Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 5, стр. 599-605

ВВЕДЕНИЕ

Амплификация нуклеиновых кислот позволяет исследовать ультрамалые количества исходного генетического материала и широко используется в молекулярно-генетических исследованиях, а также в клинической диагностике. Сочетание ПЦР и параллельного множественного анализа продуктов ПЦР стало основным трендом современных высокопроизводительных молекулярно-биологических исследований, в том числе технологии биологических микрочипов (microarray) [1] и секвенирования нового поколения (NGS) [2]. В последнее время интенсивно развивается технология микроанализа ДНК, в которой ПЦР и регистрация результатов ПЦР совмещены в одном микроустройстве [3, 4]. Направление получило название “лаборатория на чипе” (Lab on Chip) [5]. Технология “лаборатории на чипе” рассматривается как одно из основных направлений в развитии мирового тренда – диагностики на месте оказания помощи (Point-of-care Diagnostics) [6]. При реализации данного направления используют разные методические и инструментальные подходы с применением различных полимерных материалов, с последующим направленным изменением свойств поверхности и свойств материалов в результате физического, химического или биологического воздействия. Такие материалы c программируемыми свойствами стали называть “умными” (smart) материалами [7]. Метод получения прочно связанных с полимерной подложкой агарозных ячеек с иммобилизованными олигонуклеотидами, которые способны отщепляться при нагревании и участвовать в амплификации в качестве праймеров, открывает новые возможности для разработки технологий микроанализа нуклеиновых кислот “лаборатория на чипе”.

Цель данной работы – разработка метода получения кросс-сшитых агарозных ячеек, связанных ковалентными связями с полимерной подложкой и содержащих иммобилизованные термоотщепляемые от агарозы олигонуклеотиды, которые после термоотщепления могут участвовать в ПЦР в качестве праймеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе получали карбоксиметилированную агарозу в результате реакции агарозы с хлоруксусной кислотой в щелочных условиях, затем вводили фрагменты метакриловой кислоты с помощью реакции с ангидридом метакриловой кислоты по сохранившимся гидроксильным группам. Последующая обработка бромуксусной кислотой и триэтиламином приводила к образованию связанного с агарозой полигликолевого линкера с концевой карбоксильной группой по методу, описанному в работе Pinkus [8] (схема 1 ). Условия модификации агарозы оптимизировали с контролем степени модификации агарозных звеньев углеводного полимера. Агароза после модификации сохраняет способность к термозависимому фазовому переходу плавления–гелеобразования, а добавление хаотропных реагентов позволяет регулировать температурные границы этих переходов, солюбилизировать агарозу и получать раствор при комнатной температуре.

Схема 1 . Получение карбоксиметилагарозы (II), метакрилкарбоксиметилагарозы (III) и метакрилкарбоксиполигликольагарозы (IV).

Полимерную подложку изготавливали нанесением тонкого слоя раствора циклоолефинового сополимера (ЦОС) на пленочный полиэтилентерефталат (ПЭТ) центрифугированием (spin coating) с последующим высушиванием и “свариванием” при температуре >150°С. Слой ЦОС прочно держится на поверхности ПЭТ, не отслаивается в условиях термоциклической ПЦР.

Раствор солюбилизированной модифицированной агарозы с метиленбисакриламидом и фотоинициатором бензофеноном в виде матрицы микрокапель наносили иглой робота-манипулятора на поверхность полимерной подложки при комнатной температуре (диаметр иглы 100 мкм, шаг 300 мкм). При фотооблучении происходит кросс-сшивание агарозы с образованием плотных ячеек, связанных ковалентными связями с фотоактивной поверхностью подложки. Карбоксильные группы на полигликолевых линкерах при этом сохраняются. Связывание агарозных ячеек с поверхностью ПЭТ, не покрытого ЦОС, не происходит.

После активации карбоксильные группы связывали пептидной связью с красителем NH₂-Cy5, несущим первичную аминогруппу на гексаметиленовом линкере (схема 2 ), или парой олигонуклеотидов, несущих на 5'-конце первичную аминогруппу.

Подложку с агарозными ячейками использовали для изготовления неразборного пленочного чипа. Чип изготавливали сборкой, путем склеивания между собой слоев ПЭТ-пленки. Чип содержит внутреннюю герметичную камеру (высота 200 мкм, объем 25 мкл), в которой находятся агарозные ячейки (рис. 1). Ячейки наносили на подложку перед сборкой чипа. Подачу и удаление рабочих растворов производили через отверстия в крышке, и далее растворы по внутренним каналам поступали в камеру. Нагрев растворов в камере чипа осуществляли через подложку и крышку. Регистрацию флуоресцентных сигналов ячеек выполняли через крышку. ПЭТ не поглощает и не флуоресцирует в оптическом диапазоне флуоресценции красителя Cy5 [9, 10]. При нагревании при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0) молекулы красителя, связанные с агарозными ячейками на терморасщепляемых линкерах, частично отщепляются (схема 2 ). За первые 5 мин степень отщепления составляет 42% (рис. 2 и 3). В контроле молекулы красителя, связанные с карбоксиметилированными агарозными ячейками, без специально получаемого полигликолевого линкера, в тех же условиях отщепляются меньше, степень отщепления составляет 11% (рис. 2 и 3). Олигонуклеотиды, связанные с агарозными ячейками, при нагревании также отщепляются и сохраняют специфические функции.

Схема 2 . Кросс-сшивание и контроль метакрилкарбоксиполигликольагарозы (IV) по термоотщеплению красителя NH₂-Cy5.

Рис. 1.

Схема конструкции пленочного чипа.

Рис. 2.

Изображение чипа с агарозными ячейками с иммобилизованным красителем NH₂-Cy5 в свете флуоресценции красителя (возбуждение 650 нм, регистрация 716 нм), полученное на флуоресцентном анализаторе биочипов. (Т–) – ячейки без термоотщепляемого линкера, (Т+) – ячейки с термоотщепляемыми линкерами до прогрева и после прогрева в течение 5 мин при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0), по два ряда в четырех повторах.

Рис 3.

Средние значения флуоресцентных сигналов агарозных ячеек с иммобилизованным красителем NH₂-Cy5 в свете флуоресценции красителя. (Т–) – ячейки без терморасщепляемого линкера, (Т+) – ячейки с терморасщепляемыми линкерами до и после прогрева в течение 5 мин при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0).

Олигонуклеотиды, отщепившиеся от агарозных ячеек, использовали в качестве праймеров в реакции амплификации участка последовательности 7-го экзона гена ABO человека, который детерминирует серологический фенотип группы крови ABO. Все агарозные ячейки при этом сохранились на своих местах. Результаты ПЦР контролировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием SYBR Green. На электрофореграмме фиксировался продукт ПЦР соответствующей длины – 124 п.н. (рис. 4), что свидетельствует о сохранении специфических функций олигонуклеотидов после процедуры их иммобилизации в агарозных ячейках чипа с последующим термическим отщеплением от агарозного геля. В данном случае агарозный гель ячеек чипа выступает в роли материала с программируемыми свойствами, “умного” (smart) геля – при нагревании от агарозного геля отщепляются иммобилизованные ранее фрагменты ДНК и участвуют в ПЦР в качестве праймеров.

Рис. 4.

Электрофореграмма продуктов амплификации 7-го экзона гена ABO человека в 2%-ном агарозном геле, окрашенном SYBR Green. Длина целевого продукта – 124 п.н; 1 – Маркер длин фрагментов ДНК (pUC19/Msp I; Sileks, Россия); 2 – продукт ПЦР, полученный в камере чипа с ячейками, содержащими праймеры на терморасщепляемых линкерах; 3 – продукты ПЦР, полученные в камере чипа с ячейками, которые не активировали; 4 – продукты ПЦР, полученные в камере чипа в присутствии праймеров в растворе (положительный контроль); 5 – продукты ПЦР, полученные в камере чипа с праймерами, которые термически не отщепляются; 6 – продукты ПЦР, полученные в камере чипа без добавления матрицы (отрицательный контроль); 7 – продукты ПЦР, полученные в камере чипа без добавления ДНК-полимеразы (отрицательный контроль).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование. Использовали образцы бесцветной пленки кристаллического полиэтилентерефталата ПЭТ Э (ГОСТ 24234-80, плотность 1.39 г/см³, молекулярная масса 20 000–40 000, размер 25 × 75 мм, толщина 200 мкм); циклоолефиновый сополимер COC Topas 5013L-10 (Ticona GmbH, Германия); агарозу 162-0102 (Bio-Rad, США), а также геномную ДНК человека (здорового донора) из коллекции Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (Москва). В реакции амплификации использовали праймеры: прямой AB_F1 NH₂-GTC CGT GGA CGT GGA CAT G и обратный AB_R NH₂-CCG GCC CTC GTA GGT GAA, сконструированные с помощью сетевого ресурса Primer-Blast (www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Была использована последовательность 7-го экзона гена ABO человека (GenBank: NM_020469.3).

Флуоресцентные сигналы регистрировали на специализированном флуоресцентном анализаторе биочипов [11] разработки ИМБ РАН (Россия) при длине волны возбуждения, соответствующей Cy5 (650 нм), и запирающем фильтре 716 нм.

Карбоксиметилагароза. Агарозу (20 мг, 65.8 мкм мономерных звеньев) в смеси с i-PrOH (300 мкл) и 4 M NaOH (100 мкл) суспендировали на встряхивателе Vortex Genie 2T (Scientific Industries, США) в течение 1 ч при комнатной температуре, добавляли раствор хлоруксусной кислоты (6.2 мг, 65.8 мкм) в i-PrOH (100 мкл), прогревали при 60°С 15 мин при перемешивании на термошейкере TS-100C (Biosan, Латвия). Охлаждали до комнатной температуры, нейтрализовали ледяной уксусной кислотой, промывали 0.1 М HCl, далее последовательно промывали 50, 75 и 87.5%-ным раствором i-PrOH в воде и 100%-ным i‑PrOH, сушили в вакууме.

Метакрилаткарбоксиметилагароза. К раствору полученной карбоксиметилагарозы в DMF (500 мкл) при 4°С и перемешивании добавляли DIPEA (1.39 мкл, 8 мкм) и метакриловый ангидрид (1.23 мкл, 8.2 мкм). Смесь перемешивали 3 ч при 4°С и дополнительно 3 ч при 25°С. Продукт осаждали ацетоном, промывали 96%-ным EtOH, сушили в вакууме.

Метакрилатполигликолькарбоксиметилагароза. К раствору полученной метакрилаткарбоксиметилагарозы в DMF (500 мкл) при перемешивании добавляли Et₃N (10 мкл), через 30 мин добавляли бромуксусную кислоту (15 мг, 108.6 мкм), Et₃N (5 мкл) и дополнительно перемешивали 1 ч при 25°С. Продукт осаждали и многократно промывали 50%-ным EtOH, промывали последовательно 50, 75 и 87.5%-ным раствором EtOH в воде и 96%-ным EtOH, высушивали в вакууме.

Матрица ячеек кросс-сшитой модифицированной агарозы. К полученной метакрилатполигликолькарбоксиметилагарозе добавляли раствор бензофенона (2.5 мг, 0.35 мкм) и N,N'-метиленбисакриламида (5 мг, 32.4 мкм) в ДМФА (250 мкл), перемешивали 20 мин, добавляли воду (250 мкл), перемешивали. Полученный раствор модифицированной агарозы использовали для капельного нанесения иглой робота-манипулятора (QArray, Genetix, Англия) на подготовленную полимерную подложку. Подложку с матрицей агарозных капель охлаждали при –18°С в течение 30 мин, раствор при этом переходит в состояние геля. Подложку с ячейками облучали УФ-светом с помощью осветителя люминесцентного ОИ-18А с кварцевой ртутной лампой сверхвысокого давления ДРК-120 в течение 12 мин, затем многократно промывали смесью диоксан/ДМФА (1 : 1).

Активация карбоксильных групп в агарозных ячейках. Над ячейками на подложке формировали разборную камеру объемом 25 мкл. В камеру вносили 0.1 М раствор активатора TSTU и 0.1 М раствор диизопропилэтиламина (DIPEA) в 25 мкл смеси диоксан/ДМФА (1 : 1), инкубировали 1 ч при комнатной температуре, раствор удаляли, промывали смесью диоксан/ДМФА (1 : 1).

Иммобилизация красителя и олигонуклеотидов. В камеру вносили 25 мкл раствора красителя NH₂-Cy5 или пары олигонуклеотидов AB_F1 и AB_R, каждый в концентрации 1 мкМ в 0.1 М карбонатном буфере (рН 9.2), инкубировали при 4°С в течение ночи, удаляли раствор, многократно промывали 30%-ным ацетонитрилом в 0.1 М триэтиламмонийацетатном (ТЕАА) буфере (рН 7.0).

Отщепление красителя от агарозных ячеек. Подложку с агарозными ячейками, в которых иммобилизован краситель Cy5, использовали для изготовления неразборного пленочного чипа. Через отверстие в крышке в камеру подавали ТЕ-буфер (рН 8.0), прогревали при 95°С. Флуоресцентные сигналы ячеек до и после прогрева регистрировали через крышку и слой жидкости при комнатной температуре на специализированном анализаторе биочипов [9] разработки ИМБ РАН (Россия) при длине волны возбуждения, соответствующей Cy5 (650 нм), и запирающем фильтре 716 нм (рис. 2).

ПЦР с олигонуклеотидами, отщепившимися от агарозных ячеек. Для изготовления пленочного чипа использовали подложку с иммобилизованными в агарозных ячейках олигонуклеотидами. Камеру чипа через отверстия в крышке заполняли реакционной смесью (30 мкл), которая содержала 1.5 ед. Taq-полимеразы (Thermo Scientific, США) в буфере той же фирмы, dNTP в концентрации 400 мкМ каждого и геномную ДНК человека в количестве 10 нг в качестве матрицы.

Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе TGradient (Biometra, США) для in situ ПЦР при следующих условиях: 95°C – 3 мин (начальная денатурация); 36 циклов: 95°C – 20 с, 60°C – 30 с, 72°C – 40 с; далее 72°C – 5 мин (завершающая инкубация). Реакционную смесь через отверстия в крышке извлекали из чипа, упаривали в вакууме досуха, растворяли в минимальном объеме деионизированной H₂O и анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием SYBR Green.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработаны методы изготовления полимерной подложки с фотоактивной поверхностью и введения в природный полимер, агарозу, химических групп, придающих агарозе новые дополнительные свойства, с сохранением способности к термозависимому фазовому переходу плавления–гелеобразования. Добавление хаотропных реагентов позволяет солюбилизировать агарозу и получать раствор при комнатной температуре. Модифицированная агароза прибрела способность при УФ-облучении образовывать термически стойкие ячейки, прочно связываться с подложкой, ковалентно связывать олигонуклеотиды, которые могут быть отщеплены от агарозы по команде, подаваемой путем нагрева. Модификация агарозы позволяет получить “умный” гель, который выполняет подаваемую с помощью нагрева команду и отщепляет присоединенные к гелю целевые фрагменты ДНК с сохранением их функциональных свойств – они могут использоваться в ПЦР в качестве праймеров.

Разработанные методы решают часть задач, необходимых для реализации технологии изготовления матрицы закрепленных на подложке агарозных ячеек – микрореакторов, предназначенных для проведения в каждой ячейке термоциклической ПЦР с общей анализируемой смесью ДНК по единому термоциклу, но с различными парами праймеров в каждой ячейке, с изоляцией ячеек от внешней среды, исключением массообмена между ячейками при термоциклировании и одновременным микроскопическим контролем результатов.

Найденные решения могут быть использованы при разработке технологии параллельного множественного микроанализа образцов ДНК для выявления соматических и инфекционных заболеваний человека.