Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 2, стр. 137-146

ВВЕДЕНИЕ

Функции эритроцитов не исчерпываются их способностью переносить кислород из легких к тканям, эти клетки участвуют в тромбообразовании, регуляции кислотно-основного баланса, в иммунных реакциях, в связывании и переносе разнообразных веществ. Красные клетки крови вовлечены в патологические процессы при болезнях разного генеза, при этом наблюдаются серьезные изменения их структуры и функции [1, 2]. Мембрана эритроцитов, с одной стороны, достаточно стабильна, что позволяет красным клеткам крови сохранять свою целостность в условиях высокого давления и турбулентных токов в крупных сосудах, а с другой, способна обратимо менять свой размер в сосудах микроциркуляторного русла. Эти свойства эритроцитов зависят от взаимодействия белков в мембране. Регуляция связей между белками мембраны осуществляется за счет разных механизмов, в том числе путем фосфорилирования/дефосфорилирования, при этом основными мишенями считаются белки полос 3, 4.1, 4.9, спектрин, анкирин и аддуцин [3].

Опубликованные данные подтверждают мнение о том, что фосфорилирование/дефосфорилирование белков мембраны и цитоскелета эритроцитов способствует изменению пластичности и стабильности мембраны, и это отражается на микрореологическом поведении клеток в целом [4, 5]. В частности, гликилирование мембранных белков эритроцитов (подтвержденное высоким уровнем гликилированного гемоглобина) при метаболическом синдроме связано с увеличением количества деформированных эритроцитов, а также сопровождается появлением эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов [6]. Изучение изменений основных структурных мембранных белков показало, что при гипертонической болезни (артериальной гипертензии) независимо от тяжести заболевания снижаются уровни анкирина и спектрина [7].

Нами исследованы особенности изменения содержания периферических и интегральных белков мембраны эритроцитов и характер множественной связи между изученными белками у больных артериальной гипертензией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании принимали участие больные эссенциальной артериальной гипертензией (АГ) I–II степени (n = 51) мужчины, средний возраст которых составил 42 ± 1.5 лет, и клинически здоровые доноры (n = 29), средний возраст которых составил 36 ± 1.6 лет.

Диагноз АГ устанавливали по данным анамнеза и клинико-инструментального обследования. Дифференциальную диагностику для исключения симптоматической АГ проводили в соответствии с рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК, 2004, 2008).

Критериями исключения было наличие хронической сердечной недостаточности выше III–IV стадии по классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA), острый инфаркт миокарда или нарушение мозгового кровообращения в предшествующие 6 месяцев, нарушения ритма сердца, обострение интеркуррентных заболеваний. У больных АГ особое внимание обращали на отсутствие приступов стенокардии напряжения, хронические заболевания почек, печени и легких.

Оценивали получаемую больными АГ медикаментозную терапию и при необходимости проводили ее коррекцию с соответствующими рекомендациями. На момент включения в исследование пациенты не получали гипохолестеринемической терапии.

Все пациенты были ознакомлены с целями и протоколами исследования. Письменное соглашение было обязательным критерием включения в исследование.

Показатель сферичности эритроцитов (ПСЭ) определяли по общепринятой формуле:

где D – средний диаметр эритроцитов (7.35 мкм), Т – средняя толщина эритроцитов, V – средний объем эритроцитов и S – средняя площадь основания эритроцитов. Диаметр эритроцитов (D) определяли как полусумму максимальной длины и ширины эритроцитов, измеренных с помощью гематологического анализатора XT-4000i (Sysmex, Япония). Толщину эритроцита (Т) определяли, деля его объем на площадь основания (S), измеренные с использованием программы гематологического анализатора (T = MCV/S).

В норме ПСЭ составляет 3.4–3.9. Показатель ниже 3.4 означал наличие пула сфероцитарных, шаровидных клеток, выше 3.9 – развитие планоцитоза или приближение формы эритроцитов к плоскому диску.

Кровь для исследования набирали в пробирку с гепарином. Затем осаждали эритроцитарную массу, отмывая ее 3 раза от сыворотки. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали осмотическим шоком по методу Dodge [8]. Гемолиз эритроцитов и отмывку “теней” проводили 3 раза в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7.4). По окончании гемолиза “тени” эритроцитов осаждали центрифугированием при 20 000g. Конечный осадок мембран ресуспендировали в изотоническом 155 мМ растворе NaCl в соотношении 1 : 1 и хранили при температуре не выше 4°С.

Все операции по выделению и очистке водорастворимой фракции белков проводили на центрифугах Allegra^tm 64R (Beckman Coulter, Англия) с охлаждением (–5°С). Замороженные в жидком азоте мембраны гомогенизировали с добавлением фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в 0.1 М Трис-HCl-буфере с 0.1% додецилсульфатом натрия (SDS) (pH 7.6). Полученный экстракт центрифугировали при 17 000g. Суммарный белок осаждали четырехкратным объемом ацетона, промывали двукратным объемом охлажденного ацетона и растворяли в 0.5 М Tрис-HCl-буфере pH 6.8, содержащем 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия (EDТА), 0.001% бромфеноловый синий, 2.3% SDS (Sigma, США), 20% глицерин, 0.1 М 2-меркаптоэтанол (Merck, Германия). Концентрацию белка определяли с использованием набора Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen, США) на приборе Qubit согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Электрофорез проводили по методу Лэммли [9] в полиакриламидном геле (ПААГ) с концентрацией разделяющего геля 7.5 и 15% в присутствии SDS с использованием аппаратуры и реактивов фирмы Bio-Rad. Использовали Трис-глициновый буфер рН 8.3 (0.025 М Трис и 0.192 М глицин). На дорожки наносили по 10 мкг суммарного белка. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 (Sigma, США). Молекулярную массу белков определяли с использованием набора маркеров фирмы Bio-Rad (#161-0363).

В результате анализа 255 электрофореграмм (7.5 и 15% ПААГ) оценили содержание (мкг/мг общего белка) 10 мембранных белков эритроцитов: α-спектрина, β-спектрина, анкирина, анион-транспортного белка (АТБ), белков полосы 4.1, транспортера глюкозы, актина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (Г-3-ФДГ), тропомиозина и глутатион-S-трансферазы.

Содержание белков в каждой полосе определяли по интенсивности окраски Кумасси R-250, с использованием компьютерной программы [10, 11].

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ “Statistica 6.0”. Осуществляли проверку на нормальность распределения каждой переменной. В зависимости от характера распределения данные в сравниваемых группах анализировали либо с помощью t-теста, либо непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Кроме того, характер взаимосвязей переменных исследовали с использованием многомерных методов дискриминантного, канонического и регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ средних данных, полученных у больных АГ и здоровых лиц, выявил существенное различие в количестве ряда мембранных белков эритроцитов (табл. 1). Так, у больных АГ уровни α-спектрина, β-спектрина и АТБ были значимо ниже, чем в контрольной группе. В тоже время уровни белков полосы 4.1, Г-3-ФДГ и глутатион -S-трансферазы в мембране больных АГ были выше. Изменение количества белковых компонентов мембраны красных кровяных клеток может играть важную роль в патогенезе АГ. Известно, что наследственные мутации, связанные с изменением структуры спектринов и АТБ и вызывающие дефицит этих белков, могут приводить к появлению патологических форм эритроцитов [12, 13]. По-видимому, у больных АГ низкий уровень спектринов и АТБ может носить приобретенный характер и приводить к выходу в кровоток измененных эритроцитов. Относительное увеличение количества мембранных белков Г-3-ФДГ и глутатион-S-трансферазы эритроцитов связано, вероятно, с компенсаторными реакциями в ответ на системную гипоксию. C одной стороны, происходит усиление гликолитических процессов в клетке и активация антиоксидантной защиты, а с другой, повышение уровня белков полосы 4.1 приводит к ускорению полимеризации актина [14].

Для определения белков, оказывающих максимальное влияние на структурно-функциональное состояние мембраны эритроцитов обеих групп, был использован дискриминантный анализ. Выяснилось, что такими белками были: анкирин (белок полосы 2.1), АТБ (белок полосы 3), белки полосы 4.1, Г-3-ФДГ (белок полосы 6) и глутатион-S-трансфераза (белок полосы 8) (табл. 2), а каноническое уравнение для исследуемых групп имело следующий вид:

где БП – белок полосы; К – коэффициент дискриминантной функции.

На рис. 1 видно, что концентрации вышеперечисленных белков являются параметрами, разделяющими группы здоровых лиц и больных в 100% случаев (D ² = 55.5, p = 0.0000). При этом АТБ обеспечивал наибольший дискриминантный эффект – стандартизированный коэффициент = 2.306 (см. табл. 2). Важно отметить, что уровень спектринов в целом не влиял существенно на дискриминацию исследуемых групп.

Для нахождения меры корреляционной связи между белками, которые участвовали в дискриминации групп здоровых лиц и больных ГБ, и остальными белками мембраны эритроцитов (не вносящими вклад в дискриминацию) использовали канонический анализ.

Анализ канонической корреляции между двумя множествами белков: анкирином, АТБ, белком полосы 4.1, Г-3-ФДГ, глутатион-S-трансферазой, с одной стороны, и α-спектрином, β-спектрином, транспортером глюкозы, актином, тропомиозином, с другой, позволил установить определенный характер взаимосвязи между ними как у лиц контрольной группы, так и у больных АГ. Так, приведенные в табл. 3 данные, полученные у лиц контрольной группы, показывают, что между двумя списками переменных существует сильная зависимость (по первому корню – R = 0.96, а по второму – R = 0.80). При этом наибольший вклад в эту зависимость вносили АТБ и актин (по 1-му корню) и Г-3-ФДГ и тропомиозин (по 2-му корню), поскольку вес этих переменных в каждом из множеств имел наибольшее значение.

В то же время анализ канонической корреляции между описанными выше белками у больных АГ выявил лишь одно принципиальное различие. В отличие от контрольной группы наибольший вклад в эту зависимость по 1-му корню вносили не АТБ и актин, а АТБ и транспортер глюкозы (табл. 4). Диаграммы рассеяния канонических переменных у лиц контрольной группы и больных АГ показаны на рис. 2. При этом статистически значимыми были два корня канонической корреляции. На диаграммах отчетливо видно отсутствие выраженных отклонений от воображаемой линии регрессии, следовательно, не выявлено нарушений основных допущений канонического анализа.

Данные канонической корреляции были проверены с помощью регрессионного анализа, который использовали для изучения предикторных свойств изучаемых мембранных белков эритроцитов, связанных АТБ и Г-3-ФДГ. Для выполнения условий применимости метода признаки, не удовлетворяющие условиям нормального распределения и отмеченные в контрольной группе, были математически преобразованы. Результаты этого анализа представлены в табл. 5. Выяснилось, что у лиц контрольной группы уровни АТБ и Г-3-ФДГ были связаны с изменением количества актина, причем АТБ это касалось в большей степени (R² = 0.83), чем Г-3-ФДГ (R² = 0.58). Объяснить данный факт помогут специальные исследования как белкового, так и липидного спектра у лиц контрольной группы, а также значительное увеличение исследуемой выборки.

У больных АГ выявлена тесная регрессионная связь не только АТБ, но и белка Г-3-ФДГ с уровнем белка-переносчика глюкозы. Остальные же мембранные белки играли значительно меньшую роль в изменении содержания АТБ и Г-3-ФДГ о чем свидетельствуют частные коэффициенты детерминации.

Очевидно, что такая перестройка в мембране эритроцитов больных АГ обусловлена либо относительной недостаточностью синтеза белка-переносчика глюкозы в процессе кроветворения, либо его дисфункцией, связанной с действием патогенных факторов эндогенного происхождения.

Изменения структурно-функционального состояния мембранных белков эритроцитов нередко приводят к образованию шаровидных или сфероцитарных клеток, что, несомненно, ухудшает их деформируемость и текучесть мембран. Учитывая данное обстоятельство, в каждой из изучаемых групп была проведена табуляция по показателю сферичности эритроцитов (ПСЭ). В норме ПСЭ составляет 3.4–3.9. Показатель ниже 3.4 означает наличие пула сфероцитарных или шаровидных клеток.

Как видно из рис. 3, у подавляющего числа лиц контрольной группы отмечался нормальный ПСЭ (79%), в то время как такого рода ПСЭ встречался лишь у 57% больных АГ (p = 0.036, точный критерий Фишера). У остальных 43% больных данный показатель был ниже 3.4 усл. ед., т.е. наблюдалась склонность к развитию сфероцитоза.

Чтобы выяснить, какие белки наиболее существенно влияют на развитие сфероцитоза, мы провели анализ множественной регрессии у больных АГ и лиц контрольной группы. В контрольной группе мы не определили адекватной регрессионной модели, связанной с отклонением ПСЭ, в то время как подобная регрессионная связь ПСЭ с белками эритроцитов выявлена у больных АГ (табл. 6). Из полученной модели множественной регрессии следует, что основными предикторами отклонения ПСЭ были такие мембранные белки, как β-спектрин, АТБ, тропомиозин и Г-3-ФДГ. Поскольку взаимосвязь переменных ПСЭ и Г-3-ФД носила нелинейный характер, то переменная Г-3-ФДГ подвергалась математическому преобразованию, чтобы использовать регрессионную модель как линейную.

Из представленного на рис. 4 графика видно, что низкий уровень β-спектрина, тропомиозина и Г-3-ФДГ может приводить к снижению ПСЭ и, следовательно, развитию сфероцитоза. Расчеты показали, что если у больных АГ величина β-спектрина, тропомиозина, Г-3-ФДГ будет ниже их среднего уровня более чем на 23, 13.3, 26% соответственно, а АТБ выше на 14.5%, то вероятность развития сфероцитоза у таких больных возрастет скорее всего до 70% и более, поскольку при данных уровнях мембранных белков значения ПСЭ будут менее 3.38 усл. ед.

Полученные нами результаты подтверждаются опубликованными данными. Как уже сказано, генетически обусловленный дефицит β-спектрина приводит к развитию наследственного сфероцитоза. Предполагается, что тропомиозин, локализуясь на коротких актиновых филаментах, может регулировать длину и стабильность актиновых филаментов [15]. Также показано, что тропомиозин способствует усилению актиновых филаментов, делая их более устойчивыми к деполимеризации и фрагментации [16]. Поэтому мы предполагаем, что снижение количества тропомиозина будет негативно влиять на устойчивость актиновых филаментов, что особенно важно в условиях прохождения эритроцитов через капиллярное русло. Недостаток мембранного белка Г-3-ФДГ может быть связан, по всей видимости, с недостатком поступления в эритроциты глюкозы из-за относительной несостоятельности транспортеров данного субстрата. При этом следует отметить, что повышение пула сфероцитарных клеток при увеличении уровня АТБ в модельном плане, возможно, обусловлено высоким сродством этого белка к холестерину [17]. Поскольку у больных АГ изменяется и липидный состав мембраны, она становится менее текучей и более жесткой. Повышенный уровень данного белка может приводить к образованию агрегатов, вследствие чего нарушается взаимодействие с ферментными системами клетки [18, 19]. Кроме того, не исключено, что повышение уровня АТБ может быть обусловлено компенсаторной реакцией на гипоксию и связанный с ней ацидоз. Тем не менее наши предложения требуют специальных исследований.

Таким образом, вся совокупность полученных данных свидетельствует о значительной структурно-функциональной перестройке мембраны эритроцитов у больных АГ. Она заключалась прежде всего в снижении уровня как структурных, так и интегральных белков и ферментов, взаимодействие и функция которых, возможно, нарушались из-за недостатка их энергетического обеспечения в результате уменьшения образования АТР, необходимого для формирования адекватного комплекса цитоскелета эритроцитов. Это подтверждается преобладанием сфероцитарных клеток в крови больных АГ. Кроме того, установлено, что у больных АГ установлено наличие множественной корреляции между показателем сфероцитарности и белковым профилем эритроцита.