1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 2, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 2, стр. 179-183

Модифицированные олигонуклеотиды: новые структуры, новые свойства, новые области применения

В. Г. Метелев 1, Т. С. Орецкая 1, *

1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет и НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского
119991 Москва, Ленинские горы, 1, Россия

* E-mail: oretskaya@belozersky.msu.ru

Поступила в редакцию 28.09.2020
После доработки 10.10.2020
Принята к публикации 12.10.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Нуклеиновые кислоты прошли длинный и тернистый путь “от лабораторного стола до больничной палаты” (“from bench to bedside”). В настоящее время можно предположить, что лекарственные препараты на основе модифицированных олигонуклеотидов найдут достойное применение в персонализированной медицине будущего.

Ключевые слова: модифицированные нуклеиновые кислоты, олигонуклеотидные медицинские препараты, антисмысловые олигонуклеотиды

Модифицированные олиго- и полинуклеотиды стали важнейшими инструментами в молекулярной биологии, биохимии, медицинской химии, диагностических процедурах и завоевывают свою нишу среди терапевтических средств нового поколения. Решающее значение для качественного скачка в изучении свойств и использовании такого рода соединений сыграло появление универсального автоматизированного метода синтеза фрагментов нуклеиновых кислот (НК). Конструирование, синтез и применение олигонуклеотидов как лекарственных препаратов были бы невозможны, если бы в апреле 1953 г. в журнале “Nature” не появились три легендарные статьи, описывающие структуру ДНК. Первая – Джеймса Уотсона (J.D. Watson) и Фрэнсиса Крика (F.H. Crick) [1], в которой впервые приведена трехмерная модель структуры ДНК. Две другие статьи были написаны учеными Королевского колледжа в Кембридже. Розалинд Франклин (R.E. Franklin) и Раймонд Гослинг (R.G. Gosling) представили исследование дифракции рентгеновских лучей на кристаллах ДНК [2], а Морис Уилкинс (M.H. Wilkins), Александр Стокс (A.R. Stokes) и Герберт Уилсон (H.R. Wilson) [3] сделали расчеты параметров двойной спирали на основе кристаллографических данных. История открытия двойной спирали хорошо описана не только в знаменитой книге Уотсона “Двойная спираль: воспоминания об открытии структуры ДНК” [4], но и в ряде других книг, например, в книге “Розалинд Франклин: темная леди ДНК”, опубликованной Брендой Мэддокс (B. Maddox) в 2002 г. [5].

Появление этих книг, современных обзоров по истории развития химии нуклеиновых кислот и их применения [6–8], а также желание многих ученых представить свои работы в данном тематическом номере журнала свидетельствуют о том, что до сих пор значимость этого фантастического и феерического события, поистине величайшего в ХХ веке, и его последствий не перестает привлекать внимание ученых и историков науки.

История химического синтеза ДНК началась через два года после открытия структуры двойной спирали ДНК Уотсоном и Криком. Решение проблемы быстрого и эффективного синтеза фрагментов НК являлось основанием для развития молекулярной биологии, биотехнологии, генетики, инженерии белков, расшифровки генома человека. История синтеза НК включает тысячи работ ученых из многих стран мира. Исследования одних строились на достижениях других. Невозможно перечислить всех, кто внес свой вклад в развитие этой области. В первой классической работе, опубликованной А.М. Микельсоном (A.M. Michelson) и А.Р. Тоддом (A.R. Todd), описывался синтез динуклеотида с использованием соединений трехвалентного фосфора [9]. Это был “мастер-класс” постановки защитных групп и методов фосфитилирования. Впервые был использован прогрессивный для того времени способ выделения полученного динуклеозидфосфата с помощью бумажной ионообменной хроматографии. Знаменательными событиями в истории химии олигонуклеотидов явились синтез гена тРНК и появление универсального автоматизированного метода синтеза олигонуклеотидов, поэтому, признавая заслуги многих химиков, в первую очередь следует отметить огромный вклад Х.Г. Кораны (H.G. Khorana) и М.Х. Карузерса (M.H. Caruthers) [6–8, 10–12]. Параллельно с совершенствованием методов создания межнуклеотидной связи и введения/удаления защитных групп начался бум по встраиванию модифицированных звеньев во фрагменты ДНК, изучению влияния модификаций на химические и физико-химические свойства одно- и двутяжевых фрагментов и их широкому использованию в фундаментальных исследованиях, медицинской и диагностической практике.

Немодифицированные НК могут выступать как объект и инструмент исследования или воздействия на биологические процессы. Однако введение модифицированных фрагментов в олигонуклеотидную цепь позволяет значительно расширить комплекс задач, в том числе существенно улучшить проникновение фрагментов ДНК через клеточные мембраны, повысить устойчивость к действию клеточных нуклеаз, увеличить термодинамическую стабильность НК-дуплексов. Встраивание в олигонуклеотид химически активных групп дает возможность получить разнообразные конъюгаты с молекулами пептидов, красителей и др. В принципе, возможно постсинтетическое введение статистических модификаций или модификаций по 3'- и/или 5'-концу олигонуклеотидов, однако наиболее универсальным методом является направленное встраивание модифицированного звена в заранее заданное положение олигомерной цепи в процессе химического синтеза. Модификации можно подразделить на терминальные и внутрицепочечные. Замена или введение дополнительных группировок может происходить по межнуклеотидной фосфатной группе, углеводному фрагменту или гетероциклическому основанию.

Модификация олигонуклеотидов направлена на улучшение фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Можно выделить некоторую направленность в изменении свойств при введении модификаций, в частности изменение углеводофосфатного остова приводит к повышению нуклеазной стабильности и аффинности к НК, тогда как присоединение заместителей по 3'- и 5'-концам значительно улучшает доставку олигонуклеотидов к органам и проникновение в клетки.

Важно всегда помнить, что одним из фундаментальных свойств олигонуклеотидов является их способность к комплементационным взаимодействиям, поэтому при введении различных модификаций одной из главных задач является сохранение структур и функций, необходимых для взаимодействия с комплементарными участками целевых нуклеиновых кислот. Не случайно, что модификация в большинстве случаев направлена на углеводофосфатный остов [13–18]. Важными аспектами являются повышение специфичности связывания модифицированных олигонуклеотидов с целевыми нуклеиновыми кислотами или НК-связывающими белками, увеличение стабильности этих соединений по отношению к гидролизу клеточными нуклеазами. Тем не менее следует отметить, что в любом случае модификации не должны приводить к появлению токсичных метаболитов [13].

Если ранее речь шла о какой-то конкретной модификации (основными вехами принято считать описанные в обзорах [6–8, 13], в том числе 2′-F (1964), PS (1966), 2′-O-метил (1969), 2′-O-MOE (1978), PMO (1989), PNA (1991), NP (1994), LNA (1998), tc-DNA (2002)), то к настоящему моменту накоплена такая “солидная библиотека” олигонуклеотидных производных, что следует говорить о семействах модификаций. Это можно продемонстрировать на примере 2',4'-мостиковых олигонуклеотидов, описанных в обзоре Wan et al. [13], где приведены сведения о 30-мостиковых аналогах. До сих пор остаются востребованными такие изменения структуры, которые приводят к снижению суммарного заряда модифицированного олигонуклеотида и повышению его гидрофобности [19–23].

К настоящему моменту 11 препаратов [24] на основе олигонуклеотидов были одобрены к использованию в медицинской практике (табл. 1).

Таблица 1.

  Олигонуклеотиды, используемые в качестве лекарственных препаратов

Препарат Организация (год одобрения) Межнуклеозидный фосфат Углеводный фрагмент или остаток морфолина Особенности строения соединения Cсылка
Фомивирсен (Fomivirsen) FDA (1998),
EMA (1999) 		PS, PO 2'-Дезоксирибоза ss [25]
Пегаптаниб (Pegaptanib) FDA (2004) PO 2'-F-2'-дезоксипиримидиновые и 2'-O-метилпуриновые нуклеозиды ss [26]
5'-концевой ПЭГ-линкер, 3',3'-межнуклеотидная связь, аптамер
Мипомерсен (Mipomеrsen) FDA (2013) PS, PO 2'-Дезоксирибоза и 2'-O-(2-метоксиэтил)рибоза ss [27]
центральная часть – дезоксинуклеотиды, остальные рибонуклеотиды (гэпмер)
Этеплирсен (Eteplirsen) FDA (2016) Диамидофосфат ss на 5'-конце
 [28]
Нусинерсен (Nusinersen) FDA (2016)
EMA (2017) 		PS, PO 2'-O-(2-метоксиэтил)рибоза ss [29]
Инотерсен (Inotersen) FDA (2018)
EMA (2018) 		PS, PO 2'-O-(2-метоксиэтил)рибоза ss
гэпмер 		[30]
Патисиран (Patisiran) FDA (2018)
EMA (2018) 		PO 2'-O-метилрибоза и 2'-дезоксирибоза ds siРНК [31]
основная часть – рибонуклеотиды, на 3'-конце по два T
Воланесорсен (Volanesorsen) EMA (2019) PS, PO 2'-Дезоксирибоза и 2'-O-(2-метоксиэтил)рибоза ss
гэпмер 		[32]
Гивосиран (Givosiran) FDA (2019) PS на концах, другие PO 2'-F(A/C/G)
2'-O-метил(A/C/G/U) 		ds siРНК [33]
на 3'-конце L96 (“трехантенный” GalNAc)
Голодирсен (Golodirsen) FDA (2019) Диамидофосфат ss на 5'-конце
 [34]
Вилтоларсен (Viltolarsen) MHLW (2020) Диамидофосфат ss [35]

Примечание: FDA – Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США); EMA – Европейское агентство лекарственных средств; MHLW – Министерство здравоохранения, труда и благосостояния Японии; PS – тиофосфат, PO – фосфат; ss или ds – одно- или двуспиральный.

Клинические испытания ряда других модифицированных олигонуклеотидов (антисмысловых олигонуклеотидов (AСO), малых интерферирующих РНК (siРНК), “ловушек”, аптамеров) продолжаются. Это указывает на то, что потенциал АСО и других основанных на НК лекарственных препаратов реализуется вполне успешно. Использование синтетических олигонуклеотидов для терапевтических целей требует нового подхода для их рационального дизайна и крупномасштабного синтеза [36]. В то время как более чем 70 кандидатов в лекарственные препараты прошли разные стадии клинических испытаний [6], для значительного количества АСО испытания были прекращены. Список олигонуклеотидов, отклоненных для дальнейшего использования в качестве биомедицинских препаратов, продолжает расти. Причиной может быть неподтвержденная мишень в гене, неправильно подобранная нуклеотидная последовательность AСO, достигнутый уровень нокдауна, недостаточный для терапии, активность AСO вне цели и, что наиболее важно, терапевтический индекс, ограничивающий лечение.

Анализируя данные табл. 1, можно легко заметить, что несмотря на колоссальное число предложенных модификаций, сейчас на практике реально используются лишь несколько (весьма небольшая часть из потенциально возможных) относительно простых. Остальные, не нашедшие пока применения в качестве лекарств, широко применяются в научных исследованиях или находятся на различных стадиях клинических испытаний [37–41].

Поиск лекарственных препаратов на основе самым разным образом модифицированных олигонуклеотидов напоминает теорему Курта Геделя (K.F. Godel) о неполноте: всякая система математических аксиом, начиная с определенного уровня сложности, либо внутренне противоречива, либо неполна [42]. Клетка, а тем более организм в целом, слишком сложны, а информация о функционировании системы недостаточна, чтобы сконструировать некое универсальное средство для лечения даже уникальной (отдельной) болезни. Данный факт является причиной того, что широкий ряд ДНК-фрагментов, содержащих иногда набор различный модификаций, не доходят даже до самой ранней стадии клинических испытаний, оставаясь в химической лаборатории в качестве новых соединений, но не биомедицинских препаратов.

Химический синтез терапевтических олигонуклеотидов нетривиален, и комбинированные эффекты нескольких модификаций часто непредсказуемы. При выборе модификаций и их положений в НК-фрагменте необходимо руководствоваться эмпирическим тестированием.

Отсутствие противовирусного препарата для борьбы с SARS-CoV-2 привело к использованию различных лекарств, ингибирующих отдельные стадии репликации вирусов [43]. Было бы удивительно, если бы не появились публикации, в которых пока чисто теоретически не были бы предложены направления воздействия на вирус с помощью олигонуклеотидов. Rossi et al. [44] предполагают, что терапевтические средства на основе олигонуклеотидов могут быть нацелены либо на сам вирус, ингибируя его трансмембранный S-белок (spike protein) или воздействуя на его репликационные белки через нарушение НК-белковых взаимодействий (аптамеры), либо направлены на вирусный геном через подавление экспрессии генов (gene silencing), опосредованное siРНК или АСО. Подходы, заставляющие гены “молчать”, могут уменьшить воспалительные эффекты в легких и других органах, приводящие к смертности в тяжелых случаях COVID-19.

В настоящее время можно предположить, что олигонуклеотидные препараты найдут достойное применение при лечении различных заболеваний, в том числе наследственных и орфанных (редких), а также в диагностике и в персонализированной медицине будущего.

Список литературы

  1. Watson J.D., Crick F.H. // Nature. 1953. V. 171. P. 737–738. https://doi.org/10.1038/171737a0

  2. Franklin R.E., Gosling R.G. // Nature. 1953. V. 171. P. 740–741. https://doi.org/10.1038/171740a0

  3. Wilkins M.H., Stokes A.R., Wilson H.R. // Nature. 1953. V. 171. P. 738–740. https://doi.org/10.1038/171738a0

  4. Watson J.D. // The Double Helix: a Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA. New York: Atheneum, 1968.

  5. Maddox B. Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA. New York: HarperCollins, 2002.

  6. Agrawal S., Gait M.J. Chapter 1: History and Development of Nucleotide Analogues in Nucleic Acids Drugs // In Advances in Nucleic Acid Therapeutics. 2019. P. 1–21. https://doi.org/10.1039/9781788015714-00001

  7. Lundin K.E., Gissberg O., Smith C.I.E., Zain R. // Methods Mol. Biol. 2019. V. 2036. P. 3–16. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9670-4_1

  8. Glazier D.A., Liao J., Roberts B.L., Li X., Yang K., Stevens C.M., Tang W. // Bioconjugate Chem. 2020. V. 31. P. 1213−1233. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00060

  9. Michelson A.M., Todd A.R. // J. Chem. Soc. 1955. P. 2632–2638. https://doi.org/10.1039/JR9550002632

  10. Caruthers M.H., Khorana H.G. // J. Mol. Biol. 1972. V. 72. P. 407–426. https://doi.org/10.1016/0022-2836(72)90154-4

  11. Caruthers M.H. // Science. 1985. V. 230. P. 281–285. https://doi.org/10.1126/science.3863253

  12. Lundin K.E., Gissberg O., Smith C.I.E. // Hum. Gene Ther. 2015. V. 26. P. 475–485. https://doi.org/10.1089/hum.2015.070

  13. Wan W.B., Seth P.P. // J. Med. Chem. 2016. V. 59. P. 9645−9667.  https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b00551

  14. Прохорова Д.В., Челобанов Б.П., Буракова Е.А., Фокина А.А., Стеценко Д.А. // Биоорг. химия. 2017. Т. 43. С. 45–50. [Prokhorova D.V., Chelobanov B.P., Burakova E.A., Fokina A.A., Stetsenko D.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 38–42.] https://doi.org/10.1134/S1068162017010071

  15. Miroshnichenko S.K., Patutina O.A., Burakova E.A., Chelobanov B.P., Fokina A.A., Vlassov V.V., Altman S., Zenkova M.A., Stetsenko D.A. // PNAS. 2019. V. 116. P. 1229–1234. https://doi.org/10.1073/pnas.1813376116

  16. Zatsepin T.S., Oretskaya T.S., Stetsenko D.A., Gait M.J. // Bioconjugate Chemistry. 2005. V. 16. P. 471–489. https://doi.org/10.1021/bc049712v

  17. Dolinnaya N.G., Zubin E.M., Kubareva E.A., Zatsepin T.S., Oretskaya T.S. // Current Organic Chemistry. 2009. V. 13. P. 1029–1049. https://doi.org/10.2174/138527209788680745

  18. Хомякова Е.А., Казанова Е.В., Зубин Е.М., Кубарева Е.А., Молочков Н.В., Рязанова Е.М., Орецкая Т.С. // Биоорг. химия. 2010. Т. 36. С. 343–353. [Khomyakova E.A., Kazanova E.V., Zubin E.M., Kubareva E.A., Molochkov N.V., Ryazanova E.M., Oretskaya T.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2010. V. 36. P. 315–324.] https://doi.org/10.1134/S1068162010030064

  19. Yanachkov I., Zavizion B., Metelev V., Stevens L.J., Tabatadze Y., Yanachkova M., Wright G., Krichevsky A.M., Tabatadze D.R. // Org. Biomol. Chem. 2017. V. 15. P. 1363–1380. https://doi.org/10.1039/c6ob02576e

  20. Metelev V.G., Bogdanov A.A., Jr. // Theranostics. 2020. V. 10. P. 1391–1414. https://doi.org/10.7150/thno.37936

  21. Markov O.V., Filatov A.V., Kupryushkin M.S., Chernikov I.V., Patutina O.F., Strunov A.A., Chernolovskaya E.L., Vlas-sov V.V., Pyshnyi D.V., Zenkova M.A. // Molecules. 2020. V. 25. P. 3663. https://doi.org/10.3390/molecules25163663

  22. Chernikov I.V., Meschaninova M.I., Chernolovskaya E.L. // Methods in Molecular Biology. 2020. V. 2115. P. 57–77. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0290-4_3

  23. Osborn M.F., Coles A.H., Biscans A., Haraszti R.A., Roux L., Davis S., Ly S., Echeverria D., Hassler M.R., Godinho B.M.D.C., Nikan M., Khvorova A. // Nucleic Acids Research. 2019. V. 47. P. 1070–1081. https://doi.org/10.1093/nar/gky1232

  24. Kuijper E.C., Bergsma A.J., Pijnappel W.W.M.P., Aartsma-Rus A. // J. Inherit. Metab. Dis. 2020. https://doi.org/10.1002/jimd.12251

  25. Stix G. // Sci. Am. 1998. V. 279. P. 50. https://doi.org/10.1038/scientificamerican1198-46b

  26. Doggrell S.A. // Expert Opin. Pharmacother. 2005. V. 6. P. 1421–1423. https://doi.org/10.1517/14656566.6.8.1421

  27. Hair P., Cameron F., McKeage K. // Drugs. 2013. V. 73. P. 487–493. https://doi.org/10.1007/s40265-013-0042-2

  28. Aartsma-Rus A., Krieg A.M. // Nucl. Acid. Ther. 2017. V. 27. P. 1–3. https://doi.org/10.1089/nat.2016.0657

  29. Aartsma-Rus A. // Nucl. Acid. Ther. 2017. V. 27. P. 67–69. https://doi.org/10.1089/nat.2017.0665

  30. Benson M.D., Waddington-Cruz M., Berk J.L., Polydefkis M., Dyck P.J., Wang A.K., Planté-Bordeneuve V., Barroso F.A., Merlini G., Obici L., Scheinberg M., Brannagan T.H., Litchy W.J., Whelan C., Drachman B.M., Adams D., Heitner S.B., Conceição I., Schmidt H.H., Vita G., Campistol J.M., Gamez J., Gorevic P.D., Gane E., Shah A.M., Solomon S.D., Monia B.P., Hughes S.G., Kwoh T.J., McEvoy B.W., Jung S.W., Baker B.F., Ackermann E.J., Gertz M.A., Coelho T. // N. Engl. J. Med. 2018. V. 379. P. 22–31. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1716793

  31. Hoy S.M. // Drugs. 2018. V. 78. P. 1625–1631.https://doi.org/10.1007/s40265-018-0983-6

  32. Yang X., Lee S.R., Choi Y.S., Alexander V.J., Digenio A., Yang Q., Miller Y.I., Witztum J.L., Tsimikas S. // J. Lipid Res. 2016. V. 57. P. 706–713. https://doi.org/10.1194/jlr.M066399

  33. Sardh E., Harper P., Balwani M., Stein P., Rees D., Bissell D.M., Desnick R., Parker C., Phillips J., Bonkovsky H.L., Daphne Vassiliou D., Penz C., Chan-Daniels A., He Q., Querbes W., Fitzgerald K., Kim J.B., Garg P., Akshay Vaishnaw A., Amy R. Simon A.R., Anderson K.E. // N. Engl. J. Med. 2019. V. 380. P. 549–558. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1807838

  34. Heo Y.A. // Drugs. 2020. V. 80. P. 329–333. https://doi.org/10.1007/s40265-020-01267-2

  35. Roshmi R.R., Yokota T. // Drugs Today (Barc). 2019. V. 55. P. 627–639. https://doi.org/10.1358/dot.2019.55.10.3045038

  36. Obika S., Sekine M. // Synthesis of Therapeutic Oligonucleotides. Springer, Singapore. 2018. V. VIII. P. 284. https://doi.org/10.1007/978-981-13-1912-9

  37. Зубин Е.М., Анцыпович С.И., Орецкая Т.С., Романова Е.А., Волков Е.М., Ташлицкий В.Н., Шабарова З.А. // Биоорг. химия. 1997. Т. 23. С. 809–816. [Zubin E.M., Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitskii V.N., Shabarova Z.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 1997. V. 23. P. 730–736.]

  38. Naryshkin N.A., Farrow M.A., Ivanovskaya M.G., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A., Gait M.J. // Bioche-mistry. 1997. V. 36. P. 3496–3505. https://doi.org/10.1021/bi962789p

  39. Monakhova M., Ryazanova A., Hentschel A., Viryasov M., Oretskaya T., Friedhoff P., Kubareva E. // Journal of Chromatography A. 2015. V. 1389. P. 19–27. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.02.045

  40. Rechkunova N.I., Lavrik O.I. // Photochemistry and Photobiology. 2020. V. 96. P. 440–449. https://doi.org/10.1111/php.13222

  41. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. // DNA Repair. 2020. V. 90. P. 102 847. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2020.102847

  42. Курт Гедель // О формально неразрешимых предложениях Principia Mathematica и родственных систем. 1992 / перевод Б. Мельцер, всестороннее введение Р. Брейтуэйт. Дуврское переиздание издания Basic Books 1962 года. ISBN 0-486-66980-7

  43. Kupferschmidt K., Cohen J. // Science. 2020. V. 367. P. 1412–1413. https://doi.org/10.1126/science.367.6485.1412

  44. Rossi J.J., Rossi D. // Nucleic Acid Ther. 2020. V. 30. P. 129–132.  https://doi.org/10.1089/nat.2020.0868

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал