Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 3, стр. 327-340

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее динамично развивающихся направлений химии нуклеиновых кислот выступает ДНК-нанотехнология [1, 2], которая рассматривает молекулу ДНК как уникальный материал для конструирования разнообразных наноархитектур [3], что открывает возможность создания на основе ДНК динамических наноустройств [4], наномашин [5] и нанороботов [6, 7]. В основе данного применения лежит присущая полинуклеотидам способность к комплементарному уотсон-криковскому связыванию, а также к образованию структур более высокого порядка [3]. Предложенный в 2006 г. метод ДНК-оригами [8], состоящий в “укладке” (folding) протяженной одноцепочечной молекулы ДНК, например, кольцевого генома фага М13, с помощью сотен олигонуклеотидов-“скрепок”, комплементарных уникальным участкам ДНК, за прошедшие полтора десятилетия развился в практическую технологию формирования двумерных и трехмерных ДНК-наноструктур с потенциалом применения в биомедицине для биоанализа [9], создания биосенсоров [10], биоимиджинга [11], доставки лекарств [12, 13] и иммунотерапии [14]. В основе большинства современных вариантов ДНК-оригами лежит сочетание компьютерных алгоритмов программируемой самосборки молекул ДНК [15, 16] с методами манипуляции протяженными ДНК из арсенала молекулярной биологии [17]. Однако использованию методов химической модификации участков нуклеиновых кислот при рациональном конструировании наноархитектур, на наш взгляд, все еще уделяется недостаточно внимания [18]. Это приводит к усложнению и увеличению размеров и массы ДНК-модулей для сборки наноархитектур, что может вызывать дополнительные проблемы при проникновении в клетку [19]. Представляется вероятным, что объемные ДНК-модули могут быть заменены относительно простыми синтетическими модифицированными олигонуклеотидами, в частности разветвленными олигонуклеотидами. Это позволило бы расширить интервал размеров получаемых ДНК-наноструктур в направлении нижней границы диапазона (~10 нм). Таким образом, дополнение метода ДНК-оригами приемами из арсенала твердофазного олигонуклеотидного синтеза и химической модификации нуклеиновых кислот с целью создания новых технологий конструирования трехмерных нанообъектов и функциональных наноустройств представляется актуальной задачей.

В ранее опубликованной работе мы предложили способ конструирования дискретных многогранников на основе нуклеиновых кислот (“энкаэдров”) по принципу матричной сборки из разветвленных олигонуклеотидных блоков, формирующих вершины и ребра энкаэдра, с использованием в качестве матрицы (каркаса) разветвленного олигонуклеотида (РО), структура которого определяется формой целевого многогранника, например, тетраэдра, куба, октаэдра и т.п. [20]. Наиболее подходящим способом получения соответствующих РО представляется комбинация автоматизированного твердофазного синтеза (с использованием ненуклеозидных фосфитамидных реагентов различной функциональности) с постсинтетической конъюгацией в растворе, например, при помощи методов клик-химии [21].

Ранее нами был обоснован расчетами выбор последовательностей олигонуклеотидов для конструирования разветвленных олигонуклеотидных матриц (РОМ) для сборки ДНК-тетраэдра, ДНК-куба и ДНК-аналога фуллерена С24, а также разветвленного олигонуклеотидного строительного блока (РОСТ), общего для всех этих топологий [20]. Был определен набор необходимых ненуклеозидных разветвляющих и модифицирующих реагентов для получения матриц и разветвленного строительного блока.

Настоящая работа была сосредоточена на решении двух основных задач: 1) получение разветвленных олигонуклеотидов (РО), служащих для построения олигонуклеотидных матриц для сборки ДНК-тетраэдра и ДНК-куба, и разветвленного олигонуклеотидного строительного блока (РОСТ), общего для обоих многогранников; 2) практическая отработка подходов к конструированию конкретных энкаэдров (на примере ДНК-тетраэдра) на основе направленной самосборки разветвленных олигонуклеотидных блоков на каркасе разветвленной олигонуклеотидной матрицы (РОМ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Простейшей моделью для отработки условий матричной сборки энкаэдров служит ДНК-тетраэдр. Предложенная последовательность операций матричной сборки ДНК-тетраэдра изложена в работе Bakulina et al. [20]. В качестве “четырехвалентной” (т.е. формирующей четыре вершины будущего тетраэдра) разветвленной олигонуклеотидной матрицы (РОМ-1) для сборки ДНК-тетраэдра выступает димер разветвленного олигонуклеотида Y (“вилки”), формирующийся за счет самокомплементарного олиго-2'-O-метилрибонуклеотида ОН1 и содержащий четыре одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотида ОН2 (рис. 1а). Первый шаг сборки – гибридизация матрицы РОМ-1 с разветвленным олигонуклеотидным строительным блоком – “звездочкой” РОСТ-1 (рис. 1е), формирующая четыре вершины тетраэдра, с образованием дуплексов ОН2:ОН3.

Рис. 1.

Структуры и последовательности разветвленных олигонуклеотидов (РО), полученных на первом этапе работы: (а) – “вилка” Y – мономер для сборки “четырехвалентной” разветвленной олигонуклеотидной матрицы (РОМ-1); (б) – 5-азидогексаноильный и (в) – 1-гексинильный разветвленные олигонуклеотиды (РО-азид и РО-гекс соответственно); (г) – побочный продукт, образующийся в результате неполного протекания клик-реакции циклоприсоединения CuAAC лишь по одной из двух 1-гексинильных групп РО-гекс; (д) – мономер для сборки “восьмивалентной” разветвленной олигонуклеотидной матрицы РОМ-2; (е) – “звездочка” – разветвленный олигонуклеотидный строительный блок (РОСТ-1). Обозначения: Ŷ – остаток симметричного удвоителя (symmetric doubler); Ψ – остаток симметричного утроителя (trebler); р – фосфодиэфирная группа –P(=O)(–O–)–; ОН – олигонуклеотид; РЭ – размыкаемый элемент, вертикальной стрелкой указана расщепляемая дисульфидная связь; Гекс – остаток 1-гексина; Азид – 6-азидогексаноильная группа; Tri – остаток 1,2,3-триазола с заместителями в положениях 1 и 5 (слева направо); горизонтальной стрелкой указано направление последовательности “обратного” олигодезоксирибонуклеотида ОН3 – от 5'- к 3'‑концу. Дезоксирибонуклеотиды обозначены прописными буквами, 2'-O-метилрибонуклеотиды – курсивом, последовательность ОН3, собранная из “обратных” 5'-фосфитамидов в направлении 5'–3', подчеркнута; опущены префиксы d и r для обозначения олигодезоксирибонуклеотидов и олиго-2'-О-метилрибонуклеотидов соответственно.

В результате гибридизации самокомплементарных олигодезоксирибонуклеотидов ОН4 из состава “звездочки” РОСТ-1 (рис. 1е) образуются ребра тетраэдра, при этом формируется пирамидальная супрамолекулярная двуцепочечная ДНК-конструкция в виде ДНК-тетраэдра, вершины которого соединены внутренним каркасом из матрицы РОМ-1. В качестве побочных продуктов возможно получение изомерных конструкций, имеющих отличную от тетраэдра топологию.

Для конструирования матрицы РОМ-1 был получен разветвленный олигонуклеотид Y (рис. 1а). Как следует из анализа электрофореграмм денатурирующего и нативного гель-электрофореза, матрица РОМ-1 образуется путем димеризации “вилки” Y за счет аутогибридизации самокомплементарного олиго-2'-O-метилрибонуклеотида ОН1 (рис. 2).

Рис. 2.

(а) – Электрофоретический анализ олигонуклеотидов в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, с окрашиванием красителем Stains-All. Дорожки: 1 – “вилка” Y после 2 мин прогрева при 95°С и быстрого нанесения на гель под напряжением; 2 – маркер длины D157 (одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид длиной 34 нт); 3 – “вилка” Y (0.1 о.е.); 4 – “вилка” Y (0.05 о.е.). ВР – краситель бромфеноловый синий; (б) – нативный электрофорез в 15%-ном ПААГ, окрашивание красителем Stains-All. Дорожки: 1 – D157 после 2 мин прогрева при 95°С и быстрого нанесения на гель под напряжением; 2 – “вилка” Y в 1 M NaCl; 3 – “вилка” Y без 1 M NaCl; 4 – “вилка” Y без 1 M NaCl после 2 мин прогрева при 95°С с последующей инкубацией 10 мин при 0°С.

Для матричной сборки ДНК-куба требуется “восьмивалентная” разветвленная матрица РОМ-2, формирующая восемь вершин куба (например, рис. 1д). Попытка прямого твердофазного синтеза олигонуклеотида, соответствующего данной топологии матрицы, не увенчалась успехом из-за низкого выхода полноразмерного продукта после проведения двух конденсаций симметричного удвоителя (Ŷ) подряд. Поэтому было принято решение конструировать матрицу РОМ-2 с помощью постсинтетической конъюгации в растворе с использованием одного из наиболее популярных подходов клик-химии [21], а именно реакции катализируемого Сu(I) [2+3] циклоприсоединения азидов и алкинов (CuAAC) [22, 23].

Для получения мономера матрицы РОМ-2 (рис. 1д) были синтезированы два разветвленных олигонуклеотида: РО-азид, содержащий одну 6‑азидогексаноильную группу, введенную по 3'-концу ОН2 через аминолинкер С7 (рис. 1б), и РО-гекс, содержащий два остатка 1-гексина, введенные посредством конденсации коммерческого 1-гексинильного фосфитамида вслед за симметричным удвоителем на 5'-конце ОН1 (рис. 1в).

Конъюгация РО-азид и РО-гекс (4 : 1) по реакции CuAAC была осуществлена по методике, разработанной ранее [24]. Однако по данным гель-электрофореза (данные не приведены) основным продуктом реакции выступал монозамещенный конъюгат РО-гекс с одной молекулой РО-азид (рис. 1г) наряду с множественными полосами, вероятно, соответствующими деградации олигонуклеотидов при воздействии солей меди(I) и (II) даже в присутствии лиганда THPTA (трис-гидроксипропилтриазолилметиламин).

Чтобы избежать деградации олигонуклеотида в присутствии солей меди, было решено использовать для синтеза нового варианта матрицы РОМ-2′ реакцию “безмедного клика”, а именно некаталитическую реакцию алкин-азидного циклоприсоединения, промотируемую напряжением в производном циклооктина (SPAAC) [25–28]. Для решения этой задачи был синтезирован новый набор разветвленных олигонуклеотидов (рис. 3). Получение бициклононинового (BCN) производного (рис. 3г) протекало с высоким выходом из соответствующего 3'-аминогексильного предшественника и коммерческого активированного карбоната бицикло[6.1.0]нонина-4. Однако с очисткой диазидного компонента от примеси соответствующего монопроизводного возникли трудности. Полученные реакционные смеси не удавалось эффективно разделить ни с помощью офВЭЖХ, ни с помощью электрофореза в ПААГ. После перебора нескольких вариантов синтеза наилучший результат показало бис-азидоацетильное производное РО-азид' (рис. 3б), полученное с помощью коммерческого аминолинкера с последующей обработкой N-гидроксисукцинимидным эфиром азидоуксусной кислоты, приготовленным in situ.

Рис. 3.

Структуры и последовательности разветвленных олигонуклеотидов (РО), полученных на втором этапе работы: (а) – “вилки” Y – мономера для сборки “четырехвалентной” разветвленной олигонуклеотидной матрицы РОМ-1' для ДНК-тетраэдра; (б) – PO-азид' – азидного фрагмента “восьмивалентной” матрицы (РОМ-2′) для сборки ДНК-куба; (в) – РО-С6-амино – исходного материала для синтеза бициклоциклононинового (BCN) фрагмента матрицы РОМ-2′ (РО-BCN) (г); (д) – “звездочки” – разветвленного олигонуклеотидного строительного блока РОСТ-2′. Обозначения: Ŷ – остаток симметричного удвоителя (symmetric doubler); Ψ – остаток симметричного утроителя (trebler); р – фосфодиэфирная группа –P(=O)(–O–)–; ОН – олигонуклеотид; РЭ – размыкаемый элемент, вертикальной стрелкой указана расщепляемая дисульфидная связь; С6 Aмино – 6-аминогексильная группа; Aмино – остаток аминолинкера; BCN – остаток бицикло[6.1.0]нонина-4; Aзид' – азидоацетильная группа; Т* – остаток тимидина с фотолабильной защитной группой (NPOM). Дезоксирибонуклеотиды обозначены прописными буквами, 2'-O-метилрибонуклеотиды – курсивом, последовательность ОН3, собранная из “обратных” 5'-фосфитамидов в направлении 5'–3', подчеркнута, направление последовательности указано горизонтальной стрелкой; опущены префиксы d и r для обозначения олигодезоксирибонуклеотидов и олиго-2'-О-метилрибонуклеотидов соответственно.

Предпринятый синтез мономера матрицы РОМ-2' из РО-азид' и PO-BCN в соотношении 1 : 4 по реакции “безмедного клика” (SPAAC) (рис. 4) протекал значительно медленнее, чем каталитическая версия (CuAAC). В результате после 72 ч при 40°С, что значительно жестче условий, принятых в работе Jawalekar et al. [28] (комнатная температура, 12 ч), на электрофореграмме можно было зарегистрировать в основном образование монозамещенного продукта и лишь следовых количеств целевого дизамещенного олигонуклеотида (рис. 5). Таким образом, и этот путь конструирования “восьмивалентной матрицы” РОМ-2′ не привел к успеху, и отработка условий для матричной сборки ДНК-куба требует дальнейших исследований.

Рис. 4.

Схема синтеза “восьмивалентной” матрицы РОМ-2' для ДНК-куба с помощью реакции “безмедного клика” (SPAAC) [14] между разветвленными олигонуклеотидами, содержащими азидоацетильные группы (Aзид′) и остатки бицикло[6.1.0]нонина-4 (BCN), между которыми происходит реакция [2+3]циклоприсоединения с образованием 1,4,5-тризамещенного 1,2,3-триазола. Обозначения у фигурных скобок слева соответствуют рис. 5.

Рис. 5.

Электрофореграмма реакции “безмедного” клика (SPAAC). Обозначения полос: 1 – Азид'; 2 – BCN; 3, 4 – продукты циклоприсоединения моно- (основной) и бис- (следы) соответственно.

Далее был осуществлен синтез разветвленных олигонуклеотидных строительных блоков – “звездочек” РОСТ-1 и РОСТ-2 (рис. 1е и рис. 3д соответственно), которые, по нашим расчетам, могут использоваться для сборки как ДНК-тетраэдра, так и ДНК-куба [20]. Наибольшие проблемы вызвало введение размыкаемого элемента, а именно дисульфидной связи, с помощью коммерческого дисульфидного фосфитамида. Выход олигонуклеотида после 6 мин конденсации свежеприготовленного 0.15 М раствора дисульфидного фосфитамида в абсолютном ацетонитриле не превышал 40% по офВЭЖХ. Увеличение времени конденсации до 15 мин не привело к повышению выхода целевого компонента. При синтезе “звездочек” неудовлетворительная конденсация дисульфидного фосфитамида вызывала наибольшие потери продукта.

С использованием матрицы РОМ-1 и разветвленного олигонуклеотидного блока РОСТ-1 в соотношении 1 : 4 была предпринята матричная сборка ДНК-тетраэдра. Анализ реакционной смеси с помощью нативного гель-электрофореза в агарозе показал наличие продукта, соответствующего по молекулярной массе расчетной массе ДНК-тетраэдра (рис. 6). В то же время в смеси присутствовало значительное количество полимерных продуктов большой молекулярной массы, не обладающих подвижностью в геле. Образование высокомолекулярных продуктов можно объяснить неконтролируемой полимеризацией “звездочки” РОСТ-1 за счет гибридизации самокомплементарных олигонуклеотидов ОН4 (рис. 1е).

Рис. 6.

Анализ продуктов матричной сборки ДНК-тетраэдра с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Дорожки: 1 – ДНК-маркеры 100–1000 нт; 2 – реакционная смесь после сборки ДНК-тетраэдра из РОМ-1 и РОСТ-1 (4 экв.); а – интенсивная полоса с размером между 200 и 400 нт; б – высокомолекулярные продукты, не вошедшие в гель (предположительно агрегаты конкатемерной природы).

С помощью просвечивающей электронной микроскопии было показано присутствие наряду с полимерными продуктами дискретных продуктов с линейными размерами <50 нм, которые могут соответствовать агрегатам “звездочки” РОСТ-1 (рис. 7).

Рис. 7.

Микрофотографии образцов олигонуклеотидов, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии: (а) – РОМ-1; (б) – РОСТ; (в) и (г) – продукты матричной сборки ДНК-тетраэдра из РОМ-1 и РОСТ-1 в соотношении 1 : 4; [РОСТ-1] = 0.3 мкМ. Негативное контрастирование ацетатом уранила.

Полученные результаты убедительно продемонстрировали необходимость использования защитной группы, которая препятствовала бы преждевременной аутогибридизации “звездочки”. В качестве защитной группы нами была использована фотолабильная 1-(2-нитропиперонил)-этоксиметильная группа (NPOM) в положении 3 остатка тимидина, предложенная ранее для сходных целей Deuters et al. [29–31]. Исследование скорости удаления NPOM-группы с остатка тимидина в составе модельного олигонуклеотида D574 при облучении УФ-светом (λ = 365 нм) показало (табл. 1), что для >90%-ного отщепления в оптимизированных условиях требуется не менее 4 ч (рис. 8, дорожки 4 и 5). Длина волны была подобрана с целью минимизации возможного образования фотодимера тимидина и других нежелательных фотопродуктов. Как видно из электрофореграммы на рис. 8 (дорожки 1–3), облучение “звездочки” РОСТ-2 (олигонуклеотид D570), содержащей по три остатка NPOM-T(Т*) на ветвь (рис. 3д), в Трис-ацетатном буфере (ТАЕ, рН 7.6) УФ-светом (λ = 365 нм) в течение 5 ч и последующая обработка 100 мМ дитиотреитом (DTT) в течение 1 ч для разрыва дисульфидной связи, как и ожидалось, приводили к снижению электрофоретической подвижности олигонуклеотида.

Рис. 8.

Электрофореграмма олигонуклеотидов: D570 (“звездочка” РОСТ-2, рис. 5д) до (дорожка 1) и после (дорожка 2) облучения УФ-светом (λ = 365 нм) и после обработки DTT (дорожка 3); D574 до (дорожка 4) и после (дорожка 5) облучения УФ-светом (λ = 365 нм). Условия: 15%-ный ПААГ, 8 М мочевина, 1× ТВЕ, pH 8.3, окрашено красителем Stains-All. ВР – краситель бромфеноловый синий.

Сборку ДНК-тетраэдра на основе матрицы РОМ-1′ и “звездочки” РОСТ-2 (рис. 3а и 3д соответственно) проводили поэтапно в следующей последовательности: отжиг – инкубация – УФ-облучение (λ = 365 нм) – восстановление DTT. Наличие продукта проверяли при помощи электрофореза в нативных условиях: в 8%-ном ПААГ или 0.75%-ном агарозном геле (условия – см. “Эксперим. часть”) (рис. 9). В указанных условиях не удалось достоверно зарегистрировать образование целевой наноструктуры. Однако, как видно из рис. 9а, матрица РОМ-1' присутствует в виде димера, что согласуется с концепцией сборки.

Рис. 9.

Электрофореграммы процесса матричной сборки ДНК-тетраэдра: (а) – 8%-ный нативный ПААГ, 1× ТАЕ, pH 7.6, 10 мM MgCl₂, окрашено Stains-All; дорожки: 1 – D544 (0.05 o.e.); 2 – D570 (0.05 o.e.); 3 – D570 (800 нМ); 4–6 – D544 : D570 1 : 2, 1 : 4 и 1 : 8 соответственно; [D544] = 100 нM; (б) – 8%-ный нативный ПААГ, 1× ТАЕ, pH 7.6, окрашено Stains-All; дорожки: 1 – D544 (0.05 o.e.); 2, 3 – D544 : D570 1 : 8, 12.5 или 20 мМ MgCl₂ соответственно; [D544] = 1 мкM; (в) – 0.75%-ный агарозный гель, 1× ТАЕ, pH 7.6, 10 мM MgCl₂, окрашено EtBr, D544 : D570 1 : 8, [D544] = 1 мкМ, 12.5 мM MgCl₂ и 20 мM MgCl₂, 1 – без облучения при 365 нм, 2 – 5.5 ч облучения при 365 нм, 3 – 5.5 ч облучения и обработка 100 мM DTT в течение 1 ч; (г) – 0.75%-ный агарозный гель, 1× ТАЕ, pH 7.6, окрашено EtBr; дорожки: 1 – ДНК-маркеры 100–1000 нт; 2 – D570; 3 – D544 : D570 1 : 8, 12.5 мМ MgCl₂; 4 – D544 : D570 1 : 8, 20 мМ MgCl₂; [D544] = 1 мкM. ВР – краситель бромфеноловый синий.

На заключительном этапе работы было решено провести сборку комплекса при соотношении РОМ-1' и POCT-2 (олигонуклеотиды D544 и D570 соответственно) 1 : 8 и повышенной до 1 мкМ концентрации матрицы. В данных условиях нам удалось зафиксировать образование комплекса матрицы и “звездочки” до облучения (рис. 10б и 10г). Однако после облучения УФ-светом нам не удалось достоверно зарегистрировать образование наноструктур в нативном 8%-ном ПААГ. При попытке зафиксировать образование наноструктур в 0.75%-ном агарозном геле с целью увеличения стабильности комплексов в буфер для электрофореза добавляли MgCl₂ до концентрации 10 мМ. Как видно из рис. 9в, это привело к ухудшению разрешения полос ДНК в геле. Тем не менее можно отметить, что интенсивность полос при окрашивании бромистым этидием (EtBr), который преимущественно связывается с двуцепочечной ДНК, в случае облученных комплексов D544–D570 значительно выше по сравнению с полосами необлученных образцов при одинаковом количестве нанесенных образцов (рис. 9в). Это свидетельствует в пользу образования ДНК-наноструктур, содержащих большое число двуцепочечных участков, что соответствует концепции сборки.

Рис. 10.

Фотографии просвечивающей электронной микроскопии дискретных нанообъектов, полученных в процессе сборки ДНК-тетраэдра (обведены кружками). Для отдельных нанообъектов (указаны стрелками) указан размер. На врезке – увеличенное изображение нанообъекта. Негативное контрастирование ацетатом уранила.

Препараты, полученные на финальной стадии сборки ДНК-тетраэдра и очищенные в агарозном геле, содержали дискретные нанообъекты размерами 10–12 нм, что хорошо согласуется с результатами компьютерного моделирования, опубликованными нами ранее [20] (рис. 10). Эти нанообъекты могут представлять собой искомые ДНК-тетраэдры. Визуализацию олигонуклеотидных структур в просвечивающем электронном микроскопе осуществляли с использованием иона уранила ${\text{UO}}_{2}^{{2 + }}$, который специфически связывается с фосфатными группами ДНК в соотношении 1 : 2 [32, 33]. В качестве контрастирующего реагента для визуализации ДНК-наноcтруктур предпочтительнее использовать формиат уранила UO₂(HCOO)₂, дающий более тонкое “зерно” [34–36]. В данной работе для выявления ДНК-наноструктур мы использовали ацетат уранила UO₂(CH₃COO)₂ [37], поскольку формиат уранила производится только в США, и его экспорт запрещен. В результате оказалось невозможным однозначно подтвердить с помощью просвечивающей электронной микроскопии, что топология полученных нанообъектов соответствует ДНК-тетраэдру. Для этого требуются дополнительные исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для офВЭЖХ использовали ацетонитрил UHPLC grade Supergradient (Panreac, Испания). Раствор ацетата триэтиламмония (ТЕАА, 2 М, рН 7.0) был приготовлен из триэтиламина ACS grade (Panreac, Испания) и ледяной уксусной кислоты (о.с.ч., Реахим, Россия). Дихлоруксусная кислота, иод, 0.25 М раствор 4,5-дицианимидазола (DCI) в безводном ацетонитриле, красители Stains-All, ксиленцианол FF и бромфеноловый синий (BP) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (США), перхлорат натрия – у фирмы Acros Organics (США), дихлорметан, тетрагидрофуран, пиридин и триэтиламин – у фирмы Panreac (Испания). Формамид, акриламид, N,N'-метилен-бис-акриламид, мочевина, трис(гидроксиметил)-аминометан (Трис), борная кислота, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА) были приобретены у компании Диаэм (Россия). Концентрированный водный раствор аммиака (о.с.ч.), уксусная кислота (о.с.ч.) и ацетон (о.с.ч.) были производства Реахим (Россия). Все реактивы были наивысшей степени чистоты, доступной у соответствующих коммерческих поставщиков. Ацетонитрил (UHPLC grade Supergradient, Panreac, Испания) для синтеза олигонуклеотидов кипятили 6 ч над CaH₂ в атмосфере аргона, затем перегоняли в атмосфере аргона и хранили под аргоном над молекулярными ситами 3 Å. Бидистиллированную воду подготавливали непосредственно в лаборатории.

Для центрифугирования небольших объемов растворов использовали микроцентрифугу MiniSpin Рlus (Eppendorf, ФРГ). Химические реакции проводили с использованием термошейкера Thermomixer Compact (Eppendorf, ФРГ). Растворы встряхивали с помощью вортекса BioVortexV1 (Biosan, Эстония). Гель-электрофорез проводили с использованием установки для электрофореза компании Bio-Rad (США). Небольшие объемы растворов олигонуклеотидов (до 1.5 мл) концентрировали с помощью вакуумного концентратора Savant SpeedVac DNA120ОР (Thermo Fisher Scientific, США).

Олигонуклеотиды были получены с помощью автоматического ДНК/РНК-синтезатора ASM-800 (Биоссет, Новосибирск, Россия) согласно модифицированным протоколам фосфитамидного синтеза в стандартных реакторах объемом 25–50 мкл в масштабе 0.2–0.4 мкМ из соответствующих 5'‑DMTr-3'-β-цианэтил-N,N-диизопропилфосфитамидов 2'-дезокси- и 2'-O-метилрибонуклеозидов (Sigma-Aldrich, США), а также 3'-DMTr-5'-β-цианэтил-N,N-диизопропилфосфитамидов 2'-дезоксирибонуклеозидов (“обратных” фосфитамидов, ChemGenes, США) и соответствующих полимерных носителей на основе пористого стекла с размером пор 1000 Å с привитыми 2'-дезокси- (Sigma-Aldrich, США) или 2'-O-метилрибонуклеозидами (Link Technologies, Великобритания). Для введения узлов разветвления были использованы коммерчески доступные ненуклеозидные разветвляющие β-цианэтил-N,N-диизопропилфосфитамиды: симметричный удвоитель (symmetric doubler) (Glen Research, США, кат. № 10-1920) и симметричный утроитель (trebler) (GlenResearch, США, кат. № 10-1922). Для введения размыкаемого элемента (РЭ) в РОСТ использовали дисульфидный фосфитамид С6 (C6 S-S modifier) (GlenResearch, США, кат. № 10-1936). Для введения алкинильной группы по 5'-концам разветвленного олигонуклеотида (“вилки”) использовали β‑цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфит 5‑гексин-1-ола (GlenResearch, США, кат. № 10‑1908). Для постсинтетического введения 6-азидогексаноильной группы по 3'-концевой аминогруппе разветвленного олигонуклеотида использовали полимерный носитель 3'-Amino-Modifier C7 CPG 1000 (Link Technologies, Великобритания). Для введения 6-аминогексильной группы по 5'-концам разветвленного олигонуклеотида применяли β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфит 6-N-монометокситритил-(MMTr)-аминогексанола (Sigma-Аldrich, США). Все фосфитамиды растворяли в сухом ацетонитриле до концентрации 0.1 или 0.15 М (для doubler, trebler и C6 S-S modifier). Время конденсации варьировало от 0.5 мин для 3'-фосфитамидов дезоксирибонуклеозидов, 6 мин для 5'-фосфитамидов дезоксирибонуклеозидов (“обратных”), фосфитамидов 2'-O-метилрибонуклеозидов, аминолинкерного и дисульфидного фосфитамидов и фосфитамида 5-гексин-1-ола, и до 30 мин в случае удвоителя и утроителя. При введении обоих типов разветвителей время конденсации увеличивали до 30 мин, а масштаб синтеза поднимали с 200 до 400 нM.

Для аналитической ВЭЖХ использовали хроматограф Agilent 1220 (Agilent Technologies, США) c УФ-детекцией при длине волны 260 нм, колонкой ZORBAX Eclipse XDB-C18 5 мкм 4.6 × 150 мм (Agilent Technologies, США). Элюцию осуществляли в градиенте ацетонитрила 0–60% в 20 мМ ТЕАА, рН 7.0, за 30 мин и скорости потока 1 мл/мин. Выделение олигонуклеотидов проводили с помощью хроматографа Waters 600E (Waters Corp., США) c УФ-детекцией при длинах волн 190, 260 и 280 нм и колонкой ZORBAX Eclipse Prep HT XDB-C18 7 мкм 21.2 × 150 мм (Agilent Technologies, США) в градиенте ацетонитрила 0–60% в 20 мМ ТЕАА, рН 7.0, за 30 мин при скорости потока 21 мл/мин.

Олигонуклеотиды были синтезированы в режиме без сохранения 5'-DMTr-группы (“DMTr OFF”) с выделением с помощью препаративного гель-электрофореза в 20%-ном ПААГ толщиной 2–3 мм в денатурирующих условиях и обессоливанием на колонке NAP-25 с сорбентом Sephadex G-25 (GE Healthcare, Великобритания) в виде натриевой соли. Для контроля качества олигонуклеотидов проводили аналитический электрофорез в 20%-ном ПААГ толщиной 0.4 мм в аналогичных условиях: акриламид – N,N′-метилен-бис-акриламид (30 : 1), 8 М мочевина, 90 мМ Трис-борат, pH 8.3, 2 мМ Na₂ЭДTA при напряжении 50 В/см. Олигонуклеотиды наносили в растворе, содержащем 8 М мочевину, 0.05% ксиленцианола FF и 0.05% бромфенолового синего. Визуализацию полос проводили окрашиванием геля раствором красителя Stains-All (500 мг/л) в формамиде с последующей отмывкой дистиллированной водой.

Концентрацию олигонуклеотидов определяли по оптической плотности раствора с помощью УФ-спектрофотометра NanoDrop 2000с (Thermo Fisher Scientific, США).

Молекулярные массы олигонуклеотидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия). Масс-спектры олигонуклеотидов получали в линейном режиме отрицательных ионов прибора и в диапазоне m/z от 500 Да до 16 кДа. Параметры измерения включали также частоту импульсов 25 Гц, ускоряющее напряжение 25.0 кВ и время задержки экстракции ионов 120 нс. Образцы олигонуклеотидов растворяли в водном буфере до концентрации 0.1 мM, содержащем 20 мM ТЕАА и 60% ацетонитрила. Объем анализируемого образца составлял 10 мкл. Смешивали 0.7 мкл образца на подложке (Ground Steel или Anchor Chip) с 0.7 мкл раствора матрицы, приготовленного согласно базовому протоколу производителя (Bruker Daltonics, Германия). Матрицей для ионизации олигонуклеотидов в отрицательном режиме служил 2,6-дигидроксиацетофенон (2,6-DHAP) с добавлением дигидроцитрата аммония. Итоговый масс-спектр получали суммированием 8–20 одиночных спектров по 100 импульсов лазера на точку. Калибровку прибора проводили с использованием калибровочных стандартов фирмы Bruker Daltonics (Германия), а также набора олигодезоксирибонуклеотидов с известными массами. Молекулярные массы олигонуклеотидов рассчитывали, используя наборы экспериментальных значений m/z, определенные для каждого анализируемого образца.

Сборку ДНК-тетраэдра регистрировали при помощи электрофореза в нативных условиях (8%-ный ПААГ, акриламид : метилен-бис-акриламид 30 : 1, или 0.75%-ный агарозный гель) (рис. 10). Сборку осуществляли поэтапно следующим образом. Проводили отжиг олигонуклеотидов D544 (матрица РОМ-1') и D570 (“звездочка” РОСТ-2) в 1× ТАЕ, 10 мМ MgCl₂ при 95°С в течение 8 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и дальнейшей инкубацией в течение суток. Полученный комплекс облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм в течение 5 ч и оставляли на сутки при комнатной температуре. На последнем этапе обрабатывали комплекс 100 мМ DTT в течение 1 ч. Концентрация матрицы D544 составляла 100 нМ, концентрация олигонуклеотида D570 – 200, 400 или 800 нМ (рис. 9а).

Для электронно-микроскопического исследования образцы сорбировали на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, в течение 2 мин. После отбора излишков жидкости фильтровальной бумагой образцы контрастировали 0.5%-ным водным раствором уранилацетата (EMS, США) в течение 10–15 с. Образцы изучали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400 (JEOL, Япония), цифровые изображения получали с помощью камеры бокового ввода Veleta (EMSIS, Германия).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Осуществлен синтез серии разветвленных олигонуклеотидов для использования в качестве матриц и строительных блоков при матричной сборке ДНК-тетраэдра и ДНК-куба. Был проведен процесс матричной сборки ДНК-тетраэдра, в результате которой были получены дискретные нанообъекты, соответствующие по линейным размерам предполагаемому ДНК-тетраэдру. Размер полученных нанообъектов хорошо согласуется с предсказанным ранее с помощью метода компьютерного моделирования [20].