Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 5, стр. 589-598

ВВЕДЕНИЕ

Блютанг, или катаральная лихорадка овец, – это инфекция домашних и диких жвачных животных, переносимая насекомыми. Блютанг поражает преимущественно овец, при этом широко распространено скрытое заражение крупного рогатого скота. Вирус блютанга (BTV) принадлежит к роду Orbivirus, семейству Reoviridae. BTV имеет сегментированный геном из двухцепочечной РНК, упакованный в покрытую оболочкой частицу размером 80 нм. Поверхностный гликопротеин VP2 демонстрирует высокую гетерогенность у различных штаммов BTV и определяет серотипную специфичность. Существует 29 различных типов (серотипов) BTV, которые могут инфицировать домашних овец, коз и крупный рогатый скот, а также диких животных, таких как буйволы, олени, антилопы и верблюды [1, 2].

Бессимптомное течение инфекции у крупного рогатого скота приводит к неконтролируемой передаче вируса и чрезвычайно затрудняет эпидемиологическую оценку заболеваемости. Несмотря на прогресс в исследованиях вакцины против BTV, болезнь по-прежнему представляет серьезную угрозу для животноводства во всем мире [3, 4].

Простые, надежные, быстрые и чувствительные диагностические тесты имеют решающее значение для контроля перемещений животных, карантинов и расследования вспышек заболевания. Существующие методы диагностики условно можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы прямого обнаружения вирусов (инфицирование куриного эмбриона или клеточной линии) с последующей иммунологической и генетической характеристикой (ПЦР и/или секвенирование). Эти методы предоставляют исчерпывающую информацию о вирусе, но чрезвычайно трудоемки и требуют много времени [2, 5–10].

Выявление специфических антител к BTV у инфицированных, выздоровевших и вакцинированных животных – еще одно важное направление диагностики (иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный тест). Например, описан иммуноанализ с использованием микросфер, конъюгированных с двумя поверхностными вирусными белками, для одновременного определения групп- и серотип-специфических антител в сыворотке крови инфицированных животных [11]. Показано, что антитела к белкам BTV могут быть обнаружены в сыворотках крови овец через 7–14 лет после инфицирования и сохраняются в течение длительного времени [12]. Серологические анализы подтверждают предыдущий контакт животных с вирусом, а не наличие инфекционного вируса.

Формат сэндвич-ИФА широко используется из-за его высокой чувствительности и специфичности для обнаружения аналитов в многокомпонентных смесях, таких как биологические жидкости [13]. Проточный цитометр – широко используемый прибор в клинической лабораторной практике. Быстрое многомерное исследование отдельных живых микрообъектов сделало проточную цитометрию бесценным инструментом как для качественного, так и для количественного анализа [14, 15]. Проточная вирометрия обеспечивает быстрое, чувствительное и количественное обнаружение вирусных аналитов, что побудило нас разработать анализы на основе проточной вирометрии для обнаружения BTV.

Успешному обнаружению вирусов способствует использование микрочастиц, конъюгированных с антителами для улавливания вирусных частиц. В нескольких исследованиях микрочастицы, конъюгированные с вирус-специфическими антителами, использовались для идентификации и дифференциации вирусов гриппа A и B, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и вируса Денге [16–19].

В работе Руденко с соавт. [20] описаны получение и характеристика высокоаффинных моноклональных антител (mAb) к поверхностным эпитопам VP7 BTV. VP7 – относительно консервативный белок, ответственный за групповую специфичность [1] и иммуногенные свойства вируса и количественно преобладающий в структуре вириона [21–23]. При получении mAb для детекции BVT был использован рекомбинантный белок VP7_а, соответствующий фрагменту белка VP7, экспонированному на поверхности вирусной частицы и включающему 114–257 а.о. [24]. mAb к VP7 способны связываться с поверхностными эпитопами 24 серотипов BTV.

Цель данного исследования – разработка быстрого и чувствительного метода детекции вируса блютанга в биологических жидкостях животных методом проточной вирометрии с использованием моноклональных антител [20] к поверхностным эпитопам вирусной частицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обнаружение вируса блютанга в инфицированных клетках с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. Для идентификации BTV в инфицированных клетках использовали панель специфических mAb [20]. Способность mAb взаимодействовать с поверхностными эпитопами вирусных частиц была подтверждена иммуноферментным анализом по взаимодействию с рекомбинантным белком, состоящим из участка аминокислотной последовательности VP7, экспонированного на поверхности вирусной частицы (114–257 а.о. в последовательности исходного белка), и фрагмента тиоредоксина. Этот анализ и получение рекомбинантного VP7 описаны нами ранее [20]. Все полученные mAb были протестированы на их способность обнаруживать BTV в инфицированных клеточных линиях в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). mAb эффективно окрашивали инфицированные клетки. На рис. 1 показано сравнение данных между взаимодействием антител с вирусными частицами в инфицированных клетках и данными ИФА о взаимодействии mAb с рекомбинантным белком, содержащим фрагменты VP7 и тиоредоксина.

Рис. 1.

Сравнение антиген-связывающей активности mAb к VP7 вируса блютанга [20]. Гистограмма показывает зависимость степени связывания mAb от концентрации: ИФА – связывание с рекомбинантным белком, состоящим из фрагментов VP7 и тиоредоксина; РНИФ – идентификация BTV-1 в инфицированных клетках Vero.

Антитела к VP7 реагировали с инфицированными клеточными линиями до концентрации 0.1 мкг/мл в РНИФ. Визуализацию проводили с использованием вторичных антител, меченных FITC. На рис. 2 в качестве примера представлена микрофотография иммунофлуоресцентного окрашивания антителом Bt-33 (как одним из наиболее эффективных в этой реакции) клеток Vero, инфицированных BTV серотипа 1, демонстрирующая эффективное выявление вирусных частиц, в сравнении с интактными клетками. Амплификацию вируса проводили в течение четырех суток. Даже незначительного количества вирусных частиц, выделенных из зараженного материала, достаточно для эффективного выявления антителами в РНИФ.

Рис. 2.

РНИФ культуры клеток Vero, инфицированных BTV-1 MOI 0.02, культивируемой в течение 96 ч после инфекции: (а) – неинфицированная культура клеток Vero; (б) – детекция с mAb AlpA-2 [25]; (в) – детекция с Bt-33. Увеличение 40×.

Сэндвич-ИФА. Тест-системы для выявления BTV были разработаны в формате сэндвич-ИФА, как описано ранее [26]. Для подбора детектирующих пар антител к BTV проводили биотинилирование всех mAb имеющейся панели с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира биотина. Биотинилированные антитела использовали в качестве детектирующих антител, а иммобилизованные на планшетах для ИФА немеченые антитела – для захвата вирусных частиц.

Были проверены все возможные сочетания mAb против вирусных частиц для обнаружения детектирующих пар антител с максимальным соотношением сигнал/фон, т.е. отношением оптической плотности в лунках микропланшета с антигеном и без него. В качестве аналита использовали инактивированный препарат BTV серотипа 1, экстрагированный фреоном. Полученный таким образом BTV представляет собой цельные вирусные частицы [27], это дало основание предполагать, что разработанный метод будет направлен на выявление интактных вирусов. В результате были выбраны следующие пары mAb, эффективно выявляющие инактивированный BTV: Bt-3 (захват) + + Bt-9 (детекция), Bt-3 (з) + Bt-28 (д), Bt-8 (з) + + Bt-9 (д), Bt-8 (з) + Bt-28 (д), Bt-(3 + 8) (з) + Bt-9 (д), Bt-(3 + 8) (з) + Bt-28 (д). Соотношение сигнал/фон для этих детектирующих “пар” равнялось шести при концентрации аналита 100 нг/мл, ошибка измерения ±5%. Максимальную чувствительность демонстрировали пары антител Bt-3 (з) + + Bt-9bio (д) и Bt-3 (з) + Bt-28bio (д), которая составила 10^3.94 ТЦД₅₀/мл и 3 нг/мл при использовании инактивированного препарата.

Конъюгирование флуоресцентных микросфер с mAb. Антитела захвата из детектирующих пар, разработанных для сэндвич-ИФА, конъюгировали с флуоресцентными микросферами с использованием Sulfo-SMCC. Контроль иммобилизации антител на флуоресцентных микросферах проводили по взаимодействию с антителами против иммуноглобулинов мыши, меченных PE. Конъюгаты флуоресцентных микросфер с mAb демонстрировали 500-кратное увеличение медианы интенсивности флуоресценции (MIF) при 585/40 нм по сравнению с контрольными микрочастицами без антител.

Для обнаружения вирусных частиц использовали микросферы, конъюгированные с mAb захвата, и детектирующие антитела, меченные либо AlexaFluor 488, либо биотином. В случае использования биотинилированных антител иммунные комплексы детектировали стрептавидином, меченным PE (SA-PE).

Были протестированы все детектирующие пары mAb, отобранные в сэндвич-ИФА. Сравнили два способа мечения детектирующих антител с целью определения оптимального способа детекции вирусных частиц: прямое введение флуоресцентной метки (AlexaFluor 488) и опосредованное через высокоаффинную биотин-стрептавидиновую систему, позволяющую не только идентифицировать сигнал, но и амплифицировать его.

Иммунофлуориметрическое определение концентрации вируса блютанга с использованием микросфер. Определение вируса проводили, добавляя препарат BTV (в соответствующем разведении) к смеси функциональных микросфер с иммобилизованными mAb захвата и с мечеными детектирующими mAb. Процедура определения BTV была максимально оптимизирована, подобраны концентрации реагентов с учетом оптимальных диапазонов и линейности детекции аналитов. Концентрация AlexaFluor 488-меченных и биотинилированных антител составляла 5 мкг/мл. С целью оптимизации процедуры анализа были объединены этапы инкубирования сенсибилизированных микросфер в экспериментальной точке с аналитом и детектирующими мечеными антителами. В случае AlexaFluor 488-меченных антител анализ проводили в одну стадию, в случае биотинилированных антител – в две. В результате общее время анализа удалось сократить на 60 мин без потери в чувствительности и специфичности.

Результаты определения BTV представлены в табл. 1. При использовании AlexaFluor 488 в качестве флуоресцентной метки минимальный предел определения (аналитическая чувствительность определения BTV) для всех исследуемых детектирующих пар составил 10^1.75 ТЦД₅₀/мл. По-видимому, существенный вклад в чувствительность определения вносила неспецифическая флуоресценция, т.е. значение MIF в отсутствие вирусных частиц (отрицательный контроль). При использовании биотинилированных детектирующих антител и в качестве флуоресцентной метки SA-PE неспецифическая флуоресценция имела значения в среднем на 76% меньше, чем в случае с AlexaFluor 488. Минимальным пределом определения считали значение MIF, превышающее отрицательный контроль (фон) как минимум в 2 раза (табл. 1). Для большинства исследуемых детектирующих пар минимальный предел определения составил 10^0.75 ТЦД₅₀/мл. Детектирующая пара Bt-3 (з) + Bt-28 (д) демонстрировала предел детекции вирусных частиц, равный 10^–0.25 ТЦД₅₀/мл. На рис. 3 представлен калибровочный график определения вирусных частиц, а также показано определение BTV в сыворотке бычьей крови, в этом случае чувствительность составила 10^0.75 ТЦД₅₀/мл.

Рис. 3.

Калибровочный график определения BTV-1, полученный с помощью анализа на флуоресцентных микросферах с использованием детектирующей пары mAb Bt‑3 (захват) + Bt-28 (детекция). На графиках представлены средние значения и стандартные отклонения, полученные в пяти повторах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Несмотря на эффективность существующих методов диагностики BTV, большинство современных методов медленные или дорогостоящие, что не позволяет быстро реагировать при вспышках заболевания. Молекулярно-биологические методы, такие как ПЦР в реальном времени, несмотря на высокую скорость определения, требуют выделения генетического материала и сложного оборудования. ПЦР выявляет инфекцию, но не свидетельствует о фактической связи между инфекцией и клиническими признаками. Секвенирование геномов, в особенности для РНК-вирусов, несмотря на очевидные успехи и снижение стоимости, все еще остается дорогой и длительной процедурой, не позволяющей использовать его в качестве рутинного диагностического теста [28]. Развитие аналитических методов быстрого обнаружения и идентификации BTV с высокой чувствительностью и избирательностью по-прежнему актуально.

Для разработки иммунохимических методов идентификации BTV была использована панель моноклональных антител [20] к VP7 – относительно консервативному белку, ответственному за групповую специфичность [10]. Этот фрагмент экспонирован на поверхности интактных вирионов и коровых частиц вируса BTV [24]. Антитела к VP7 узнают вирусные частицы всех серотипов, следовательно, разработанный тест пригоден для скрининга виремии, вызванной любым серотипом вируса блютанга. Использование антител с такой специфичностью позволило разработать высокочувствительный тест для идентификации вирусных частиц непосредственно в биологических жидкостях зараженного животного. В данной работе продемонстрирована возможность определения BTV в сыворотке крови с использованием цитофлуориметра BD Accuri C6 (Becton Dickinson, США), позволившего значительно сократить время детекции. Проточные цитофлуориметры широко распространены в современных лабораториях.

Чувствительность определения вирусных частиц разработанным методом сопоставима с данными Martinelle et al. [29], которые методом ПЦР в реальном времени определяли содержание вирусов в тканях на пике виремии после некропсии вакцинированных и невакцинированных животных, искусственно зараженных патогенными штаммами вируса. При этом наименьшее число копий вирусных геномов было отмечено для серотипа BTV4 – после пересчета соответствует 10^0.58 ТЦД₅₀/мл. Такое количество вирусов уже достаточно для детекции разработанным методом. Для других серотипов на пике виремии количество копий вирусных геномов существенно выше, а следовательно, разработанным методом они могут детектироваться и на более ранней стадии инфицирования. При этом важно отметить, что для передачи вирусов комарами необходимо, чтобы вирус преодолел порог 10³¹⁵⁵ ТЦД₅₀/мл. Следовательно, иммунофлуориметрическое определение концентрации вирусов с использованием микросфер, описанное в данной работе, имеет достаточную чувствительность и может применяться для выявления интактных вирусных частиц непосредственно в биологических жидкостях инфицированных животных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Вирус блютанга и клетки. BTV-1 (Испанский пул 1,2 овечья кровь) с инфекционной активностью 10^6.75 ТЦД₅₀/мл получен из Государственной коллекции микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, зооантропонозные и пограничные болезни (регистрационный номер CCU – 441429, http://ckp-rf.ru/ckp/441429/). Лизаты клеток Vero, зараженных BTV-1, очищали и концентрировали в соответствии с методикой Verwoerd et al. [27]. Для размножения вируса использовали клетки почек африканской зеленой мартышки (Vero) из коллекции ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии”.

Размножение и титрование BTV-1. Культуру клеток Vero инфицировали BTV-1 MOI 0.02. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 ч при 37 ± ± 0.5°С. Затем инфицированный монослой клеток отмывали от несвязавшегося вируса трехкратно средой Игла-МЕМ без сыворотки. Далее клетки инкубировали со средой Игла-МЕМ, содержащей 2% FBS (SH30070.03; Defined Fetal Bovine Serum, HyClone, США) при 37 ± 0.5°С в течение 4 суток. Цитопатический эффект контролировали ежедневно. Инфекционную активность BTV-1 определяли путем лимитирующего разведения вируса в клетках Vero. Инфекционную дозу для культуры ткани ТЦД₅₀/мл рассчитывали с использованием метода Рида и Мюнха в модификации Ашмарина [30].

Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Для определения способности ранее полученных антител [20] идентифицировать антигены BTV-1 в инфицированных клетках были подготовлены аналитические тест-планшеты для тестирования в РНИФ. Клетки Vero культивировали в лунках 96-луночных планшетов в течение 1–2 суток в ростовой среде Игла, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2.5 ед./мл амфотерицина В. Клетки в планшетах заражали BTV‑1 MOI 0.02 в объеме 100 мкл среды Игла с указанными антибиотиками. Интактные и инфицированные клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 95%-ной влажности и 5% СО₂ в течение 4 суток. Кондиционную среду из лунок удаляли, клеточный монослой дважды промывали PBS (3 мМ KCl, 1 мМ KH₂PO₄, 140 мМ NaCl, 9 мМ Na₂HPO₄), фиксировали 80%-ным (v/v) ацетоном, охлажденным до –20°С.

К клеткам добавляли серийные двукратные разведения антител и сывороток (нормальной, в качестве отрицательного контроля, и специфической, содержащей антитела к вирусу, – в качестве положительного контроля) в PBS, содержащем 1% FBS, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После двух последующих промывок PBS антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с FITC, добавляли в рабочем разведении 1 : 1000 в соответствии с рекомендациями производителя (31555; Thermo Fisher Scientific, США). Иммунные комплексы в инфицированных клетках визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Eclipse 90i (Nicon, Япония).

Конъюгация антител с биотином. Биотинилирование антител проводили по стандартной методике [31].

Сэндвич-ИФА. Сэндвич-ИФА проводили, как описано ранее [26]. Немеченые mAb захвата иммобилизовали на полистирольных планшетах для ИФА (655001; Greinerbio-one, США), далее добавляли биотинилированные mAb детекции и инактивированный BTV-1 (100 нг/мл) [27], в контрольные лунки вносили только антитела детекции. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляли конъюгатом пероксидазы хрена со стрептавидином (21126; Thermo Fisher Scientific, США), взаимодействующим с биотинилированными детектирующими антителами. Детекцию проводили после обработки о-фенилендиамином (P23938; Sigma-Aldrich, США) – растворимым хромогенным субстратом пероксидазы, измеряли оптическую плотность при 490 нм на микропланшетном фотометре iMark (Bio-Rad, США).

Конъюгация функциональных микросфер с mAb. Для ковалентного присоединения mAb использовали микросферы размером 7.5 мкм (558582, 558583, 558581; BD Biosciences, США), содержащие функциональные группы, взаимодействующие с Sulfo-SMCC (22322; Pierce, США). Функциональные микросферы конъюгировали с mAb Bt-3 и Bt-8 [20] в качестве антител захвата согласно инструкции производителя (558556; BD Biosciences, США).

Конъюгирование антител с AlexaFluor 488. mAb Bt-9 и Bt-28 конъюгировали с N-гидроксисукцинимидным эфиром AlexaFluor 488 (A20000; Thermo Fisher Scientific, США) в бикарбонатном буфере (0.1 М, рН 9.0) согласно методике Velázquez-López et al. [32].

Детекция вируса блютанга методом проточной цитофлуориметрии. В качестве самостоятельных систем для обнаружения BTV-1 были использованы функциональные микросферы: с иммобилизованными mAb Bt-3 (558582, BD Biosciences), с mAb Bt-8 (558583, BD Biosciences) и Bt-3 + Bt-8 (558581, BD Biosciences). Для детекции использовали mAb Bt-8, Bt-9, Bt-28, меченные биотином или AlexaFluor 488. Серийные десятикратные разведения BTV-1 (от концентрации вирусных частиц, равной 10^6.75, до 10^–2.25 ТЦД₅₀/мл) готовили в буфере для разведения (PBS с 0.1% Tween 20 и 1% FBS).

В случае использования флуоресцентно меченых детектирующих антител реакционную смесь готовили путем одновременного смешивания всех компонентов в буфере для разведения. В ходе эксперимента в отдельные промаркированные пробирки добавляли по 1 мл заранее приготовленных растворов, содержащих вирусные частицы в десятикратно различающихся концентрациях. В качестве отрицательного контроля использовали 1 мл буфера для разведения без добавления вирусов. К каждой экспериментальной точке добавляли по 1 мкл суспензии микросфер, конъюгированных с антителами захвата, что соответствовало ~6 × 10³ частиц, и флуоресцентно меченых антител до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полученные смеси инкубировали 4 ч при комнатной температуре в темноте, тщательно перемешивая содержимое пробирок. Определение BTV в бычьей сыворотке выполняли аналогичным образом с использованием FBS вместо буфера для разведения.

После связывания микросфер с вирусными частицами и детектирующими антителами реакционные смеси порциями переносили в лунки планшета MultiScreen HTS BV FilterPlate (MSBVN1210; Millipore, США), мембрана которого имела диаметр пор 1.2 мкм. Планшет помещали в устройство вакуумного фильтрования Bio-Dot® Microfiltration Apparatus (1706545; Bio-Rad, США) и присоединяли к водоструйному насосу для удаления жидкости с несвязавшимися компонентами смеси. Микросферы, собранные в лунках планшета, промывали буфером для разведения, трижды наполняя этим буфером лунки и удаляя его путем фильтрования. При использовании детектирующих антител, модифицированных биотином, антитела добавляли до конечной концентрации 5 мкг/мл. Пробы инкубировали и отмывали так же, как описано выше, после чего микросферы суспендировали в 100 мкл буфера для разведения с добавлением конъюгата SA-PE в концентрации 1 мкг/мл (SA-5207; Vector Laboratories, США) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Далее микросферы промывали, как описано выше, после чего планшет отсоединяли от фильтровальной системы, содержимое экспериментальных лунок суспендировали в 100 мкл буфера для разведения и переносили в пробирки для дальнейшего анализа методом проточной цитофлуориметрии. Анализ проводили на приборе BD Accuri C6 (BD Biosciences, США), имеющем лазеры с длинами волн для возбуждения флуорофоров 488 и 640 нм. Детекцию флуоресцентного сигнала AlexaFluor 488 осуществляли при использовании стандартного оптического фильтра FL-1: 533/30 нм, фикоэритрина (PE) – FL-2: 585/40 нм. Образцы подавали в анализатор при скорости потока 14 мкл/мин. Пул микросфер визуализировали на двумерной гистограмме, созданной на основе измерения прямого и бокового рассеяния. После этого строили графики зависимости содержания вирусных частиц в растворе от среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) при 533/30 нм в случае AlexaFluor 488 и 585/40 нм в случае фикоэритрина. Буфер для разведения без добавления аналита использовали в качестве отрицательного контроля. Согласно вышеописанной методике с использованием детектирующей пары Bt-3, в качестве антитела захвата, конъюгированного с функциональными микросферами (558582, BD), и Bt-28, в качестве детектирующего антитела, были получены данные для калибровочного графика (рис. 3). Проанализировано 10 экспериментальных точек с разведениями с шагом “десять” как в буфере для разведения, так и в сыворотке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан эффективный тест непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител к VP7 вируса блютанга. РНИФ может быть успешно использована для скрининга BTV-инфицированных клеток в вирусной диагностике и фундаментальных исследованиях. Разработан тест на основе флуоресцентных микросфер для количественного определения BTV методом проточной цитометрии с использованием охарактеризованных mAb к VP7 BTV. Детектирующая пара mAb – конъюгированные с флуоресцентными микросферами Bt-3 (антитела захвата) + биотинилированные Bt-28 (антитела детекции) – выявляла вирусные частицы BTV вплоть до концентрации 10^–0.25 ТЦД₅₀/мл, в сыворотке бычьей крови чувствительность определения составила 10^0.75 ТЦД₅₀/мл.

В работе продемонстрировано, что mAb к VP7 BTV могут быть использованы в диагностических методах: сэндвич-ИФА, РНИФ и проточной вирометрии. Показано, что проточный вирометрический анализ BTV на основе флуоресцентных микросфер чувствителен, не требует выделения вируса и позволяет обнаруживать его непосредственно в биологических жидкостях, что дает преимущество для диагностики BTV и быстрого скрининга поголовья сельскохозяйственных животных.