Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 3, стр. 391-399

ВВЕДЕНИЕ

Онкологические заболевания – глобальная проблема современного общества, затрагивающая миллионы пациентов [1, 2]. На сегодняшний день злокачественные новообразования занимают второе место среди причин смертности, уступая лидирующую позицию лишь сердечно-сосудистым патологиям [3]. Так, согласно данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодный темп прироста онкозаболеваний составляет ~1.5%, при этом в 2018 г. было зарегистрировано более 9.6 млн смертельных случаев от онкопатологий.

Используемые в настоящее время противоопухолевые агенты характеризуются низким терапевтическим индексом и, как следствие, высоким токсическим действием не только на неопластические клетки, но и на здоровые клетки организма, что может быть связано с разнообразием патогенеза и этиологии опухолей, их развитием, симптоматикой и феноменом резистентности. Поэтому не вызывает сомнения актуальность поиска высокоэффективных малотоксичных онкопрепаратов с целью получения лекарственных средств нового поколения с различными механизмами действия.

Одним из перспективных классов химических соединений с подтвержденным противоопухолевым потенциалом выступают гидроксамовые кислоты (ГК), которые обладают широким спектром биологической активности [4–6]. На сегодняшний день FDA одобрено использование трех представителей данного класса для лечения кожной и периферической Т-клеточной лимфомы и множественной миеломы [7]: вориностат (SAHA, Золинза) [8], панобиностат (Фаридак) [9] и белиностат (Белеодаг) [10], что наглядно подтверждает перспективность поиска антинеопластических агентов среди гидроксамовых кислот. Анализ современных тенденций в исследованиях противоопухолевых свойств соединений этого класса при терапии онкологических заболеваний показывает, что антинеопластический потенциал гидроксамовых кислот может реализовываться по нескольким направлениям: 1) использование монотерапии, нацеленной на эффективное ингибирование гистоновых деацетилаз (HDACs) [5, 11]; 2) создание на основе ГК полифункциональных препаратов с разными фармакофорными фрагментами, воздействующими одновременно на несколько различных звеньев патологии [12, 13]; 3) применение ГК в качестве хемосенсибилизаторов при комбинированной терапии с цитостатиками [14].

Ранее было показано, что реакции глицингидроксамовой (GlyГК) и ряда других DL-α-аминогидроксамовых кислот с ацетоном в избытке кетона осуществляются как региоселективные циклоконденсации N,N'-типа с образованием 2,2-диметил-3-гидроксиимидазолидин-4-она (Iа) и его 5-замещенных производных (Ib–e) соответственно с умеренными выходами 55–83% [15–17].

Аналогичным способом образуются спироциклические ГК (II) и (III) на основе реакции GlyГК и DL-аланингидроксамовой кислоты (DL-AlaГК) соответственно с триацетонамином (ТАА) в этаноле с высокими выходами (70–80%) [18].

Исследование хемосенсибилизирующей противолейкозной активности циклических ГК (II) и (III) в комбинации с цитостатиками алкилирующего типа на модели лейкоза Р388 показало способность кислот (II) и (III) усиливать действие цитостатиков, что привело к увеличению продолжительности жизни (УПЖ) животных экспериментальных групп на 30–50% [18].

В настоящей работе изучена возможность осуществления региоселективной реакции циклоконденсации пространственно затрудненной гидрофобной DL-валингидроксамовой кислоты (DL-ValГК) с ТАА с целью получения гомолога кислот (II) и (III). Для изучения взаимозависимости “структура–активность” в ряду производных 1-гидрокси-1,4,8-триазаспиро[4,5]декан-2-она проанализированы структурные особенности полученной спироциклической ГК (IV), а также исследованы ее спектральные данные, хемосенсибилизирующая и антиметастатическая активности в терапии экспериментальной перевиваемой меланомы B16 мышей in vivo с цитостатиком алкилирующего типа – циклофосфамидом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез и спектральные данные гидроксамовой кислоты (IV). Исследование реакции DL-ValГК с ТАА (схема 1 ) в мягких условиях (соотношение реагентов 1 : 1.3, кипячение в этаноле в течение 2 ч), аналогичных проведению реакции GlyГК и DL-AlaГК с ТАА, показало, что хотя реакция и приводит к образованию спироциклической гидроксамовой кислоты (IV), но исходная кислота DL-ValГК вступает в реакцию не полностью (<40%). Попытка изменения условий реакции путем увеличения продолжительности проведения реакции до 5 ч и применения 2-кратного избытка кетона приводит к почти полному расходованию DL-ValГК (до 95%). Однако реакция осложняется образованием олигомерных продуктов, что снижает выход целевого продукта (IV) (<45%).

Схема 1 . Синтез спироциклической гидроксамовой кислоты (IV).

Вероятно, причиной пониженной реакционной способности DL-ValГК служит увеличение пространственной затрудненности и понижение растворимости DL-ValГК по сравнению с GlyГК и DL-АlaГК. В условиях накопления в реакционной смеси побочного продукта – воды и отсутствия выпадения в виде осадка кислоты (IV) из реакционной среды это способствует смещению равновесия реакции в обратном направлении.

Поэтому были предложены более эффективные способы проведения реакции DL-ValГК с ТАА: 1) поэтапный способ – с добавлением новых порций ТАА к непрореагировавшей DL-ValГК (3‒4 этапа); 2) способ дробной отгонки реакционной воды в виде тройной азеотропной смеси EtOH–бензол–Н₂О с периодическим добавлением в реакционную среду абсолютированного бензола. В обоих случаях реакция проводится в мягких условиях и позволяет достичь приемлемого выхода продукта (IV) (64–70%).

Строение кислоты (IV) доказано методами масс-спектроскопии высокого разрешения, ИК-, 1D- (¹H,¹³C (с подавлением или без подавления ¹Н-¹³С ССВ)) и 2D-спектроскопии ЯМР (COSY ¹H-¹H и HSQC ¹Н-¹³С) в растворах CDCl₃ и DMSO-d₆.

Уширенные полосы в области 2700–2200 см^–1 (ν_max = 2616 и 2490 см^–1) в ИК-спектрах (KBr) и положительные тест-реакции с FeCl₃ в MeOH подтверждают наличие ОН-группы в кислоте (IV). Это исключает образование циклического гидроксамата (–CO–NH–OR) посредством возможной альтернативной циклоконденсации N,O-типа.

Согласно данным спектров ¹Н-ЯМР и ¹³С‑ЯМР, кислота (IV) образует кристаллосольваты двух видов: 1) с MeCN и Н₂О в мольном соотношении 2 : 1 : 1 соответственно (т. пл. 152–153°С (из MeCN), (IVa)); 2) с диоксаном в эквимолярном соотношении (т. пл. 158–159°C (из диоксана), (IVb)), аналогично гомологам (II) (с MeCN в соотношении 1 : 1) и (III) (с диоксаном в соотношении 2 : 1) [18].

Спектры ¹Н-ЯМР обеих форм (IVa, b) в CDCl₃ в концентрации 10 мкМ почти идентичны и носят отличия, обусловленные присутствием сигналов сольватных растворителей δ_Н 2.03 (MeCN) или δ_Н 3.73 м.д. (диоксан).

Отнесение сигналов углеродов кислоты (IV) проведено анализом спектров HSQC ¹Н-¹³С форм (IVa) в DMSO-d₆ и (IVb) в CDCl₃ (рис. 1). Отсутствие кросс-пиков сигналов углеродов групп NCN, β-СМе₂ и С=О с сигналами каких-либо протонов в спектрах HSQC ¹Н-¹³С форм (IVa, b) подтверждает апротонный характер этих углеродов.

Химические сдвиги сигнала углерода NCN в спектрах ¹³С-ЯМР (δ_С 77.5 (DMSO-d₆, (IVa), 78.3 м.д. (CDCl₃, (IVb)), отвечающие тетраэдрическому характеру атома углерода, подтверждают спироциклическую структуру кислоты (IV), аналогично данным спектров для кислот (II) (δ_С 79.6, DMSO-d₆) и (III) (80.3, CD₃OD) [18]. С другой стороны, отсутствие сигналов тригонального углерода группы C=N в спектрах ¹³С-ЯМР (δ_С > 150 м.д.) [19] и наличие сигнала протона NH-группы имидазолидинового цикла в спектрах ¹Н-ЯМР (δ_Н 2.32 (DMSO-d₆, с 0.4 М, (IVa), 1.55 (CDCl₃, с 0.05 М, (IVa, b), 1.48 м.д. (CDCl₃, 0.25 M, (IVb)), аналогично данным спектров для гомологов кислот (II) (δ_Н 3.10) и (III) (2.61 м.д., DMSO-d₆) [18], исключает структуру соответствующей ациклической азометиновой формы кислоты (IV) (HONH(C=O)CH(CHMe₂)N=R, где R – тетраметилпиперидиновый цикл.

Отсутствие сигналов азометиновой формы в спектрах ¹Н- и ¹³С-ЯМР указывает на отсутствие медленной в шкале времени ЯМР кольчато-цепной таутомерии ГК (IV) в CDCl₃ и DMSO-d₆.

Отнесение сигнала протона NH-группы имидазолидинового цикла кислоты (IV) основано на сопоставлении данных спектров COSY ¹H-¹H (наблюдаются кросс-пики и вицинальные КССВ протонов NH- и СНСО-групп) и HSQC ¹Н-¹³С (отсутствуют кросс-пики сигнала протона NH-группы с сигналом какого-либо углерода) в растворах CDCl₃ и DMSO-d₆. В спектре ¹Н-ЯМР кислоты (IV) в DMSO-d₆ наблюдается дезэкранирующий эффект для NH-группы по сравнению со спектром в CDCl₃.

Сигналы протонов метильных групп кислоты (IV) в спектрах ¹Н-ЯМР в CDCl₃ и DMSO-d₆ отнесены в соответствии со следующей зависимостью их химических сдвигов: δ_Н (Ме_А < Me_B < Me_C < Me_D). При этом наблюдается обратная последовательность величин химических сдвигов протонов (δ_Н (Ме_А, Ме_В, 1.0–1.2) < δ_H (Me_C, Me_D, 1.3–1.5 м.д.)) и углеродов Ме-групп (δ_С (Ме_А, Ме_В, ~35) > δ_C (Me_C, Me_D, ~29 м.д.)) пиперидинового цикла.

Известно, что сигналы ¹³С аксиальных Ме-групп резонируют в более сильном поле по сравнению с сигналами экваториальных Ме-групп циклогексана (в конформации “кресло” на ~4.5 м.д.) [20]. Это позволяет предположить для групп Ме_С, Ме_D и Ме_А, Ме_В кислоты (IV), соответственно, а- и е-ориентации при пиперидиновом цикле.

Отнесение сигналов углеродов α¹- и α²-метиленовых групп пиперидинового цикла кислоты (IV) в растворах CDCl₃ и DMSO-d₆ основано на следующей зависимости химических сдвигов этих сигналов: δ_α2-С (~45 м.д.) > δ_α1-С (~40 м.д.), аналогично сигналам кислоты (III) (δ_α2-С ~ 45.3 м.д., δ_α1-С ~ ~ 40.8 м.д.) в CD₃OD [18]. Для ахиральной кислоты (II) наблюдается изохронность сигналов углеродов метиленовых групп (δ_α1-С, δ_α2-С 41.3 м.д., DMSO-d₆) [18].

Углерод α₁-СН₂-группы пиперидинового цикла, вероятно, экранируется неподеленной электронной парой (НЭП) атома N1. Углероды метиленовых групп С6 и С7 находятся, соответственно, в транс- и цис-положениях к псевдо-а-ориентации H1N, а значит, соответственно, в цис- и транс-положениях к псевдо-е НЭП при атоме N1, т.е. атомы псевдо-а-С6 и псевдо-е-С7 соответствуют, вероятно, углеродам α₁-СН₂- и α₂-СН₂-групп.

Сигналы протонов АВ-систем α₁- и α₂-метиленовых групп пиперидинового цикла отнесены сопоставлением данных спектров COSY ¹H-¹H и HSQC ¹Н-¹³С. Наблюдается существенно большая разница относительного химического сдвига α₂-СН₂-группы (∆δ_АВ 0.53–0.58 (CDCl₃), 0.17–0.20 м.д. (DMSO-d₆)) по сравнению с α₁‑СН₂-группой (∆δ_АВ 0.16–0.2 (CDCl₃), 0.05 м.д. (DMSO-d₆)) кислоты (IV). Аналогичное соотношение ∆δ_АВ отмечается и для гомологов (II) (0.05) и (III) (0.25 и 0.07 м.д.) в DMSO-d₆ [18]. В растворе CDCl₃ кислоты (IV) это происходит в основном за счет дезэкранирования слабопольного протона α₂-Н_В по сравнению с протоном α₁-Н_В (∆δ (α₁,α₂-Н_В) 0.28 м.д.). В то же время сильнопольные протоны α₂-Н_А и α₁-Н_В метиленовых групп показывают меньшее различие химических сдвигов их сигналов (∆δ (α₁,α₂-Н_А) 0.09 м.д.). В растворе DMSO-d₆ наблюдается изохронность сигналов протонов α₁-Н_А и α₂-Н_А метиленовых групп кислоты (IV).

Сравнение величин ∆δ_АВ метиленовых групп кислоты (IV) указывает на большую конформационную подвижность α₁-СН₂-группы в процессе интерконверсии пиперидинового цикла, которая осуществляется, вероятно, по механизму осциллирующего псевдовращения [19].

Интересно, что конформационная подвижность пиперидинового цикла в кислоте (IV), как и в кислотах (II) и (III) [18], выше в биполярном апротонном растворителе DMSO-d₆, склонном к образованию ассоциатов с молекулами растворенного в нем вещества, по сравнению с малополярным CDCl₃.

В спектрах ¹Н-ЯМР обеих форм (IVa, b) в CDCl₃ наблюдается дальняя КССВ ⁴J_Н,Н 1.6 Гц (с 0.25 М), 2.0 Гц (с 0.05 М) между сильнопольными протонами α₁-Н_А и α₂-Н_А метиленовых групп. Это возможно при экваториальной ориентации этих протонов в конформации “кресло” пиперидинового цикла, поскольку реализуется транс-W-конфигурация разделяющих их связей, тогда как для слабопольных протонов α₁-Н_В и α₂-Н_В этих групп аксиальной ориентации реализуется цис-конфигурация разделяющих их связей, при которой не должно наблюдаться заметной ⁴J_Н,Н.

Приписывание сильнопольным (Н_А) и слабопольным (Н_В) протонам α-метиленовых групп пиперидинового цикла кислоты (IV) в спектрах ¹Н-ЯМР в CDCl₃, соответственно, экваториальной и аксиальной ориентаций подтверждается анализом спектров ¹Н-ЯМР в CDCl₃ и DMSO-d₆ аналогичных циклических ГК [20], имеющих незамещенные α- и β-метиленовые группы пиперидинового цикла. Согласно характеру вицинальных взаимодействий протонов этих групп, для слабопольных протонов α-Н_В и β-Н_В, в отличие от сильнопольных протонов α-Н_А и β-Н_А, наблюдается большая КССВ (³J (α-Н_В, β-Н_В) ≥ 10 Гц), что возможно только для аксиальных протонов транс-ориентации в преимущественной конформации “кресло” пиперидинового цикла [21, 22].

Наблюдаемые в спектрах ¹Н-ЯМР (IVa, b) КССВ протона группы СНС=О с протонами СНМе₂ (³J (CHCO, CHMe₂) 4.8–4.9 (CDCl₃), 6.3–6.5 Гц (DMSO-d₆)) и NH-групп (³J (CHСО, NH) 10.2–10.3 (c 0.05 M, CDCl₃), 9.9 (c 0.25 M, CDCl₃), 10.7 Гц (DMSO-d₆)) свидетельствует, соответственно, о взаимной цис- и транс-ориентации этих протонов, т.е. конформационной однородности имидазолидинового цикла в растворе сильно различающихся по полярности растворителей.

Острая токсичность гидроксамовой кислоты (IV) in vivo. При изучении острой токсичности на мышах-гибридах линии BDF₁ показано, что при однократном внутрибрюшинном введении соединения (IV) гибель животных отмечалась на 1-е и 2-е сутки наблюдения после инъекции раствора гидроксамовой кислоты в дозе 500–900 мг/кг. У выживших животных каких-либо клинических проявлений интоксикации и изменений в поведенческих реакциях не наблюдалось до конца опыта. На рис. 2 представлена кривая нарастания токсичности гидроксамовой кислоты (IV) по мере увеличения дозы, исходя из которой была определена величина LD₅₀ = 730.4 ± 32.4 мг/кг, а также были рассчитаны токсические дозы: LD₁₆ = = 639.7; LD₈₄ = 833.9 и LD₁₀₀ = 885.7 мг/кг.

Результаты исследования острой токсичности позволяют отнести соединение (IV) к III классу токсичности, т.е. данная гидроксамовая кислота – умеренно токсичное соединение в соответствии с ГОСТ 12.1.007–76.

Хемосенсибилизирующая противоопухолевая активность кислоты (IV) in vivo. Для оценки хемосенсибилизирующего противоопухолевого и антиметастатического действия гидроксамовой кислоты (IV) на модели экспериментальной перевиваемой меланомы B16 на самцах мышей-гибридов линии BDF₁ для внутрибрюшинного введения была взята одна третья часть от величины LD₅₀, которая составила 233 мг/кг. При монотерапии гидроксамовой кислотой и цитостатиком было выявлено достоверное увеличение индекса ингибирования метастазирования (ИИМ) – до 12.82 и 38.46% соответственно. При применении комбинированной химиотерапии циклофосфамидом с исследуемым соединением (IV) наблюдалось двукратное увеличение данного показателя по сравнению с группой циклофосфамид (до 74.36%) и появление эффекта усиления противоопухолевого действия известного цитостатика, что может свидетельствовать о проявлении данной ГК адъювантной способности. Терапия меланомы B16 низкотоксичной кислотой (IV) в комбинации с циклофосфамидом позволила достичь торможения роста опухоли животных экспериментальных групп до 31.56%, что более чем в 1.5 раза выше данного показателя при монотерапии циклофосфамидом (табл. 1). Ранее нами также было показано усиление противолейкозного действия циклофосфамида в комбинированной терапии лимфолейкоза Р388, которое выражалось в увеличении выживаемости животных до 38% и увеличении средней продолжительности жизни невылеченных животных почти в 2 раза по сравнению с монотерапией данным цитостатиком [23].

Введение разветвленной изопропильной группы при имидазолидиновом цикле приводит к значительному повышению хемосенсибилизирующей способности кислоты валинового ряда (IV) по сравнению с ее гомологами глицинового (II) и аланинового ряда (III), активность которых была описана нами ранее [21]. Наибольшее отличие в хемосенсибилизирующей активности наблюдается при совместном действии кислоты (IV) и циклофосфамида (ИИМ ~74%, УПЖ >280% [23]).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез гидроксамовой кислоты (IV). ИК-спектры образцов соединений, запрессованных в таблетки с KBr, регистрировали на спектрометре Specord-82M (Analytik Jena, Германия) в области 400–4000 см^–1. Масс-спектры высокого разрешения снимали на квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре Sciex QStar (SCIEX, США) с ортогональным вводом ионов и на масс-спектрометре Thermo Fisher Exactive (Thermo Fisher Scientific, США) с источником ионизации электрораспылением и масс-анализатором Orbitrap. Для ионизации были взяты растворы исходных веществ в ацетонитриле с концентрацией ~10 мкМ. При расчете молекулярных масс использовали следующие величины атомных масс: Н – 1.007825, О – 15.994915, С – 12.000000, N – 14.003074. Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker Avance III-500 (Bruker, Германия) с частотой 500.20 МГц (¹H) и 125.775 МГц (¹³C). Химические сдвиги ядер ¹Н и ¹³С определяли относительно остаточных сигналов растворителя (δ, м.д., 2.50 и 39.52 для DMSO-d₆, 7.26 и 77.16 для CDCl₃ соответственно). Температуры плавления определяли на микронагревательном столике Boetius RNMK (Boetius, Германия). Элементный анализ (С, Н, N) выполняли на микроанализаторе Vario MicroCube Elementar (Elementar, Германия). DL-ValГК ((R,S)-2-амино-3-метилбутирогидроксамовая кислота, (R,S)-N-гидроксиамид-2-амино-3-метилмасляной кислоты) синтезировали по известной методике [24].

1-Гидрокси-3-изопропил-7,7,9,9-тетраметил-1,4,8-триазаспиро[4,5]декан-2-он (IV). Масс-спектр (ESI), m/z: 270.2192 (M + H)⁺. C₁₄H₂₇N₃O₂. Вычислено: 270.2176 (M + H)⁺.

Гидроксамовая кислота (IVa). Cпектр ¹Н-ЯМР (CDCl₃, с 0.05 М, δ, м.д., J, Гц): 0.96 (д, 3Н, СНМе_А, ³J 6.9), 1.06 (д, 3Н, СНМе_В, ³J 6.9), 1.20 (с, 3Н, β-Ме_А), 1.23 (с, 3Н, β-Ме_В), 1.44 (с, 3Н, β-Ме_С), 1.46 (с, 3Н, β-Ме_D), 1.46 (д.д, 1Н, α₂-Н_А, ²J 13.9, ⁴J_α1-HA 2.0), 1.55 (д.д, 2Н, NH + α₁-H_A, J 13.6, J 2.0), 1.71 (д, 1Н, α₁-Н_В, ²J 13.6), 1.99 (д, 1Н, α₂-Н_В, ²J 13.9), 2.03 (с, 1.5 Н, MeCN), 2.10 (д. гепт, 1Н, СНМе₂, ³J_Ме 6.9, ³J_СНСО 4.8), 3.33 (д.д, 1Н, СНСО, ³J_NH 10.2, ³J_СНМе2 4.8), 4.96 (уш. с, 2Н, 0.5Н₂О + + NOH).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆, с 0.4 М, δ, м.д., J, Гц): 0.93 (д, 3Н, СНМе_А, ³J 6.6), 1.02 (д, 3Н, СНМе_В, ³J 6.7), 1.05 (с, 3Н, β-Ме_А), 1.06 (с, 3Н, β-Ме_В), 1.34 (с, 3Н, β-Ме_С), 1.35 (с, 3Н, β-Ме_D), 1.42 (уш. д, 2Н, α₁‑Н_А + α₂-Н_А, ²J 13.3), 1.47 (д, 1Н, α₁-Н_В, ²J 13.3), 1.62 (д.д, 1Н, α₂-H_В, ²J 13.5, J 2.4), 1.90 (д. гепт, 1Н, СНМе₂, ³J_Ме 6.9, ³J_СНСО 6.5), 2.08 (с, 1.5Н, 0.5 MeCN), 2.32 (уш. д, 1Н, NH, ³J_CHCO 10.7), 3.07 (д.д, 1Н, СНСО, ³J_NH 10.7, ³J_СНМе2 6.3), 3.71 (уш. с, Н₂О + NOH).

Спектр ¹³С-ЯМР (DMSO-d₆, с 0.4 М, δ, м.д., J, Гц): 1.42 (к, 0.5С, MeCN, ¹J 135.8), 18.67 (к.м, 1С, СНМе_А, ¹J 125.8), 18.95 (к.м, 1С, СНМе_В, ¹J 125.8), 29.15 (к.м, 1С, β-Ме, ¹J 125.8), 29.27 (д.м, 1С, СНМе₂, ¹J 127.0), 29.34 (к.м, 1С, β-Ме, ¹J 125.8), 35.25 (к.м, 1С, β-Ме, ¹J 125.8). 35.35 (к.м, 1С, β-Ме, ¹J 125.8), 39.69 (т, 1С, α₁-СН₂, ¹J 127.0), 44.19 (т, 1С, α₂-СН₂, ¹J 127.0), 50.11 (м, 1С, β-СМе₂), 50.20 (м, 1С, β‑СМе₂), 59.88 (д, 1С, СНСО, ¹J 139.6), 77.45 (м, 1С, NCN), 118.06 (к, 0.5С, MeCN, ²J 10.1), 171.27 (д.д, 1С, С=О, J 3.8, J 2.5).

Гидроксамовая кислота (IVb). Спектр ¹Н-ЯМР (CDCl₃, с 0.05 М, δ, м.д., ³J, Гц): 0.97 (д, 3Н, СНМе_А, ³J 6.9), 1.07 (д, 3Н, СНМе_В, ³J 6.9), 1.20 (с, 3Н, β‑Ме_А), 1.23 (с, 3Н, β-Ме_В), 1.44 (с, 3Н, β-Ме_С), 1.46 (с, 3Н, β-Ме_D), 1.47 (д.д, 1Н, α₂-Н_А, ²J 13.9, ⁴J_α2-HA 2.0), 1.55 (д.д, 2Н, NH + α₁-H_A, J 13.4, J 2.0), 1.69 (д, 1Н, α₁-Н_В, ²J 13.7), 1.97 (д, 1Н, α₂-Н_В, ²J 14.0), 2.12 (д. гепт, 1Н, СНМе₂, ³J_Ме 6.9, ³J_СНСО 4.9), 3.35 (д.д, 1Н, СНСО, ³J_NH 10.3, ³J_СНМе2 4.9), 3.73 (с, 8Н, диоксан).

Спектр ¹Н-ЯМР (CDCl₃, с 0.25 М, δ, м.д., ³J, Гц): 0.88 (д, 3Н, СНМе_А, ³J 6.9), 0.99 (д, 3Н, СНМе_В, ³J 6.9), 1.15 (с, 3Н, β-Ме_А), 1.17 (с, 3Н, β-Ме_В), 1.38 (д.д, 1Н, α₂-Н_А, ²J 13.9, ⁴J_α2-HA 1.6), 1.39 (с, 3Н, β-Ме_С), 1.41 (с, 3Н, β-Ме_D), 1.48 (д.д, 2Н, NH + α₁-H_A, J 13.5, J 1.6), 1.68 (д, 1Н, α₁-Н_В, ²J 13.5), 1.96 (д, 1Н, α₂-Н_В, ²J 13.9), 2.04 (д. гепт, 1Н, СНМе₂, ³J_Ме 6.9, ³J_СНСО 4.8), 3.24 (д.д, 1Н, СНСО, ³J_NH 9.9, ³J_СНМе2 4.8), 3.65 (с, 8Н, диоксан), 6.06 (уш.с, 1Н, NOH).

Спектр ¹³С-ЯМР (CDCl₃, с 0.25 М, δ, м.д., ³J, Гц): 17.66 (1С, СНМе_А), 18.88 (1С, СНМе_В), 28.46 (1С, β-Ме_D), 28.74 (1C, β-Ме_C), 28.94 (1C, СНМе₂), 35.04 (1C, β-Ме_B), 35.23 (1C, β-Ме_A), 40.68 (1C, α₁‑CH₂), 45.63 (1C, α₂-CH₂), 51.15 (2C, β-CМе₂), 60.71 (1C, CHCO), 67.07 (4C, диоксан), 78.34 (1C, NCN), 170.91 (1C, C=O).

Острая токсичность гидроксамовой кислоты (IV). Острую токсичность (LD₅₀) определяли на мышах-гибридах BDF₁, полученных из УНУ Питомник и виварий ФГБУН “Институт проблем химической физики” РАН, при однократном внутрибрюшинном введении водных растворов кислоты (IV) по методу, описанному в работе [25]. Исследования острой токсичности соединения (IV) проводили в соответствии с ГОСТ ISO 10993-11-2011. В качестве тест-объекта использовали самцов мышей-гибридов линии BDF1 весом 21–24 г (n = 30). Животных содержали в соответствии с методическими рекомендациями по содержанию лабораторных животных в вивариях со свободным доступом к воде и пище. В каждую опытную группу рандомизированно распределяли по шесть особей с использованием в качестве основного критерия массу тела так, чтобы различия в данном параметре между особями не превышали 20%. Соединения вводили животным однократно внутрибрюшинно в виде водного раствора в диапазоне доз 500–900 мг/кг массы тела животного. Для учета гибели и оценки общего клинического состояния мышей наблюдения за животными проводили непрерывно в течение первых 30 мин после введения вещества, затем с интервалом 1 ч в течение 4 ч и далее ежедневно один раз в день. Общий срок наблюдения составил 14 сут. Для определения токсических доз строили кривую нарастания токсичности по мере увеличения дозы. Расчет доз LD₁₆, LD₅₀, LD₈₄ и LD₁₀₀ проводили с использованием метода пробит-анализа.

Хемосенсибилизирующая активность гидроксамовой кислоты (IV). Исследование хемосенсибилизирующей активности гидроксамовой кислоты (IV) проводили на модели экспериментальной перевиваемой меланомы B16 на самцах мышей-гибридов линии BDF₁ весом 22–24 г (n = 32), полученных из УНУ Питомник и виварий ФГБУН “Институт проблем химической физики” РАН. Мышей содержали в клетках со свободным доступом к воде и пище. Опухоли трансплантировали подкожно (инокулум измельченной опухолевой ткани в изотоническом растворе NaCl 1 : 5 в объеме 0.2 мл). Противоопухолевый цитостатик циклофосфамид (в субтерапевтической дозе) и соединение (IV) вводили в виде водных растворов внутрибрюшинно. Дозы и режимы введения (сутки после трансплантации опухоли) указаны в табл. 1. Отдельная группа животных-опухоленосителей, получавшая вместо инъекций препаратов растворитель, служила контролем. Каждая группа содержала восемь мышей. Наблюдение за животными проводили ежедневно в течение 24 сут, после чего мышей выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков, извлекали внутренние органы, проводили взвешивание опухоли и подсчет метастазов в легких. Антиметастатическую активность соединений определяли по изменению индекса ингибирования метастазирования (ИИМ) по формуле:

где А_о и А_к – частота метастазирования в опытной и контрольной группах соответственно; В_о и В_к – среднее число метастазов в опытной и контрольной группах животных соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Было показано, что реакция DL-валингидроксамовой кислоты с триацетонамином проходит как N,N'-региоселективная циклоконденсация с образованием (±)-1-гидрокси-3-изопропил-7,7,9,9-тетраметил-1,4,8-триазаспиро[4,5]декан-2-она. В ходе исследования антиметастатической и противоопухолевой активности синтезированной циклической гидроксамовой кислоты (IV) была обнаружена ее способность повышать чувствительность экспериментальной перевиваемой меланомы В16 мышей к действию циклофосфамида (известного цитостатика алкилирующего действия, использованного в субтерапевтической дозе), проявляя тем самым хемосенсибилизирующие свойства. Было показано значительное снижение количества метастазов, а также торможение роста опухоли у животных экспериментальной группы. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности синтеза циклических гидроксамовых кислот на основе DL-валина в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.