Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 4, стр. 381-414

Молекулярные шапероны системы контроля качества белков

Сообщество молекулярных шаперонов СКК [2, 8, 9] наряду с триггер-фактором (TF, 48 кДа), связанным с рибосомой и участвующим в котрансляционном сворачивании новосинтезированных белков [10], включает целый ряд семейств белков теплового шока (Heat shock proteins, Hsps), различающихся молекулярными массами (от 12–43 кДа у sHsps (small Hsps, малые белки теплового шока) до 100 кДа у белков семейства Hsp100) (рис. 1) [2, 9, 11–15]. При этом белки Hsp60, Hsp70, Hsp90 и Hsp100 (табл. 1) обладают АТРазной активностью, что определяет динамический характер их существования и обеспечивает высокую конформационную гибкость. Условно молекулярные шапероны разделяются на группы фолдеров, холдеров и анфолдеров [16]. Фолдеры (семейства Hsp60, Hsp70 и Hsp90) участвуют в сворачивании белковых мишеней, предотвращая нежелательные взаимодействия между белками, еще не достигшими нативного состояния; холдеры (sHsps) удерживают частично фолдированные мишени, не влияя на их конформацию; анфолдеры (Hsp100), обладающие транслоказной активностью, разворачивают белковые субстраты [9, 16]. Для большинства семейств шаперонов получены данные рентгеноструктурного анализа их представителей [17].

Высококонсервативное семейство шаперонов Hsp70, участвующее в большом количестве разнообразных биологических процессов, сформировано, главным образом, каноническими белками DnaK у бактерий и подобными им белками Hsp70 у эукариот [12, 18]. Сверх того, эукариоты содержат также ряд неканонических шаперонов Hsp70, таких как белки Grp78, Grp170 и Hsp110 [19]. Представители семейства локализованы как в цитозоле, так и в различных органеллах (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, хлоропласты) [12, 18].

В физиологических условиях шапероны Hsp70 способствуют фолдингу белковых мишеней, а при стрессе они предотвращают агрегацию развернутых белков и, кроме того, совместно с шаперонами семейства Hsp100 проводят солюбилизацию и рефолдинг агрегированных белков [20]. В структуре Hsp70 различают три домена: N-концевой АТРазный, центральный субстрат-связывающий и вариабельный С-концевой, который участвует как в связывании мишеней, так и во взаимодействии с различными партнерскими белками и модулировании шапероновой функции [9, 18].

Функционирование Hsp70 основано на изменении сродства шаперона к белковым мишеням в зависимости от природы связанного нуклеотида – АТР-форма Hsp70 проявляет пониженную по сравнению с ADP-формой аффинность к белкам. Регуляторами АТРазной и шапероновой активностей Hsp70 служат кошапероны группы Hsp40/J-домен-содержащих белков и факторы нуклеотидного обмена (NEF) (табл. 1) [9, 21]. Связывание белков-мишеней с шапероном опосредуется предварительным образованием комплексов субстрат–кошаперон с участием С-концевого домена Hsp40, после чего комплекс доставляется к Hsp70. Взаимодействие АТРазного домена шаперона с N-концевым J-доменом Hsp40 стимулирует гидролиз связанного АТР, а действие фактора NEF ускоряет последующие стадии высвобождения нуклеотида (в ADP-форме) и связывания новой молекулы АТР, сопровождающиеся диссоциацией белкового субстрата.

В недавних исследованиях установлено, что и эукариотические шапероны Hsp70, и бактериальные DnaK существуют не только в мономерной форме, но и как димеры, тримеры и более высокие олигомеры. На равновесие в таких смесях влияет присутствие нуклеотида и его природа (ATP или ADP) [22].

Шапероны Hsp60 или шаперонины оказались первым идентифицированным семейством шаперонов, для которого была выявлена важная роль в биогенезе клеточных белков и которое широко распространено в бактериях и в митохондриях, пластидах и цитоплазме эукариот (табл. 1) [12, 18]. Функциональными структурами шаперонинов служат тетрадекамеры, образованные двумя гептамерными кольцами, в каждом из которых сформирована центральная полость. Эти структуры способны в своих противоположных полостях попеременно связывать и инкапсулировать белки, подлежащие рефолдингу [9].

Наиболее изученный представитель семейства Hsp60 – шаперонин GroEL из Escherichia coli, функционирующий в комплексе с кошаперонином GroES – белком теплового шока семейства Hsp10 (табл. 1) [9, 12, 18, 23, 24]. Мономеры GroEL построены из трех доменов: апикального (Ap), шарнирного промежуточного (Hinge) и С-концевого экваториального (Eq), несущего АТРазный центр [23–25]. Кольцевые гептамеры GroEL, состыкованные своими Eq-доменами, образуют зеркально симметричные тороиды с двумя изолированными гидрофобными полостями, способными в АТР-связанном состоянии размещать развернутые полипептиды размером до 60 кДа [9, 12]. Кошаперонины GroES, которые также образуют циклические куполообразные гептамеры, поочередно прикрывают торцы тороида GroEL, взаимодействуя с его входными отверстиями, сформированными Ар-доменами. Эти превращения в сопряжении с гидролизом АТР вызывают значительные конформационные изменения шаперонина, которые приводят к увеличению размеров и гидрофилизации полости, содержащей инкапсулированный субстрат, а это способствует фолдингу мишени, последующему ее высвобождению вместе с ADP и кошаперонином из комплекса с GroEL и началу нового цикла рефолдинга белкового субстрата [9, 12].

Следует отметить, что при фолдинге крупных субстратов, в том числе мультидоменных белков-мишеней, инкапсулирование которых в полость комплекса GroEL/GroES невозможно, реализуется альтернативный механизм, согласно которому связывание определенного фрагмента белка-мишени и кошаперонина GroES происходит на противоположных кольцах тетрадекамера GroEL [9, 26].

Шапероны Hsp90 присутствуют в высоких концентрациях в бактериях и эукариотах и не обнаруживаются в археях. У бактерий обычно выявляется единственный Hsp90-шаперон, в то время как эукариоты содержат по два шаперона в цитозоле, и, кроме того, белки Hsp90 локализованы в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и в хлоропластах [27–29]. Эукариотические шапероны Hsp90 функционируют в составе комплексных систем, включающих как другие шапероны (в частности, Hsp70), так и сеть разнообразных кошаперонов (табл. 1) [9, 12, 27–30]. Семейство Hsp90 вовлечено в процессы созревания ключевых сигнальных белков, а также участвует в сборке и разборке различных белковых комплексов. Белками-клиентами для Hsp90 служат различные протеинкиназы, факторы транскрипции, рецепторы стероидных гормонов и др. Интересно, что бактериальные шапероны Hsp90 не имеют собственных кошаперонов, и их ремоделирующая функция обеспечивается исключительно путем взаимодействия с системой шаперона Hsp70 [31].

По структурной организации Hsp90 – это гомодимеры, протомеры которых включают N-концевой нуклеотид-связывающий (N) и центральный (М) домены, формирующие АТРазный модуль, а также С-концевой домен, ответственный за димеризацию шаперона [28, 29]. Частично развернутые клиентские белки зачастую доставляются к Hsp90 посредством системы шаперона Hsp70 и связываются с М- и С-доменами Hsp90. Регуляция функциональной активности Hsp90-белков эукариот осуществляется с помощью набора кошаперонов, которые в определенном порядке связываются с разными доменами шаперона, включая специфический С-концевой мотив MEEVD, отсутствующий у бактериальных Hsp90. Апо-форма Hsp90, представляющая собой “раскрытый” V-образный димер, образует сложный комплекс с белком-клиентом и необходимыми кошаперонами. Взаимодействие этого комплекса с АТР приводит к возникновению контактов между N-доменами с образованием “закрытой” формы шаперона и к ремоделированию связанной на его поверхности белковой мишени. В результате гидролиза АТР происходит диссоциация N-доменов с образованием ADP-связанного “полураскрытого” V-димера, из которого высвобождаются белок-клиент, ADP и неорганический фосфат, а Hsp90 вновь принимает открытую конформацию [28, 29]. Следует отметить, что для достижения нативного состояния освобожденный субстрат обычно нуждается в дополнительных стадиях рефолдинга [12, 28].

В то время как рассмотренные выше семейства Hsp60, Hsp70 и Hsp90 составляют группу шаперонов-фолдеров, малые белки теплового шока (sHsps) выполняют роль холдеров в системе контроля качества клеточных белков. Шапероны sHsps образуют прочные долгоживущие комплексы с широким набором клеточных белков в их ненативных конформациях и тем самым предотвращают агрегацию субстратов [32–35]. Белки sHsps представляют собой наиболее распространенное, но низкоконсервативное семейство шаперонов. Их общим отличительным признаком служит наличие в центральной части последовательности домена размером ~100 а.о. со структурой α-кристаллина хрусталика глаза млекопитающих, который фланкирован неструктурированными N- и С-концевыми фрагментами протяженностью 24–247 а.о. и <20 а.о. соответственно [9, 12, 32–36].

Характерная особенность sHsp-шаперонов – полидисперсность их четвертичных структур, что отражается в формировании ансамблей из крупных олигомеров с изменяющимся числом субъединиц. В частности, в клетках человека олигомеры могут включать 12–32 субъединицы sHsp-шаперона [36], а в клетках растений – до 40 [37]. Такие олигомеры часто имеют консервативную структурную организацию в виде сферического или дискообразного комплекса с пронизывающим его центральным каналом [33–36].

В противоположность другим семействам шаперонов, каждый олигомер sHsp способен удерживать по несколько молекул белковых мишеней, высвобождение которых из комплексов с sHsps происходит в кооперации с АТР-зависимыми шаперонами. На этом основании sHsp-белки рассматриваются в качестве “резервуаров” ненативных белков, сохраняющих их для последующего рефолдинга с помощью других семейств шаперонов, в частности системы шаперона Hsp70 [9, 12, 33–35].

В то же время следует заметить, что несмотря на значительный прогресс в понимании механизмов функционирования sHsp-шаперонов, достигнутый за последнее время, вопросы их специфичности, связанные с разнообразием последовательностей и структур шаперонов, остаются малоизученными и требуют дальнейшего исследования.

Семейство Hsp100/Clp, вовлеченное во множество важнейших клеточных процессов (в том числе в мембранный транспорт, регуляцию цитоскелета, биогенез органелл, инициацию репликации ДНК и активацию транскрипции), занимает особое место в системе контроля качества клеточных белков. Шапероны Hsp100 представляют группу “анфолдеров”, которые, с одной стороны, осуществляют разворачивание белковых мишеней перед последующими стадиями фолдинга, а с другой – служат АТРазными компонентами всех протеаз и мультисубъединичных комплексов СКК, деградирующих белки-субстраты. Эти шапероны принадлежат к широко распространенному суперсемейству AAA⁺-белков (АТРаз, ассоциированных с различными клеточными активностями) (рис. 1), которые функционируют как кольцевые гексамерные структуры, использующие энергию гидролиза АТР для ремоделирования своих белковых мишеней [38–41]. Hsp100-семейство в бактериях представлено белками ClpA, ClpB, ClpC, ClpE, ClpX, ClpY (HslU) и некоторыми другими (в частности, АТРазными составляющими Lon- и FtsH-протеаз) (табл. 1) [2, 9, 12, 41]. У эукариот подобные белки, относящиеся к семействам Hsp104, Hsp101 и Hsp78, встречаются в митохондриях клеток млекопитающих, а также в растениях и дрожжах [12, 42, 43].

По количеству АТРазных составляющих представители семейства Hsp100 делятся на два класса: к классу I относятся белки, включающие два так называемых ААА⁺-модуля (D1 и D2, рис. 2), а к классу II – белки, содержащие только один такой модуль D (рис. 2) [9, 41]. Кроме АТРазных модулей ААА⁺-белки содержат также структурно независимые вспомогательные домены (экстрадомены), которые либо расположены перед ААА⁺-модулями (N-концевые (N) и Zn-связывающие (ZBD) домены), либо локализованы внутри ААА⁺-модулей (инсерционные (I) домены) (рис. 2) [9, 41]. Представленные на рис. 2 белки Hsp104, ClpB и Hsp78 функционируют исключительно как шапероны, в то время как белки ClpA, ClpC, ClpE, ClpX и HslU в комплексах с протеолитическими составляющими (белками ClpP или HslV, см. ниже) осуществляют селективную деградацию внутриклеточных белков. Шапероны Hsp104 отличаются от других представителей семейства наличием небольшого С-концевого домена (рис. 2), участвующего в формировании функционально активной структуры шаперона и во взаимодействии с белками-субстратами [44, 45].

Ремоделирование белков-мишеней шаперонами Hsp100/Clp включает ряд последовательных стадий. Отбор субстратов происходит путем взаимодействия шаперонов с неструктурированными участками мишеней, содержащими специфические мотивы узнавания (дегроны), причем в некоторых случаях связывание субстратов опосредуется участием дополнительных адаптерных белков [41]. Связывание нуклеотидов способствует стабилизации бочкообразной гексамерной структуры шаперона, а разворачивание мишеней осуществляется путем их “принудительного” перемещения (транслокационная активность шаперона) через центральный канал гексамера Hsp100/Clp за счет энергии гидролиза АТР. На следующей стадии развернутые белки высвобождаются из комплексов с шаперонами благодаря конформационным изменениям последних, обусловленным преобразованием АТР в ADP, и подвергаются рефолдингу – либо спонтанному, либо с участием молекулярных шаперонов других семейств, что определяется специфичностью субстрата [44–47].

Наиболее изученные представители семейства Hsp100 – бактериальные шапероны ClpB и белок Hsp104 из дрожжей, которые вместе с менее исследованным шапероном Hsp78 отличаются от шаперонов других семейств СКК проявлением дезагрегационной функции наряду с транслокационной и анфолдазной [48]. Это свойство шаперонов ClpB/Hsp104, относящихся к ААА⁺-белкам класса I, обусловлено наличием в их первом ААА⁺-модуле (D1) вставочного пропеллерообразного домена (“серединный” или middle (M) domain) с конформацией coiled-coil (СС) (рис. 2) [49]. Следует отметить, что шапероны-дезагрегазы семейства Hsp100 обнаруживаются в бактериях, дрожжах и растениях и не встречаются в клетках теплокровных животных [50, 51].

Дезагрегирующая функция ClpB и Hsp104 реализуется совместно с белками системы шаперона Hsp70/DnaK (табл. 1) [52], роль которых заключается в изменении физических свойств белковых агрегатов, что приводит к высвобождению отдельных полипептидов из агрегированных субстратов и перемещению их к ААА⁺-шаперону. Подвижный М-домен, локализующийся на внешней стороне гексамерного кольца ClpB, регулирует как АТРазную активность самого шаперона, так и DnaK-зависимое связывание мишени с аксиальным каналом ClpB [53]. Далее происходят транслокация и разворачивание полипептида с последующим высвобождением его в среду для рефолдинга [47].

Внутриклеточные АТР-зависимые протеазы и мультисубъединичные протеолитические комплексы

Все АТР-зависимые протеазы и протеолитические комплексы СКК относятся к суперсемейству ААА⁺-белков (рис. 1 и 2) и выступают критическими регуляторами состава клеточного протеома [2, 54–59]. Показано, что энергозависимый протеолиз отвечает за деградацию более чем 90% белков внутри клетки [55]. Этот процесс исключительно важен для устранения дефектных, неправильно свернутых или агрегированных белков, накопленных в результате стрессовых ситуаций, а также для регуляции внутриклеточного протеолиза при обычных условиях путем контроля концентрации большинства короткоживущих регуляторных белков [54–56, 59].

В клетках прокариот и в органеллах эукариот бифункциональные энергозависимые протеазы представлены пятью семействами гетероолигомерных ферментов (ClpAP, ClpСP, ClpEP, ClpXP, HslUV (ClpYQ)) и двумя семействами гомоолигомерных ферментов (FtsH и Lon – подсемейства LonA и LonC) [56, 57] (рис. 2). В археях аналогичные функции выполняются Lon-протеазами (подсемейство LonВ) и мультисубъединичной архейной протеасомой (PAN/20S), которая представляет собой комплекс протеасомоактивирующей нуклеотидазы (proteasome-activating nucleotidase, PAN) с протеолитическим компонентом – 20S-протеасомой [58]. В цитоплазме и ядрах эукариот функционируют 26S-протеасомы – мультисубъединичные ансамбли, которые состоят из 20S-протеасом (протеолитические коры) и регуляторных 19S-комплексов, включающих ААА⁺-АТРазы [59, 60]. При этом все гетероолигомерные протеазы и протеолитические комплексы СКК характеризуются общей архитектурой: их бочкообразные гепта- или гексамеры, образованные двухярусными кольцами пептидгидролаз, активные сайты которых изолированы внутри центральной деградационной камеры, формируют комплексы с кольцевыми гексамерами ААА⁺-АТРаз регуляторных компонентов, которые проявляют анфолдазную активность, направленную на разворачивание белков-мишеней для последующей их транслокации в деградационную камеру [55–57].

АТРазные составляющие протеаз СКК, преобразующие энергию АТР в механическую работу, выполняют важнейшую роль в деградации белковых субстратов. Весь процесс превращения белка-субстрата можно разделить на отдельные этапы, при этом распознавание белковой мишени, ее разворачивание и транслокация в деградационную камеру осуществляются АТРазным компонентом ААА⁺-протеазы, а собственно гидролиз белка-субстрата – пептидазным.

Этап узнавания и связывания мишени, как правило, не зависит от АТР и может быть либо прямым, либо “косвенным”, т.е. опосредованным адаптерными белками. Специфическими мотивами узнавания часто служат упомянутые выше дегроны – пептидные фрагменты, локализованные вблизи (или внутри) неструктурированных N- или С-концевых областей белка, или даже N-концевые аминокислоты [54, 56, 57]. Известны также дегроны, представляющие собой “прикрепленные” пептидные последовательности (тэги). Один из ярких примеров тэга – фрагмент SsrA-tag – AAXXXXXALAA (где X – любая аминокислота), который узнается протеазами ClpAP, ClpXP, FtsH, Lon и архейной протеасомой [54, 56].

В отличие от АТР-зависимых протеаз бактерий и протеасом архей, функционирование 26S-протеасом эукариот обычно опосредовано предварительной селективной модификацией белков-мишеней, подлежащих деградации, путем ковалентного присоединения специфической метки – цепочки из нескольких молекул убиквитина (белок из 76 а.о.) [59–61]. Вследствие этого дегроны мишеней 26S-протеасом представлены двумя частями: универсальным полиубиквитиновым тэгом, обеспечивающим связывание мишени с регуляторным компонентом каталитического комплекса, и неструктурированным фрагментом, который служит областью инициации протеолиза [60, 61]. Вместе с тем показано, что возможен также убиквитин-независимый путь деградации белков 26S-протеасомой. Его реализации способствует ряд так называемых прямых протеасомных сигналов, к которым относятся либо специфические фрагменты последовательности, либо посттрансляционные модификации мишеней, либо их конъюгация с химическими веществами, приводящая к связыванию с протеасомой по принципу заряд-зарядовых взаимодействий [62].

АТР-зависимые протеазы отличаются от классических протеолитических ферментов следующими уникальными характеристиками: 1) высокой селективностью взаимодействия с белковыми мишенями при отсутствии выраженной специфичности по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемые связи; 2) наличием транслоказной активности; 3) сопряжением протеолитической активности с гидролизом АТР; 4) процессивным механизмом деградации белков-субстратов (c образованием 10–15-членных пептидных продуктов без высвобождения высокомолекулярных интермедиатов); 5) мультисубъединичной (гомо- или гетероолигомерной) организацией [54, 56, 57].

ААА⁺-модули – характеристические компоненты АТР-зависимых протеаз. Выступая представителями суперсемейства ААА⁺-белков, АТР-зависимые протеазы содержат в своей структуре как высококонсервативные ААА⁺-модули, состоящие из 200–250 а.о., так и дополнительные N‑концевые (N) или инсерционные (I) экстрадомены (рис. 2). АТРазные модули формируются большими нуклеотид-связывающими (NB или α/β) и малыми α-спирализованными (Н или α) доменами. Любая АТР-зависимая протеаза содержит либо один ААА⁺-модуль, либо два топологически подобных ААА⁺-модуля, включающих наборы различных консенсусных элементов (рис. 2 и 3) [39, 56, 63–66].

В NB-доменах ААА⁺-модулей локализованы консервативные мотивы Уолкера А и В. Мотив А (WA, называемый также Р-петлей, Р-loop), играющий важную роль как в связывании нуклеотида и координации иона металла, так и в формировании гексамерного АТРазного кольца, представлен последовательностью GX₂GZGK[T/S], где X и Z – любые аминокислоты, но хотя бы один из Х-остатков – это остаток пролина. Мотив В (WB) представляет собой гексапептид Φ₄DE, где Φ – остатки гидрофобных аминокислот. Наряду с координацией иона металла, мотив WB принимает участие в гидролизе АТР, при этом консервативный остаток глутамата активирует молекулу воды для нуклеофильной атаки на γ-фосфат нуклеотида. Кроме мотивов Уолкера, ААА⁺-модули содержат ряд других консервативных участков, включая мотив межсубъединичного сигналинга (inter-subunit signaling, ISS), область вторичной гомологии (second region of homology, SRH), а также остатки sensor-1 (s1), sensor-2 (s2) и “аргининовый палец” (Arg-finger, Rf) (рис. 3) [39, 56, 63–68].

Мотив ISS, представленный α-спиралью из нескольких консервативных остатков (рис. 3), имеет большое значение для координации связывания и гидролиза АТР в соседних субъединицах кольцевого ААА⁺-гексамера. Взаимодействие С‑концевой аспарагиновой (или глутаминовой) кислоты ISS-мотива с Rf-остатком собственной субъединицы, который воспринимает статус нуклеотида, связанного в соседней субъединице, запускает цикл гидролиза АТР, необходимый для транслокации субстрата [65].

Остаток Rf локализован в SRH-области (фрагмент полипептидной цепи из 15–20 а.о.), расположенной в С-концевой части NB-домена (рис. 3) [56, 64–68]. К этой же области относится остаток s1 (обычно аспарагин, реже – серин, треонин или гистидин), также взаимодействующий с γ-фосфатом молекулы ATP соседней субъединицы и координирующий взаимодействие атакующей молекулы воды с остатками WB-мотива.

Совокупность консенсусных мотивов SRH-области критически важна для передачи между субъединицами ААА⁺-комплекса сигналов конформационных изменений, сопровождающих акт гидролиза нуклеотида. Вследствие своей функциональной значимости и в силу отсутствия SRH-фрагмента в других нуклеозидтрифосфатазах, эта область служит отличительной характеристикой для белков ААА⁺-суперсемейства [64–66].

Кроме рассмотренных консенсусных элементов, NB-домены ААА⁺-белков содержат специфические фрагменты последовательности, которые формируют петли трех типов, обращенные внутрь аксиального (осевого) канала гексамера белка [69]. Это так называемые петли pore loop-1 (или GYVG), pore loop-2 и RKH, которые участвуют в связывании, разворачивании и перемещении молекулы белка-мишени внутри полости канала вплоть до протеолитической камеры (в случае ААА⁺-протеаз) (рис. 3). Петля RKH локализуется у входа в осевой канал, наиболее консервативная петля pore loop-1 – в его центральной части, а петля pore loop-2 – на выходе из канала. При этом ведущую роль в разворачивании белков-субстратов и обеспечении транслоказной активности ААА⁺-протеаз играют петли pore loop-1.

В малом Н-домене ААА⁺-модуля, сформированном четырьмя α-спиралями, локализован мотив sensor-2 (рис. 3). Он содержит консервативный остаток аргинина (иногда – лизина) (s2), который взаимодействует с α-фосфатом АТР и опосредует конформационные изменения, сопряженные с циклом связывания/гидролиза нуклеотида, а также участвует в межсубъединичных взаимодействиях [64, 66]. Следует упомянуть, что в противоположность членам AAA⁺-суперсемейства у представителей классических AAA-АТРаз в положении s2 обычно содержится остаток аланина [64, 66].

Особенности доменной и структурной организации АТР-зависимых протеаз и мультисубъединичных комплексов. Известно, что подавляющее большинство ААА⁺-белков взаимодействует с функциональными белковыми партнерами, образуя комплексные гетероолигомерные структуры, АТРазные составляющие которых – самостоятельные субъединицы [64]. В редких случаях АТРазный и функциональный компоненты ААА⁺-белка локализованы в единой полипептидной цепи [56, 64, 70]. С другой стороны, как упоминалось выше, суперсемейство ААА⁺-белков делится на классы I и II [41]. В первом случае ААА⁺-белки содержат два ААА⁺-модуля (D1 и D2), разделенных вставками разной длины, а во втором – единственный ААА⁺-модуль (D), подобный D2-модулю белков класса I [41]. В этом отношении сообщество АТР-зависимых протеаз системы контроля качества белков объединяет представителей обоих классов ААА⁺-белков: к классу I относятся АТРазные компоненты ClpAP/СР/ЕР-протеаз, а к классу II – протеаз ClpXP, HslUV, FtsH, Lon и комплексов архейных PAN/20S-протеасом и эукариотических 26S-протеасом [56, 70]. Доменное строение протеаз СКК показано на рис. 2, а их структурная организация охарактеризована в табл. 2.

АТРазные и протеазные составляющие семейств Lon и FtsH локализованы в единой полипептидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры. Однако большинство ААА⁺-протеаз – это гетероолигомерные комплексы, в которых АТРазный и протеазный компоненты представлены индивидуальными субъединицами (рис. 2).

Особенность протеаз ClpCP и ClpEP – наличие в α-спирализованных доменах Н1 их D1-модулей вставочных “серединных” (middle) доменов (M' и M''), обладающих СС-конформацией, но различающихся своими размерами. Показано, что эти домены участвуют во взаимодействии протеаз со специфическими адаптерными белками, которые опосредуют связывание и деградацию белковых мишеней [70, 71]. Подобные им вставочные домены (М), также имеющие СС-конформацию, обнаружены в шаперонах ClpB, Hsp104 и Hsp78 (рис. 2, см. подраздел “Молекулярные шапероны СКК”) [49, 72]. Однако М-домены более чем вдвое превышают M'- и M''-домены по размеру и выполняют другие функции – они обеспечивают дезагрегазную активность шаперонов [72].

Разнообразие протеазных компонентов АТР-зависимых протеаз и протеасом, вовлеченных в селективный АТР-зависимый протеолиз, отражено в табл. 2, из которой видно, что внутриклеточная деградация белков осуществляется ферментами, представляющими четыре разных клана в классификации пептидгидролаз MEROPS: каталитический центр протеолитической субъединицы ClpР, общей для гетероолигомерных протеаз ClpАР, ClpСР, ClpЕР и ClpХР, представлен классической триадой Ser–His–Asp, у протеаз HslUV, а также в β-субъединицах 20S-протеасом архей и эукариот каталитически активны N-концевые остатки треонина, мембраносвязанная протеаза FtsH – Zn-зависимая металлопротеаза, а в активных центрах Lon-протеаз функционирует каталитическая диада Ser–Lys [73].

Функционально активными формами бактериальных гетероолигомерных АТР-зависимых протеаз (ClpАР, ClpСР, ClpЕР, ClpХР и HslUV) выступают бочкообразные комплексы из состыкованных колец, в которых два центральных пептидазных кольца (гептамерных в случае ClpP или гексамерных в случае HslV) с каталитическими центрами, обращенными внутрь аксиальной полости (деградационная камера), фланкированы с одной или с обеих сторон гексамерными кольцами регуляторных АТРазных субъединиц (ClpА, ClpС, ClpЕ, ClpХ или HslU), выполняющих функции узнавания, разворачивания и транслокации субстрата [56, 57, 70, 74]. Показано, что ассоциация АТРаз ClpA, ClpC, ClpЕ и ClpХ с пептидазой ClpP происходит с участием специальных “стыковочных петель”, локализованных в ААА⁺-модулях шаперонов между остатками sensor-1 NB-доменов и Н-доменами [75]. Гомоолигомерные протеазы Lon и FtsH собираются в бочкообразные структуры из шести идентичных субъединиц.

Аналогично бактериальным ААА⁺-протеазам формируются более сложные мультисубъединичные комплексы протеасом архей (PAN/20S) и эукариот (26S), у которых протеолитические компоненты (20S) представляют тетраярусные гептамерные кольца из внутренних каталитических β-субъединиц и внешних регуляторных α-субъединиц, одинаковых в 20S-комплексах архей (структурная формула α₇/β₇β₇/α₇) и различающихся в 20S-комплексах эукариот (α_1–7/β_1–7β_1–7/α_1–7) [76].

Регуляторные комплексы протеасом (PAN и 19S), обладающие АТРазной активностью, содержат 6 субъединиц у архей и 19 субъединиц у эукариот, при этом основой обеих структур служат гексамерные кольца ААА⁺-белков (соответственно, PAN и Rpt(1–6) – Regulatory particle triphosphatases, табл. 2) [58, 60]. Эти регуляторные комплексы находятся в непосредственном взаимодействии с гептамерами α-субъединиц протеолитических коров протеасом.

На рис. 4 представлен общий принцип функционирования АТР-зависимых протеаз и мультисубъединичных протеолитических комплексов. Распознавание и связывание белка-мишени (ТР – target protein) осуществляется регуляторными ААА⁺-компонентами (RC – regulatory complexes), локализованными во внешних кольцах активного комплекса фермента. На следующих этапах происходит разворачивание молекулы субстрата и транслокация ее в область протеолитических центров. В деградационной камере, расположенной внутри ферментного комплекса, осуществляется процессивный гидролиз субстрата с последующим высвобождением продуктов. Образовавшиеся олигопептидные фрагменты могут в дальнейшем гидролизоваться АТР-независимыми протеазами до коротких пептидов и, наконец, клеточными аминопептидазами до свободных аминокислот.

Основные характеристики некаталитических экстрадоменов АТР-зависимых протеаз. Специфические для каждого семейства АТР-зависимых протеаз и протеасом экстрадомены их АТРазных составляющих в большинстве случаев представлены вариабельными “не АТРазными” N-концевыми (N) доменами, предшествующими ААА⁺-модулям, и реже – вставочными (I) доменами, локализованными внутри NB-доменов между мотивами WA и WB (рис. 2) [41, 56, 67]. Обычно экстрадомены служат местами связывания субстратов [56]. Они выполняют функцию первичного распознавания субстрата-мишени, а также играют важную роль в его разворачивании и/или контролируют доступ мишеней к связывающим центрам, локализованным внутри ААА⁺-модулей. Экстрадомены протеаз LonB и FtsH включают также трансмембранные фрагменты, обеспечивающие взаимодействие ферментов с клеточными мембранами.

Вовлечение в селективный отбор субстратов белков-адаптеров, способных к специфическому взаимодействию как с мишенями, так и с ААА⁺-партнерскими белками, зачастую приводит к модулированию функциональных свойств последних [41, 77]. В качестве примера в табл. 3 представлены адаптерные белки, функционирующие в комплексе с ААА⁺-протеазами в клетках E. coli и Bacillus subtilis. При этом следует заметить, что обычно LonA-протеазам не требуется никаких адаптеров, и обнаруженный в 2015 г. адаптерный белок SmiA используется ферментом из B. subtilis исключительно для деградации активатора биосинтеза жгутиков SwrA [78]. Для протеаз FtsH и ClpEP из этих же организмов до настоящего времени адаптеров не обнаружено [77].

Большинство белковых адаптеров связываются с N-концевыми экстрадоменами ААА⁺-белков, что обеспечивает оптимальное взаиморасположение ААА⁺-олигомера и “заякоренной” через этот белковый линкер мишени. Обнаружено также, что некоторые адаптерные белки могут влиять на активность ААА⁺-партнеров. При этом сами белки-адаптеры также могут подвергаться регуляции (например, путем взаимодействия с небольшими белками-антиадаптерами и/или посредством фосфорилирования) [77].

N-экстрадомены Clp-шаперонов – АТРазных компонентов ряда ААА⁺-протеаз. Шапероны Clp-семейств системы контроля качества характеризуются N-концевыми экстрадоменами двух типов. Прежде всего, это α-спирализованные N-домены молекулярных шаперонов ClpВ и Hsp104 и родственных им АТРазных субъединиц (ClpA и ClpС) гетероолигомерных протеаз ClpAР и ClpСР (рис. 2), которые проявляют высокую гомологию на уровне своих первичных и вторичных структур [79, 80]. Эти домены содержат по восемь α-спиралей, формирующих тандемы из двух структурных повторов, каждый из которых включает четыре α‑спирали и имеет размер ~70 а.о. Установлено, что N-домены ClpA, ClpВ и ClpС выполняют роль регуляторов специфичности своих шаперонов и обеспечивают их взаимодействие с широким набором субстратов-мишеней [80, 81]. Наряду с этим показано, что N-домен ClpA имеет также исключительное значение для образования активного комплекса с ClpР-пептидазой [82].

Для шаперона ClpA выявлен единственный адаптерный белок ClpS (табл. 3), связывание которого с N-доменом приводит к ингибированию деградации известных субстратов ClpAP – SsrA-меченых белков. В то же время комплекс ClpAP/ClpS обнаруживает способность к распознаванию и расщеплению некоторых белков, агрегированных в результате действия теплового шока. Таким образом, взаимодействие ClpS c экстрадоменом модифицирует специфичность ClpA и перенаправляет активное функционирование шаперона на деградацию агрегированных белков [83].

Для ClpC из B. subtilis известен целый ряд адаптерных белков (MecA, YpbH, McsB и др.) (табл. 3). Связывание N-домена ClpC с белком-адаптером MecA играет важную роль при деградации большинства субстратов протеолитическим комплексом ClpСP [70]. Показано, что в узнавании и связывании адаптерных белков ClpC-шапероном кроме N-концевого экстрадомена участвует также локализованный в ААА⁺-модуле D1 (рис. 2) вставочный M'-домен (58 а.о). При этом детали участия адаптерных белков в доставке субстратов к комплексу ClpCP до сих пор остаются неизвестными [71, 77, 80, 84].

Рентгеноструктурные исследования показали, что взаимодействия экстрадоменов ClpA и ClpC с их адаптерами ClpS и MecA носят сходный характер. Оба адаптера используют подобные α-спирали для взаимодействия cо структурно подобными областями N-доменов шаперонов, при этом в комплексах шаперон–адаптер формируются одинаковые наборы водородных связей [84].

Вместе с тем ClpC кардинально отличается от других шаперонов семейства Clp/Hsp100, поскольку все виды его активности, включая распознавание и связывание белков-субстратов, гексамеризацию, шапероновую активность, образование функционального комплекса ClpCP и деградацию белковых мишеней, опосредованы обязательным взаимодействием шаперона с адаптерными белками. Выявлен регуляторный механизм, в соответствии с которым в отсутствие белков-субстратов происходит инактивация комплекса ClpCP за счет деградации связанного белка-адаптера [80, 81].

Несмотря на высокое подобие шаперона ClpВ и регуляторных шаперонов АТР-зависимых протеаз ClpA и ClpC, адаптерные белки для ClpB до настоящего времени не обнаружены [77]. N-экстрадомены ClpB участвуют во взаимодействии с рядом белковых мишеней, однако их роль в основной функции шаперона – ClpB-опосредованной дезагрегации белков – все еще до конца не изучена. Показано, что ряд вариантов ClpB, несущих точечные мутации в экстрадомене, проявляет пониженную дезагрегационную активность, однако некоторые делеционные формы ClpB из разных источников с полностью удаленным N‑доменом сохраняют активность, соизмеримую с активностью полноразмерного белка [16]. Кроме того, существование в Mycoplasma sp. гомологов ClpB, лишенных N-домена, подтверждает необязательность наличия N-доменов в ClpB-шаперонах для дезагрегации белков [16]. При этом однозначно установлено, что непосредственное участие в реализации дезагрегационной функции ClpB принимает характеристический для белков ClpB/Hsp104 М-домен, внедренный в ААА⁺-1-модуль шаперона (рис. 2) [85, 86].

Для белков семейства Hsp104 показано, что их N-экстрадомены помимо взаимодействия с белками-мишенями вовлечены также в процессы олигомеризации самих шаперонов [87].

Другой тип N-концевых экстрадоменов Clp-шаперонов представляют гомологичные Zn-связывающие домены (ZBD) протеаз ClpXP и ClpEP, которые относятся к разным классам ААА⁺-белков (рис. 2). При этом можно отметить, что шаперон ClpE проявляет также сходство с ClpС, поскольку в своем D1-модуле он содержит вставочный M''-домен (53 а.о), более чем на 60% подобный M'-домену ClpС (рис. 2). ZBD-экстрадомены ClpX и ClpE имеют размеры ~60 а.о. и включают по четыре остатка цистеина, координирующих атом Zn [88].

Показано, что ZBD-домен ClpX E. coli отвечает за узнавание некоторых субстратов (в частности, белков λO и MuA) и, кроме того, связывает адаптерный SspB-белок (табл. 3), направляющий субстраты к осевому каналу ClpX для разворачивания [88]. О белке ClpE известно, что он участвует в процессе дезагрегации и в последующей деградации агрегированных белков, а его N-концевой экстрадомен необходим для проявления базовой АТРазной активности шаперона in vitro [70, 89].

На примере ClpX установлено, что индивидуальные ZBD-экстрадомены образуют стабильные димеры, в то время как в кольцевых гексамерах полноразмерных шаперонов шесть ZBD-доменов формируют тримеры димеров, локализованные на поверхности гексамерных колец AAA⁺-модулей ClpX [88].

N-концевые экстрадомены AAA⁺-АТРаз протеасом. ААА⁺-регуляторные комплексы, активирующие протеолитические 20S-коры протеасом, в случае архей сформированы гомогексамерами протеасомоактивирующей нуклеотидазы PAN, а в случае эукариот представлены 19S-ансамблями, состоящими из 19 субъединиц, шесть неидентичных ААА⁺-белков которых (Rpt(1–6), табл. 2) образуют кольцевые гексамерные “основания”, непосредственно взаимодействующие с 20S-корами [90–92]. Топологически подобные белки PAN и Rpt, как и другие ААА⁺-АТРазы, включают N‑концевые экстрадомены (PAN-N и Rpt-N соответственно), которые участвуют в формировании гексамеров, в узнавании и связывании белковых мишеней и совместно с собственными ААА⁺-модулями превращают химическую энергию в механическую работу.

Экстрадомены PAN-N и Rpt-N начинаются с α-спиральных сегментов, за которыми следуют глобулярные β-структурированные С-концевые участки, формирующие олигосахарид-связывающий (OB) фолд [91, 92]. Архитектурно экстрадомены PAN-N и Rpt-N представляют собой тримеры димеров, в которых на гексамерных кольцах ОВ-фрагментов располагаются три CC-участка, образованные парами N-концевых α-спиральных сегментов соседствующих субъединиц [91, 92]. Эти структуры через короткие линкеры соединяются с гексамерными кольцами ААА⁺-модулей PAN и Rpt, имеющими каноническую укладку ААА⁺-АТРаз [91].

В функционально активных протеасомах, включающих и регуляторные, и протеолитические компоненты, кольца ААА⁺-модулей ассоциируются с протеолитическим кором 20S и управляют ATP-зависимым разворачиванием белка-субстрата, тогда как дистальные комплексы экстрадоменов образуют входные отверстия каналов транслокации субстрата [93].

Инсерционные экстрадомены HslUV-протеаз. Характерная особенность АТРазного компонента гетероолигомерной протеазы HslUV – отсутствие N-концевого домена. Вставочные α-спирализованные экстрадомены (I-домены) HslU размером ~130 а.о., формирующие в кольцевом олигомере воронкообразную полость, расположены в NB-домене шаперона вслед за спиралью α2 и в непосредственной близости от мотива WB (рис. 3) [94, 95]. Гексамер, образованный I-доменами, обеспечивает отбор полипептидных субстратов для деградации, способствует транслокации субстратов в протеолитическую камеру HslUV-комплекса, а также участвует в гидролизе АТР и деградации белковых мишеней [94, 95].

N-экстрадомены FtsH-протеаз. FtsH – единственная мембраносвязанная ААА⁺-протеаза бактерий. Функционально активной формой фермента, нацеленного на деградацию мембраносвязанных белков, служит кольцевой гомогексамер [96]. N-экстрадомены FtsH-протеаз содержат трансмембранные сегменты, сформированные двумя α-спиралями [96, 97]. Показано, что N-домен влияет на олигомеризацию и стабильность FtsH [98]. Белковые адаптеры для FtsH-протеаз неизвестны, однако существует целый набор белковых модуляторов и ассоциированных факторов (HflK, HflC, HflD, MgtR, SpoVM), которые участвуют в функционировании ферментов [90]. Аналоги FtsH обнаружены в митохондриях и хлоропластах эукариот. Установлено высокое подобие N-экстрадоменов бактериальных и эукариотических FtsH-протеаз [97]. Обнаружена также особая роль FtsH как единственной ААА⁺-протеазы, имеющей критическое значение для выживаемости E. coli [99].

Три типа экстрадоменов протеаз семейства Lon. Lon-протеазы – это единственное семейство АТР-зависимых протеаз, которое в системе контроля качества клеточных белков представлено тремя подсемействами (LonА, LonВ и LonC, см. далее подраздел “Общая характеристика семейства Lon-протеаз. Подсемейства Lon”), имеющими сходные ААА⁺-модули и протеазные домены, но кардинально различающимися строением и локализацией своих экстрадоменов (рис. 2 и 5) [100]. Согласно современной концепции, предстоящая ААА⁺-модулю пролонгированная N‑концевая область LonА-протеаз в действительности сформирована двумя доменами [101] – собственно N-концевым β-структурированным экстрадоменом (N) [102, 103] и следующим за ним “вставочным” α-спирализованным доменом [101, 104]. При этом вставочный домен включает олигопептидный фрагмент (~100 а.о.) с СС-конформацией и носит название HI(CC) (helical inserted with CC-fragment – инсерционный спирализованный с CC-фрагментом) домен [101, 105].

Ферменты подсемейств LonВ и LonC, лишенные N-экстрадоменов, содержат разные по размеру инсерционные экстрадомены (I и I*), включающие, соответственно, 124–140 и 185–191 а.о., которые внедрены, как и у HslUV, внутрь NB-доменов их собственных ААА⁺-модулей (рис. 5) [73, 100, 106–108]. Однако, в отличие от HslUV, I-домены Lon-протеаз локализованы вблизи мотива WA, непосредственно после спиралей α1 (рис. 3). Особенностью экстрадоменов LonB-протеаз служит наличие включенных в их последовательности трансмембранных сегментов (ТМ).

Сходство и различия экстрадоменов ААА⁺-белков СКК. Приведенные выше данные по экстрадоменам ААА⁺-белков – представителей системы контроля качества клеточного протеома – показывают, что эти некаталитические фрагменты ААА⁺-протеаз и протеолитических комплексов разнообразны по структуре: они могут быть полностью α-спирализованными (как N-домены ClpA, ClpB и ClpС, а также I-домены HslU и LonC), могут иметь α/β-структуру (ZBD-домены ClpX и ClpE), могут представлять β-структурный фолд (ОВ) с включением N-концевых CC-фрагментов (N-домены ААА⁺-АТРаз регуляторных комплексов эукариотических и архейных протеасом), и, наконец, их последовательности могут содержать спиральные фрагменты, обеспечивающие взаимодействие с клеточными мембранами (N-концевой домен FtsH и I-домен LonB-протеаз). В настоящее время для большинства экстрадоменов ААА⁺-белков СКК получены рентгеноструктурные данные (в том числе для ClpA E. coli PDB: 1K6K; ClpB E. coli PDB: 1KHY; ClpB Thermus thermofilus PDB: 1QVR; ClpC B. subtilis PDB: 2Y1Q; ClpX E. coli PDB: 2DS7; Hsp104 S. cerevisiae PDB: 5U2U; Hsp104 Candida albicans PDB: 5U2L; HslU E. coli PDB: 1YYF; HslU Haemophilus influenzae PDB: 1G41; FtsH E. coli PDB: 4V0B; FtsH Thermotoga maritima PDB: 4M8A и др.) и выявлена их роль в связывании белков-мишеней и/или белковых адаптеров.

Практически все экстрадомены ААА⁺-белков СКК объединены одним общим свойством – их размеры не превышают 150–190 а.о. В этом отношении протеазы подсемейства LonA занимают особое место, поскольку только у них некаталитическая N-концевая область включает от 300 до более чем 400 аминокислот и состоит из двух структурно независимых доменов – N и HI(CC) (рис. 2) [100, 101]. При этом кристаллическая структура определена только для N-домена [102–104], а пространственная укладка инсерционного HI(CC)-домена остается невыясненной до сих пор. До последнего времени участие каждого из этих доменов в функционировании полноразмерного фермента также не было охарактеризовано в полной мере.

Вместе с тем LonА-протеазы играют ключевую роль в функционировании системы контроля качества в бактериях и эукариотах. Так, известно, что в клетках E. coli именно LonА-протеаза обеспечивает >50% протеолиза аномальных белков [109], а у эукариот LonА-протеазы – ведущие ферменты, расщепляющие окисленные белки митохондриального матрикса. Установлено, что многие патологии (в частности, нейродегенеративные нарушения и развитие ряда онкологических заболеваний) сопровождаются изменениями содержания LonА-протеазы в клетках [110–113]. Сведения об участии LonА-протеаз в патологических процессах и о возможности их применения в медицинских целях широко представлены в современной литературе (обзоры [114–118]). Существенная биологическая роль LonА-протеаз определяет важность их структурно-функционального исследования.

Общая характеристика семейства Lon. Подсемейства Lon-протеаз

Согласно современной классификации MEROPS [119], семейство Lon-протеаз S16 клана SJ формируется, главным образом, подсемействами А, В и С (табл. 2). Lon-протеаза из E. coli (EcLon), относящаяся к наиболее представительному подсемейству LonA, исторически была первой экспериментально обнаруженной АТР-зависимой пептидгидролазой (1981 г.) [120], и до настоящего времени она остается основной моделью при изучении ферментов семейства Lon.

К 2004 г. семейство Lon-протеаз насчитывало уже более 100 ферментов из различных источников. Сравнительный анализ их первичных структур позволил выделить в общем пуле два подсемейства – крупное LonA (80 ферментов) и менее репрезентативное LonB [100] (рис. 5). На текущий момент в базе данных MEROPS [119] насчитывается ~2300 LonA-протеаз и >200 LonB-ферментов. Наряду с рассмотренными выше различиями в экстрадоменах, протеазы LonA и LonB характеризуются также разными типами протеолитических центров: окружение каталитически активных остатков в подсемействах представлено фрагментами KDGPS*AG и KXK*XФ (у LonA) или ΦEGDS*AS и TXK*ФЕ (у LonB), где S* и K* – каталитические остатки серина и лизина, в обоих случаях отстоящие друг от друга на 43 а.о., Х – любая, а Ф – гидрофобная аминокислота (жирным шрифтом выделены консервативные остатки, подчеркнуты различные по природе остатки) (рис. 5). Помимо этого, присутствуют отличия и в аминокислотных сегментах AAA⁺-модулей, формирующих мотивы Уолкера и их окружение: так, мотивы WA представлены пептидами GPPGVGKT (LonA) и GХPGVGKS (LonB), а подобные мотивы WB (Ф₄DE) фланкированы различающимися пептидами: у LonA это NP и IDK, а у LonB – KG и INT [100].

Как упоминалось выше, LonA-протеазы преимущественно обнаруживаются в прокариотах (цитозольные ферменты) и эукариотах (ферменты митохондрий, хлоропластов и пероксисом). Между тем, несколько протеаз LonA-типа идентифицировано также у отдельных представителей архей (в том числе Methanosarcina sp., Methanobacterium formicicum и Methanolobus psychrophilus) [119].

Что касается протеаз LonB, то они представлены в основном в архебактериях. Однако в течение последнего десятилетия протеазы с LonB-типом протеолитического центра (окружение каталитических остатков: ΦEGDS*AG и XXK*ΦE) обнаружены и у ряда термофильных бактерий (в частности, Marinithermus hydrothermalis, Meiothermus taiwanensis, T. thermophilus и др.). В своих АТРазных компонентах эти ферменты также проявляют подобие с LonB-протеазами. Однако они не способны к гидролизу АТР из-за вырожденности АТРазных центров вследствие замен существенных консервативных остатков в мотивах Уолкера и их окружении: GPХGXXKX (WA) и GGΦ₄EAXXΦ (WB), а также на участках sensor-1 и sensor-2. Еще одной отличительной характеристикой новой группы ферментов служит наличие дополнительного по сравнению с LonB-протеазами α-спирализованного фрагмента размером 90–91 а.о. в экстрадомене, локализованном внутри потенциального ААА⁺-модуля (рис. 5) [100, 107, 121]. Несмотря на то что такие ферменты могут только связывать, но не гидролизовать АТР, они тоже проявляют способность к селективной деградации развернутых белковых субстратов, но по АТР-независимому механизму [121]. К настоящему времени именно это сообщество ферментов оформилось в немногочисленное (в пределах 10 представителей) третье подсемейство Lon-протеаз – LonС (рис. 5) [119].

Современные исследования протеаз семейства Lon направлены, прежде всего, на получение данных о пространственных структурах этих ферментов и механизмах их функционирования. При этом семейство Lon-протеаз достаточно полно охарактеризовано в части АТРазных и пептидгидролазных свойств представителей всех трех подсемейств [108, 122–127]. Вместе с тем вследствие особенностей организации некаталитической области структурно-функциональная характеристика самого крупного подсемейства LonА в целом остается недостаточно изученной, и для ряда научных групп она служит программой продолжающихся исследований.

LonA-протеазы – уникальный подкласс ААА⁺-белков

Индивидуальные субъединицы гомоолигомерных LonA-протеаз образованы пятью доменами (рис. 5). Функциональными выступают протеазный С-концевой домен (Р) и центральные нуклеотид-связывающий (NB) и α-спирализованный (H) домены, которые формируют АТРазный ААА⁺-модуль. В неординарной для ААА⁺-белков СКК некаталитической N-концевой области ферментов локализованы два домена: N-концевой (N, включающий 110–130 а.о. у бактериальных ферментов и 165–220 а.о. у эукариотических) и инсерционный (HI(CC), 178–186 а.о. у ферментов из любых источников).

Поскольку пространственные структуры полноразмерных LonA-протеаз до самого последнего времени не были известны, структурные сведения о представителях подсемейства ограничивались преимущественно 3D-данными для ряда фрагментов ферментов из различных источников: E. coli, B. subtilis, Brevibacillus thermoruber, M. taiwanensis, Mycobacterium avium и мозга человека (EcLon, BsLon, BtLon, MtLon, MaLon и HumLon соответственно). Эти данные полностью согласуются с предсказанными вторичными структурами LonA-протеаз и дают представление о трехмерных структурах четырех из пяти их доменов – N, NB, H и P [102–105, 128–135].

Результаты рентгеноструктурного анализа показали, что структуры доменов NB и Н, составляющих ААА⁺-модули LonA-протеаз, топологически подобны соответствующим фрагментам классических ААА⁺-белков (в частности, единственным D-модулям протеаз ClpХР и HslUV, а также D2-модулям шаперонов ClpB/Hsp104 и регуляторных компонентов АТР-зависимых протеаз ClpАР, ClpСР и ClpЕР) [63, 67, 122].

Отличительными именно для LonA-протеаз оказались структуры их N-концевых и протеазных доменов. Установлено, что β-структурированные N-домены бактериальных LonA-протеаз, состоящие из семи β-тяжей и двух α-спиральных фрагментов, обнаруживают выраженное сходство с N-доменом гипотетического белка BPP1347 из Bordetella parapertussis [102], который относится к группе РНК-связывающих белков, обладающих PUA-подобной архитектурой [136]. N-домены эукариотических LonA-протеаз проявляют высокое подобие с N-доменами бактериальных ферментов и при этом в большинстве своем содержат крупные вставочные фрагменты размером до 100 а.о. в шпильке между шестым и седьмым β‑тяжами [105].

Характеристический фолд Р-доменов, который отличает LonA-протеазы от других серин-лизиновых пептидгидролаз (в частности, от ферментов семейств S24 и S26 клана SF) [128], в 2004 г. послужил основой для выведения всего семейства Lon (S16) в индивидуальный структурный клан SJ в базе данных MEROPS [119].

И лишь упаковка индивидуального HI(CC)-домена, образованного восемью α-спиралями (α3–α10 в субъединице LonА), четыре из которых (α6–α9) по предсказанию могут формировать CC-участок в протомере фермента [101], до сих пор не определена. Вместе с тем известны кристаллические структуры некоторых укороченных бактериальных LonA-протеаз, которые наряду с одним или несколькими доменами фермента включают либо пять N-концевых спиралей HI(CC)-домена (форма EcLon (1–245) [104]), либо три его С-концевые спирали (формы EcLon (235–584), BsLon (240–774) и MtLon (242–793) [103, 105, 131]). Рассмотрение всех известных структурных фрагментов LonA-протеаз, полученных с помощью рентгеновской кристаллографии, показывает, что на настоящем этапе только для EcLon существует набор 3D-структур тех участков фермента, которые в совокупности покрывают его полную аминокислотную последовательность (рис. 6) [104, 105, 128, 129]. Это позволяет считать EcLon-протеазу не только базовым ферментом, но и структурной моделью для общего пула LonA-протеаз.

Различие функций доменов, формирующих N‑концевую область LonA-протеаз. Однозначное подтверждение двухдоменной организации N‑концевой области LonA-протеаз было получено экспериментально на примере EcLon-протеазы путем сравнительного исследования функционирования фермента и его модифицированных форм. При этом были использованы рекомбинантная форма EcLon, ее укороченные модификации, не содержащие либо консервативной части N‑домена (Lon-d106) [137], либо 172 N-концевых остатков вплоть до начала СС-участка (Lon-d172) [138], делеционные формы, лишенные полного HI(CC)-домена или его СС-участка (Lon-dHI(CC) и Lon-d(CC) соответственно [139, 140]), точечные мутанты с заменами потенциально важных остатков, локализованных в разных участках HI(CC)-домена (Lon-R164A, Lon-R192A и Lon-Y294A) [141], и тройной мутант Lon^EKR, несущий замены трех заряженных поверхностных остатков (E34, K35 и R38) в N-домене фермента [142] (рис. 7).

Изучение АТРазной, пептидазной и протеолитической активностей, а также аутолитического расщепления EcLon-протеазы и ее модифицированных форм, проведенное как в базовых условиях, так и при влиянии эффекторов (белковые субстраты в случае гидролиза АТР и нуклеотиды или их комплексы с ионами Mg²⁺ в случае других типов активности) показало, что оба домена N-концевой области важны для функционирования индивидуальных каталитических центров LonА-протеаз – АТРазного и пептидазного, а также для осуществления аллостерических взаимодействий между ними. При этом ключевую роль в реализации уникального процессивного механизма гидролиза белкового субстрата играет инсерционный HI(CC)-домен, который вовлечен в формирование функционально активной гексамерной структуры фермента и во взаимодействия ЕсLon-протеазы с нуклеотидами и белковыми субстратами. В отношении N-домена сделано заключение о том, что его основная функция – обеспечение конформационной стабильности ЕсLon-протеазы в классических условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР.

Структурное сходство между LonA-протеазами и ClpB-шаперонами. Для получения представления о структуре инсерционного HI(CC)-домена в составе протомера фермента были предприняты попытки совмещения фрагментов EcLon-протеазы, представленных на рис. 6. Однако такая задача оказалась невыполнимой вследствие чрезвычайной гибкости региона, формирующего HI(CC)-домен. Тем не менее путем сравнительного анализа кристаллических структур форм EcLon, содержащих фрагменты HI(CC)-домена (рис. 6а, 6б), и АТРазных модулей ClpВ-шаперонов (рис. 8а) было показано, что LonA-протеазы могут представлять собой новый необычный подкласс AAA⁺-белков [105].

Основанием для такого анализа послужило обнаруженное сходство [100, 101, 105] первичных и вторичных структур HI(CC)-доменов LonA-протеаз и Н1-доменов D1-модулей шаперонов ClpB с внедренными в них пропеллерообразными М-доменами, обладающими СС-структурой (Н1(М)-фрагмент на рис. 2). Общий специфический признак сопоставляемых фрагментов – наличие “длинных” α-спиралей (55 а.о. у LonA-протеаз и 58 а.о. у ClpB-шаперонов, рис. 6а и 8а соответственно), степень подобия которых превышает 50% при общей степени сходства СС-сегментов ~36%.

Было проведено сопоставление α-спирализованной составляющей D1-модуля ClpB-шаперона T. thermophilus (TtClpB, домены Н1 и М на рис. 8б) и фрагментов EcLon, потенциально формирующих HI(CC)-домен фермента (рис. 8в и 8г – участки, объединенные серым фоном). Структурная эквивалентнность “длинных” спиралей (L2 и α7), совпадение общего количества спиралей в CC-сегментах (L1–L4 и α6–α9) и возможное сходство их топологического расположения с учетом различий в размерах малых спиралей (рис. 8б–8г) позволили выдвинуть гипотезу о том, что архитектура вставочного HI(CC)-домена LonА-протеаз может быть подобной архитектуре Н1(М)-фрагмента ClpB-шаперонов [100, 101, 105].

Данные в поддержку этого предположения были получены при сравнительном изучении расположения ключевой консервативной петли pore loop-1 (GYVG) ААА⁺-модулей в структурах LonA-протеаз и Clp-шаперонов, проведенном путем наложения соответствующих структурных фрагментов NB-доменов LonА-протеаз на фрагменты NB1- и NB2-доменов шаперонов ClpВ, а также топологически подобных им шаперонов ClpА, у которых отсутствует вставочный М-домен. При этом было установлено, что ориентация GYVG-петли в LonА-протеазах кардинально отличается от ее положения в NB1-доменах ClpВ и в обоих NB-доменах ClpА (рис. 9а, 9в и 9г), но однозначно и безусловно совпадает с ее расположением в NB2-доменах ClpB (рис. 9б) [105]. Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что и предстоящие NB-доменам α-спирализованные HI(CC)-домены LonА-протеаз, и Н1(М)-фрагменты ClpB-шаперонов также могут проявлять определенное топологическое сходство.

Совокупные данные рентгеноструктурного анализа представляют достаточно обоснованные аргументы в пользу справедливости гипотезы о том, что инсерционный HI(CC)-домен можно рассматривать в качестве α-спирализованного компонента гипотетического добавочного ААА⁺-модуля, который мог локализоваться в LonА-протеазах подобно D1-модулю шаперонов ClpB (рис. 2), однако утратил свой нуклеотид-связывающий домен. На этом основании Rotanova et al. [105] предлагают признать протеазы подсемейства LonA особым, ранее неохарактеризованным подклассом AAA⁺-белков.

Спиральная организация гексамеров ААА⁺-белков – базовое условие транслокации белковых мишеней/субстратов

Представление об общей архитектуре ААА⁺-белков как циклических гексамеров было получено в результате их рентгеновской кристаллографии. При этом в ряде случаев ААА⁺-белки обнаруживались в виде открытых гексамерных колец или спиралевидных комплексов, что свидетельствовало о возможности больших конформационных изменений у этих ферментов [144]. Вместе с тем вопросы о взаимодействии ААА⁺-белков со своими субстратами и о путях сопряжения АТРазной и транслокационной функций долгое время оставались неизученными.

Прорывным исследованием в этом отношении оказалась работа 2013 г. [145], в которой при помощи крио-ЭМ впервые было показано, что взаиморасположение шести субъединиц (Rpt1–Rpt6) регуляторного 19S-комплекса дрожжевой 26S-протеасомы, связанной с субстратом, представляет тип правосторонней “винтовой лестницы”. Это открытие было подтверждено в последующие годы решением крио-ЭМ-структур более чем 50 ААА⁺-белков с различной функциональностью [39, 44, 144, 146–151]. В принятой на настоящий момент модели комплекса ААА⁺-белок*S (где S – белковый субстрат) АТРазные субъединицы (или протомеры) “обволакивают” со всех сторон белковую мишень, локализованную в вертикальном центральном канале ААА⁺-белка (рис. 10) [144]. При этом пять субъединиц (A–E), связанных с АТР, но имеющих различные конформации [144, 146, 152], непосредственно контактируют с белком-субстратом посредством петель pore loop-1 (GYVG), обращенных внутрь канала. В то же самое время шестая субъединица F (“стыковочная”, “seam”), пребывающая сначала в ADP-связанном, а затем в аро-состоянии, оказывается свободной от субстрата и располагается между верхней (А) и нижней (Е) субъединицами (рис. 10). Установлено, что соседние субъединицы, контактирующие с субстратом, разделены расстоянием в 6 Å (дистанция в 2 а.о. в последовательности субстрата) и повернуты друг относительно друга на 60° (отражение симметричности кольцевого гексамера). Особо следует отметить, что в отсутствие субстратов ААА⁺-белки могут принимать множество различных конформаций (формируя в том числе плоские симметричные кольца), что определяется различием их экстрадоменов и/или включением в некоторых случаях дополнительных вставочных элементов структуры [39, 144, 147].

Механизм поэтапной транслокации белка-мишени, регулируемой гидролизом АТР, подтвержден для целого ряда ААА⁺-белков [39, 144, 146, 147], причем установлено, что ключевую роль в процессе транслокации играют крупномасштабные конформационные перестройки внутри ААА⁺-модулей, происходящие с участием междоменных линкеров. Аллостерическое влияние нуклеотидного состояния АТРазных субъединиц ААА⁺-гексамера приводит к различному расположению ключевых остатков тирозина петель GYVG в аксиальном канале, что обеспечивает прочный захват субстрата и реализацию последовательного кругового цикла гидролиза АТР (“around-the-ring ATP hydrolysis cycle”), первый этап которого происходит в нижней субъединице E. Образование ADP и высвобождение фосфата дестабилизируют междоменные взаимодействия внутри этой субъединицы (в частности, за счет увеличения угла поворота между NB- и H-доменами ААА⁺-модуля) и, кроме того, ослабляют ее взаимодействия с другими субъединицами (вследствие нарушения связи ISS-мотива и остатка “аргининовый палец” с нуклеотидом соседней субъединицы). Все это приводит к отсоединению субъединицы E как от субстрата, так и от смежной субъединицы D и ее передвижению к вершине спирали (рис. 10). Одновременно АТР-содержащие субъединицы (A–D), связанные с субстратом, продвигаются вниз по спирали в виде единой жесткой конструкции (rigid body), обеспечивая тем самым разворачивание и нисходящую транслокацию субстрата внутри центрального канала. Вместе с тем в отделенной на предыдущей стадии стыковочной seam-субъединице F происходит обмен ADP на АТР, и она снова становится способной к установлению стабильного взаимодействия с соседней субъединицей (A) и к связыванию с белковой мишенью в сайте, расположенном на 2 а.о. выше, чем сайт связывания субъединицы A (рис. 10). Таким образом, эта модель предполагает регулярное пошаговое перемещение ААА⁺-гексамера вдоль субстрата. При этом в каждом цикле транслокации гидролизуется одна молекула АТР, и в любой момент времени четыре субъединицы, связанные с АТР, остаются в контакте с субстратом, предотвращая его случайное “скольжение” в канале или высвобождение.

Для большей наглядности Puchades et al. [39] проводят аналогию между представленным “каскадным” механизмом транслокации и подтягиванием саней с помощью привязанной к ним веревки, когда согласованно работают шесть рук: они поочередно дотягиваются до веревки, схватывают ее и тянут (механизм “hand-over-hand” – “из руки в руку”). Руки попеременно отпускают веревку внизу и хватают ее сверху, при этом веревка все время остается плотно зажатой четырьмя “центральными” руками, и каждый цикл сопровождается тяговым усилием. Совокупность подобных движений в ААА⁺-белке обеспечивает постоянный захват и удерживание субстрата, а также его ступенчатую транслокацию, которая сочетается с последовательными круговыми циклами гидролиза АТР, протекающего в субъединицах гексамерного кольца шаперона в направлении против часовой стрелки (рис. 10).

Описанный выше основной механизм транслокации субстрата в направлении по часовой стрелке, называемый SC/2R (Sequential Clockwise/2-Residue step), зачастую рассматривается как универсальный для ААА⁺-белков, выполняющих разные функции [144, 146, 149]. Тем не менее существует ряд примеров функционирования белков по альтернативным механизмам. Так, транслокация белкового субстрата шапероном ClpX происходит по модели SC/6R, когда каждый цикл гидролиза АТР сопряжен с перемещением ААА⁺-гексамера сразу на 6 а.о. [153]. Кроме того, в работе Fei et al. [153] обсуждаются также модели транслокации, реализация которых приводит к изменению не только диапазона перемещения АТРазных субъединиц (вплоть до 30 а.о. и более), но и направления их передвижения (против часовой стрелки). Помимо этого, для некоторых ААА⁺-шаперонов обнаружено, что цикл транслокации субстрата может быть связан с перемещением не одной, а двух стыковочных АТРазных субъединиц [151].

Крио-ЭM-структуры EcLon и других LonA-протеаз

Проводимое в самые последние годы в ряде лабораторий изучение полноразмерных LonА-протеаз методом крио-ЭМ позволило получить новые данные о строении бактериальных ферментов из E. coli (EcLon) [154], M. taiwanensis (MtLon) [155] и Yersinia pestis (YpLon) [156], а также эукариотической LonА-протеазы человека (HumLon) [157]. Обнаружено, что подобно описанным выше индивидуальным ААА⁺-шаперонам АТРазные модули протомеров LonА-протеаз, выступающие центральными фрагментами единой полипептидной цепи этих сложных ферментов, которые фланкированы N-концевыми областями и С-концевыми протеазными доменами, также формируют активные гексамерные комплексы с архитектурой “винтовой лестницы” (табл. 4).

Вместе с тем следует подчеркнуть, что долгое время даже с помощью крио-ЭМ не удавалось выявить структуру N-концевых областей полноразмерных LonA-протеаз, включающих N-домен и большую часть вставочного α-спирализованного HI(CC)-домена, вследствие высокой гибкости этого региона в протомерах ферментов (табл. 4). При этом использование электронной микроскопии низкого разрешения (ЭМ) для изучения укороченной HumLon-протеазы, лишенной N-домена, показало, что фрагменты HI(CC)-доменов противостоящих субъединиц фермента объединяются в димерные пары (A–D, B–E и C–F), из которых складывается тример димеров, формирующий вход в аксиальный канал, образованный ААА⁺-модулями фермента [158]. Эти данные успешно подтверждены вновь полученными с помощью крио-ЭМ структурами полноразмерных бактериальной LonA-протеазы из Thermus thermophilus (TtLonA) [159] и HumLon-протеазы [160, 161]. Есть основания полагать, что выявленная организация N-концевых областей LonA-протеаз топологически подобна структурам входных отверстий в аксиальные каналы, сформированным N-концевыми экстрадоменами других шаперонов-транслоказ (ClpX, ClpB, ААА⁺-АТРазы эукариотических и архейных протеасом [88, 91, 92, 148]) (см. подраздел “Основные характеристики некаталитических экстрадоменов АТР-зависимых протеаз”). Можно ожидать, что углубленный анализ новых структур даст возможность получить также ответы на вопросы о позиции и структурной роли уникальных N-доменов LonA-протеаз, служащих структурными аналогами PUA-доменов (см. подраздел “Различие функций доменов, формирующих N-концевую область LonA-протеаз”), но пока остаются недостаточно охарактеризованными.

На примере полноразмерной EcLon-протеазы методом ЭМ было также обнаружено сосуществование двух олигомерных форм фермента – гексамерной и додекамерной, где додекамеры образованы в результате непосредственного взаимодействия N-концевых областей гексамеров EcLon по типу “голова к голове” [154, 162, 163]. Детали структуры, механизм функционирования и биологическую значимость додекамерной формы LonA-протеаз еще предстоит выяснить.

Участники LonA-подсемейства, исследованные методом крио-ЭМ, характеризуются высоким сходством своих первичных структур (рис. 11). Так, EcLon и YpLon содержат 91.1% консервативных остатков, а общая степень подобия этих ферментов составляет 98.5%. Степень подобия между EcLon и MtLon несколько ниже – 77.9% (при 50.1% консервативных остатков), практически те же цифры характеризуют пару EcLon/TtLon (77.2 и 50.3%), а подобие между EcLon и HumLon составляет 70.7% (34.7% консервативных остатков). Консервативны для всех четырех ферментов 27.2% а.о. (общая степень подобия 55.4%).

Наименьший уровень сходства обнаруживают N-домены (39.3%), близки по степени подобия HI(CC)- и Н-домены (50.8 и 52.8% соответственно), высокое сходство проявляют нуклеотид-связывающие и протеолитические домены (79.4 и 66.1%). Несмотря на это, в элементах вторичной структуры Р-доменов EcLon, YpLon и HumLon обнаруживаются заметные отличия (в частности, в области каталитического остатка серина, рис. 11), что, однако, практически не нарушает их общей топологии.

Установлено (табл. 4), что в отсутствие транслоцируемого белкового субстрата спиральные гексамеры ААА⁺-модулей LonА-протеаз, включающие связанный ADP, принимают открытую левостороннюю конфигурацию [154–157, 160]. При этом HumLon олигомеризуется с меньшим шагом спирали, чем ее бактериальные ортологи (EcLon и YpLon) [157]. Той же левосторонней конфигурации соответствует пространственная организация протеазных доменов ферментов, причем их каталитические центры, экспонированные во внешнюю среду вследствие образования обширной полости между верхним и нижним протомерами, пребывают в неактивных конформациях (состояние фермента – “выключено”, “OFF”) [154–157, 160]. Проявляемое “аутоингибирование” активных центров протеаз позволяет предотвратить вероятную в этих условиях беспорядочную деградацию белковых молекул клеточного протеома.

В присутствии белка-субстрата гексамеры LonА-протеаз, содержащие также молекулы ADP, АТР (или его медленно гидролизующегося аналога АТР-γ-S) и ионы Mg²⁺, подвергаются реорганизации в активное состояние, отвечающее за транслокацию субстрата. Эти изменения приводят к формированию вокруг транслоцируемых полипептидов закрытых спиральных правосторонних ААА⁺-конформеров и к перестройке протеазных доменов с образованием симметричных планарных структур с активными каталитическими центрами (состояние ферментов – “включено”, “ON”) [154–157, 160]. При этом в структурах ферментов их ААА⁺-кольца оказываются наклоненными по отношению к центральной оси 6-го порядка колец Р-доменов [160]. Применение борорганического ингибитора бортезомиба приводит к “закреплению” активной конформации протеазных центров [155, 157]. Показано, что конформация активного фермента сохраняется также при введении в HumLon мутаций как по мотиву Уолкера WB, так и по каталитическому остатку лизина [157, 160]. Следует отметить, что важную роль при переходе протеазных доменов от спиральной организации к плоскому состоянию играют линкерные фрагменты, соединяющие ААА⁺-модули с Р-доменами (рис. 11). На примере YpLon-протеазы отмечено, что левосторонняя спираль гексамера фермента (“OFF”) значительно круче ее правостороннего конформера (“ON”) [156].

Shin et al. [156] полагают, что переход гексамера LonА-протеазы из состояния “OFF” в состояние “ON” инициируется связыванием АТР верхним протомером и взаимодействием его петли pore loop-1 с белковой мишенью, что обеспечивает энергию, необходимую для реализации начального этапа локального разворачивания субстрата, за которым следует процесс последовательного гидролиза АТР, сопровождающийся пошаговой транслокацией развернутого полипептида в протеазную камеру для деградации.

Описанные к настоящему времени структуры функционально активных LonА-протеаз кроме сходства общей архитектуры, определяемой конфигурацией ААА⁺-модуля, проявляют ряд заметных отличий, обусловленных, главным образом, связыванием белков-субстратов. Так, установлено, что АТРазные кольца бактериальных ферментов (MtLon и YpLon) состоят из четырех нисходящих по спирали ААА⁺-модулей, взаимодействующих с субстратом, и двух восходящих стыковочных субъединиц [155, 156], в то время как у эукариотической HumLon-протеазы в связывании с субстратом участвуют пять ААА⁺-модулей, и только одна субъединица выполняет функцию стыковочной [157]. При этом в работе Gesé et al. [160] описана АТР-связанная стыковочная субъединица HumLon, что противоречит нуклеотидному статусу seam-субъединиц, соответствующему основному механизму транслокации (“аро” или комплекс с ADP) (рис. 10). Авторы считают, что обнаруженное состояние отражает промежуточную стадию, которая непосредственно следует за обменом нуклеотидов в стыковочном протомере и предшествует его повторному вовлечению в связывание субстрата.

Еще одно отличие связано с тем, что у некоторых LonA-протеаз во взаимодействии с субстратом кроме основных петель pore loop-1, включающих критически важный остаток Tyr, могут участвовать также петли pore loop-2 при условии, что в них содержится остаток ароматической аминокислоты, способный к связыванию с основной цепью белка-субстрата (ферменты MtLon и HumLon в табл. 4). Дополнительные взаимодействия с петлями pore loop-2 позволяют визуализировать более протяженные фрагменты последовательностей связанных субстратов (7 а.о. в структуре YpLon и 11–12 а.о. в структурах MtLon или HumLon) [155–157, 160].

Наиболее впечатляющим различием служит тот факт, что для активации протеазных доменов у бактериальных ферментов достаточно “захвата” полипептидного субстрата только ААА⁺-модулями, в то время как для эукариотической HumLon-протеазы дополнительным требованием выступает взаимодействие субстрата также и с протеазными активными центрами (табл. 4) [155–157, 160]. Важная характеристика HumLon – наличие АТР-зависимой шапероновой активности, причем способность к сворачиванию ряда митохондриальных белковых субстратов сохраняется и у протеолитически неактивного фермента [157]. Авторы полагают, что шапероновая и протеолитическая функции – это независимо регулируемые функции HumLon-протеазы, а возможность дифференцированного взаимодействия субстратов с ААА⁺-модулями и Р-доменами служит проявлением функциональной пластичности, необходимой для регулирования разнообразных ролей этого фермента в митохондриях [157].