лигандов. Немаловажно и то, что оперирование такими производными лучше соответствует стандартам качества фармацевтического производства GMP как на этапе получения вакцинных лигандов, так и их конъюгатов с белками-носителями или иными функциональными компонентами, включая адъювантные гликолипиды [152].