Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 1, стр. 109-114

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ, в мире ~71 млн человек инфицировано вирусом гепатита С (ВГС). Ежегодно регистрируют ~2 млн новых случаев заражения, а от осложнений хронического гепатита С ежегодно умирают почти 400 тыс. человек [1]. С момента открытия ВГС его генетическое разнообразие ученые связывали лишь с высокой частотой возникновения мутаций, накапливаемых в геноме. Однако в 2002 г. в России впервые была обнаружена циркулирующая рекомбинантная форма ВГС, названная RF1_2k/1b [2]. Установлено, что данная форма возникла на территории бывшего СССР (по одним данным, в период с 1923 по 1956 гг. [3], а по другим – с 1957 по 1970 гг. [4]) в результате индивидуального рекомбинационного события. Все структурные гены этого рекомбинанта относятся к субтипу 2k, а неструктурные, начиная с точки рекомбинации и далее в направлении области 3'-UTR – к субтипу 1b. Циркулирующая рекомбинантная форма ВГС RF1_2k/1b была впоследствии обнаружена в Грузии, Узбекистане, Ирландии, Франции, Германии, Кипре, Израиле и Греции [5–9]. Правильное и своевременное выявление рекомбинантной формы ВГС RF1_2k/1b – необходимое условие для назначения эффективной терапии [10–13].

Определение рекомбинантной формы ВГС RF1_2k/1b, базирующееся только на анализе локусов 5'-UTR или Core генома ВГС, – недостаточно и требует либо внедрения двухлокусного анализа с добавлением в исследование неструктурных генов (например, NS5b), либо их секвенирования по методу Сэнгера [14–16]. Это подтверждается анализом образцов сыворотки крови пациентов (республика Башкортостан), инфицированных ВГС. При использовании коммерческих тест-систем ВГС, выявленный в этих образцах, был отнесен к генотипу 2. В действительности ~20% из них – рекомбинантная форма RF1_2k/1b [17]. Подобрать на район точки рекомбинации общий для всех изолятов олигонуклеотидный TaqMan-зонд для детекции рекомбинанта RF1_2k/1b методом ОТ-ПЦР в реальном времени не представляется возможным из-за высокой вариабельности этих последовательностей [17].

Ранее нами на примере типирования с применением микрочипов вируса гриппа А [18, 19], вируса оспы [20] и ряда урогенитальных инфекций [21] была показана эффективность использования подхода “много зондов/один спот” (MPOS-подход). Сущность его заключается в том, что при одновременном наличии в пределах одного спота нескольких типирующих зондов существенно повышается как специфичность, так и чувствительность метода. Это обусловлено связыванием анализируемой ДНК со всеми или большей частью зондов спота с высокой степенью кооперативности [20]. Мы предположили, что MPOS-подход на микрочипе или более простой в техническом отношении его вариант (например, биосенсор) позволит определить рекомбинантную форму ВГС RF1_2k/1b. Полагая, что выбрав два набора характерных зондов (один для 2k-области, а второй для 1b-области), можно определить, к какому субтипу относится анализируемый изолят – 2k, 1b или рекомбинанту RF1_2k/1b.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе были использованы ампликоны, полученные ранее в результате ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием РНК, выделенной из образцов сыворотки крови пациентов, инфицированных вирусом гепатита С субтипов 1b, 2k и рекомбинантом RF1_2k/1b [17]. Для расчета зондов были использованы олигонуклеотидные последовательности 47 ампликонов, отнесенных Акимовым с соавт. [17] к рекомбинанту RF1_2k/1b. Расчет и отбор зондов проводили с использованием компьютерной программы, созданной ранее для расчета зондов для типирования вируса гриппа А [22]. Протяженность зондов составляла 14 оснований, т.к. таковая оказалась оптимальной при использовании MPOS-подхода [20]. Вариабельность олигонуклеотидных последовательностей секвенированных ампликонов весьма высока, и найти даже небольшое число зондов, характерных для большинства изолятов, затруднительно [17]. Поэтому отбор проводили таким образом, чтобы зонд был характерен не менее чем для 15% ампликонов. В итоге для 2k-региона было отобрано 13 зондов, а для 1b-региона – 11 зондов. В табл. 1 приведены структуры зондов и их встречаемость в проанализированных ампликонах. На 3'-конце эти зонды содержали необходимый для иммобилизации аминогексильный линкер.

Для каждого из 47 рассмотренных ампликонов есть от 3 до 6 характерных последовательностей как для 1b-, так и для 2k-региона. Каждый из рассчитанных зондов содержится в 15–78% анализируемых последовательностей (табл. 1). Ниже в качестве примера приведена одна из последовательностей (Sample_14_Rec). Левее точки рекомбинации (отмечена подчеркиванием) серым выделены последовательности, характерные для субтипа 2k (пять последовательностей), правее – характерные для субтипа 1b (пять последовательностей).

Следует отметить, что данный набор зондов пригоден и для характеризации рекомбинантов, не использованных при расчете, а взятых из базы данных GenBank по рекомбинантам, выявленным не только в России, но и других странах: Узбекистане, Австрии, Ирландии, Кипре, Израиле, Греции и др. Например, изолят, описанный в 2011 г. на Кипре (GenBank: HQ537005.1), характеризуется пятью 2k-зондами и шестью 1b-зондами. Первый из обнаруженных рекомбинантов, выделенный в Санкт-Петербурге (Россия) в 2001 г. (Ge-nBank: AY070215.1), определяется тремя и пятью зондами соответственно. Аналогичная картина наблюдается и для других изолятов рекомбинанта ВГС RF1_2k/1b, представленных в базе данных NCBI. Поэтому можно полагать, что этот набор зондов может быть использован для выявления рекомбинантов ВГС RF1_2k/1b из других географических источников и в достаточно широком временном интервале. Для экспериментальной проверки рассчитанного набора зондов (табл. 1) был сформирован микрочип (рис. 1), в котором споты для определения генотипа 2k со-держали все 13 зондов, относящихся к гено-типу 2k, а споты для определения генотипа 1b – все 11 зондов, относящихся к генотипу 1b.

Рис. 1.

(а) – Дизайн микрочипа: A4–A6, A10–A12 – смесь 2k-зондов (2k); B1–B3, B7–B9 – смесь 1b-зондов (1b); C1‒C3, C7–C9 – 5'-AGAGAGAGAGAGAG-3' (контроль неспецифического связывания [23]) (N); C4–C6, C10–C12 – маркер ((dC)₃₀-биотин) (M); A1–A3, A7–A9, B4–B6, B10–B12 – буфер для печати (B); картина гибридизации ампликонов вируса гепатита C генотипа 1b (б); генотипа 2k (в) и рекомбинанта RF1_2k/1b (г).

При гибридизация ампликона генотипа 1b наблюдается флуоресценция спотов, содержащих смесь зондов для определения этого генотипа (рис. 1б). Флуоресценция спотов, содержащих смесь зондов для определения генотипа 2k, невелика и близка к таковой для контроля неспецифического связывания и буферного раствора. Соотношениe уровней флуоресценции спотов, соответствующих генотипам 1b и 2k, составляет ~93 : 1. Для других образцов это соотношение варьируется от 29 до 210 раз (среднее значение 90 для 18 образцов).

Вирус гепатита С субтипа 2k встречается существенно реже, и нам был доступен лишь один изолят. Следует отметить, что и в литературе, и в базе NCBI данных по нуклеотидным последовательностям гена NS2 для субтипа 2k гораздо меньше, чем для субтипа 1b и рекомбинанта RF1_2k/1b. Чуб с соавт. [4] полагают, что это обусловлено приобретением рекомбинантом RF1_2k/1b неструктурной части генома, содержащей гены, кодирующие репликативный комплекс, от родительского субтипа 1b, что дало ему преимущество в распространении по сравнению с субтипом 2k. На рис. 1в приведена картина гибридизации для ампликона, полученного из изолята ВГС субтипа 2k. Соотношение уровней флуоресценции спотов, соответствующих субтипам 2k и 1b, составляет ~8 : 1.

Полученные результаты гибридизации по индивидуальным субтипам 1b и 2k показывают, что выбранные наборы олигонуклеотидных зондов позволяют проводить однозначное определение этих субтипов ВГС.

На рис. 1г приведена картина гибридизации ампликона ВГC рекомбинанта RF1_2k/1b (Sample_14_Rec). Значения флуоресценции типирующих спотов на субтипы 1b и 2k близки, что позволяет провести однозначное отнесение этого изолята к рекомбинанту RF1_2k/1b. Для других рекомбинантных изолятов наблюдается аналогичная картина. Соотношение флуоресценции спотов, соответствующих генотипам 2k и 1b, варьируется от образца к образцу в интервале 0.56–1.44 (среднее значение 0.94 для 47 образцов) и определяется количеством зондов, комплементарных анализируемой последовательности, прочностью дуплекса, образованного этими зондами, и последовательностью ампликона, что отмечалось в работе Kostina et al. [20].

Таким образом, близкие по значению уровни флуоресценции спотов, содержащих смесь типирующих зондов на субтипы 2k и 1b, указывают на наличие в анализируемом образце рекомбинантной формы ВГС RF1_2k/1b. Если же уровни флуоресценции типирующих спотов на субтипы 2k и 1b весьма существенно различаются, то ВГС относится либо к субтипу 2k, либо к субтипу1b.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Олигонуклеотидные зонды были синтезированы в ИХБФМ СО РАН на автоматическом восьмиколоночном синтезаторе ASM-800 (ООО “Биоссет”, Новосибирск) по стандартной методике с введением по 3'-концу олигонуклеотида С6-аминолинкера, необходимого для иммобилизации зондов. Печать микрочипов осуществляли на стеклянных эпокси-слайдах (Tekdon, США) методом контактной печати на споттере Odissey Calligrapher (Bio-Rad, США) пином 360 мкм. При печати микрочипов смесевые споты содержали все 13 зондов, относящихся к генотипу 2k, и все 11 зондов, относящихся к генотипу 1b. Печать осуществляли по методике, описанной в работе Kostina et al. [20], с использованием эквимолярных количеств зондов с одинаковой конечной суммарной концентрацией 80 нм/мл. Смесевые споты, а также споты буфера для печати, контроля неспецифического связывания и маркера печатали в шести повторах (рис. 1).

В настоящей работе исследовали образцы сыворотки крови пациентов, инфицированных вирусом гепатита С, субтип которых был подтвержден секвенированием Акимовым с соавт. [17]. Всего было проанализировано 18 образцов ВГС субтипа 1b, 1 образец субтипа 2k и 47 образцов рекомбинанта RF1_2k/1b. Наработку ампликонов для гибридизации проводили по методикам, описанным в работе Акимова с соавт. [17], с использованием праймеров, последовательности которых приведены в табл. 2. Для получения преимущественно одноцепочечной ДНК, содержащей биотиновую метку, проводили ПЦР в асимметричном режиме [20].

Процедура гибридизации ампликонов и обработки слайда конъюгатом стрептавидин-Cy5, связывающимся с биотиновой меткой ампликона, была аналогична описанной в работе Kostina et al. [20]. После отмывки слайда флуоресценцию спотов регистрировали на сканере ScanArray Ex-press 2.0 (PerkinElmer, США) при длине волны возбуждающего лазера 633 нм. Изображение анализировали с использованием программы S-canArray Express, входящей в математическое обеспечение сканера. Уровень флуоресценции определяли как среднее значение флуоресценции шести спотов микрочипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На примере рекомбинантной формы RF1_2k/1b вируса гепатита С нами изучена возможность использования подхода “много зондов/один спот” для ее выявления. Анализ клинических образцов сыворотки крови показал, что данный подход дает возможность провести однозначное отнесение выявленного в этих образцах вируса гепатита С к субтипам 2k, 1b или их рекомбинанту RF1_2k/1b. Результаты, полученные с использованием микрочипов, при соответствующем техническом решении могут быть использованы для создания биосенсора для типирования различных субтипов вируса гепатита С.