Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 3, стр. 184-191

ВВЕДЕНИЕ

Клеточные мембраны крайне латерально неоднородны. Различными методами установлено, что в них существуют липид-белковые домены, или кластеры, состав которых значительно отличается от среднего состава клеточной мембраны. Такие домены, обогащенные сфингомиелином, иногда называются “рафтами” [1]. По-видимому, они играют существенную роль в передаче клеточных сигналов [2–4], апоптозе [5–7], эндоцитозе [1] и т.д. В настоящее время имеются довольно противоречивые сведения о характерном времени жизни таких доменов, их локализации с различными белками, а также липидном составе [8–12]. Трудность изучения доменов in vivo связана с их чрезвычайно малым размером (<200 нм) [9, 11], меньшим дифракционного предела видимого света. Это приводит к тому, что практически все экспериментальные данные о свойствах доменов в клеточных мембранах являются в большей или меньшей степени косвенными. В искусственных мембранах, содержащих основные липидные компоненты внешнего монослоя плазматической мембраны, при понижении температуры могут быть сформированы липидные домены микронных размеров [12–15]. Эти домены используются в качестве модели доменов клеточных мембран. В таких модельных системах было установлено, что липиды в доменах находятся в жидко-упорядоченном (L_o) состоянии, притом, что окружающая мембрана жидко-неупорядоченная (L_d).

В бислойных системах упорядоченные домены в противоположных монослоях практически всегда располагаются один над другим [12–15]. О природе сил, ответственных за сопряжение монослойных доменов в бислойные структуры, имеется несколько гипотез. В работах [16, 17] предполагалось, что сопряжение происходит за счет трансбислойной димеризации холестерина. Однако в более поздних работах показано, что жидко-упорядоченные домены необязательно обогащены холестерином по сравнению с окружающей мембраной [10, 11], и его трансбислойная димеризация не может приводить к сопряжению доменов. Высказывались предположения, что в клеточных мембранах сопряжение доменов может быть связано с наличием трансмембранных белков, но это не объясняет бислойность доменов в модельных мембранах, не содержащих белки. В подавляющем большинстве работ эффективное трансбислойное отталкивание жидко-упорядоченной и жидко-неупорядоченной фаз просто постулируется без указания его физических причин [18, 19].

Недавно нами был предложен возможный механизм сопряжения монослойных доменов, связанный с так называемым гидрофобным несоответствием [20, 21]. Экспериментально показано, что толщина бислоя L_o-фазы на 0.5–2 нм превосходит толщину L_d мембраны [22, 23]. Если бы сосуществующие фазы мембраны оставались плоскими и однородными вплоть до их границы, на границе был бы скачок толщины бислоя амплитудой 0.5–2 нм, обладающий высокой энергией вследствие неизбежного экспонирования гидрофобной части мембраны в воду. Предполагается, что на межфазной границе возникают упругие деформации, направленные на сглаживание такого скачка толщины. Показано, что энергия деформаций минимальна, если домены находятся не точно один над другим, а их границы сдвинуты друг относительно друга на несколько нанометров [20, 21]. Такой равновесный сдвиг границ трудно наблюдать экспериментально, однако возможность его существования продемонстрирована в ряде работ методами молекулярной динамики [24–26]. При этом удаление границ монослойных доменов на большие расстояния друг от друга энергетически невыгодно. Таким образом, упругие деформации мембраны вблизи границы монослойных доменов могут обеспечивать их сопряжение в бислойную структуру с точностью до небольшого относительного сдвига границ.

В серии работ [18, 19] показано, что за счет сложной пространственной организации фаз L_o и L_d можно добиться того, что на большей части площади мембраны “симметричная” бислойная конфигурация L_o-фазы будет менее энергетически выгодна, чем “антисимметричная” конфигурация, в которой бислой состоит из монослоя L_o-фазы и монослоя L_d-фазы. Согласно нашим оценкам, при физически разумных значениях параметров системы это может происходить в диапазоне площади L_o-фазы от 47 до 53% от общей площади мембраны [27]. В то же время, насколько нам известно, экспериментально наблюдаемые домены L_o-фазы бислойны во всем диапазоне их относительных площадей. Переход в “антисимметричную” конфигурацию связан с масштабными перестройками мембраны и, в принципе, может быть затруднен кинетически. Однако критерий термодинамической стабильности при любой доли площади мембраны, занимаемой L_o-фазой, предполагает наличие альтернативного механизма сопряжения, не связанного с гидрофобным несоответствием монослоев L_o- и L_d-фаз на границе доменов.

В настоящей работе предложен механизм сопряжения монослойных доменов, основанный на различии упругих свойств L_o- и L_d-фаз, а именно, на различии их модулей изгиба. В ряде работ экспериментально установлено, что изгибная жесткость L_o-фазы в 2–5 раз превосходит изгибную жесткость L_d-фазы [28, 29]. Это означает, что изгибные тепловые флуктуации формы мембраны будут подавлены в области L_o-фазы. Стремление системы максимизировать площадь, доступную флуктуациям, должно приводить к совмещению монослойных доменов L_o-фазы, расположенных в разных монослоях, в бислойную структуру. Предлагаемая модель основана на простых физических принципах и не ограничена особенностями структуры границы упорядоченных доменов.

Ранее мы рассмотрели такой механизм сопряжения упорядоченных монослойных доменов в симметричной по липидному составу мембране, в которой физические свойства упорядоченных доменов одинаковы в обоих монослоях [30]. Однако два монослоя биологических мембран, как правило, имеют различный липидный состав [31]. В частности, наружный монослой плазматической мембраны обогащен сфингомиелином, в нем преобладают фосфолипиды с насыщенными углеводородными цепями. Во внутреннем монослое больше липидов с ненасыщенными углеводородными цепями и отрицательно заряженных липидов [31]. Соответственно, предположение об одинаковости свойств упорядоченных доменов, расположенных в различных монослоях биологических мембран, по-видимому, не выполняется. В настоящей работе мы обобщили разработанную ранее модель на случай асимметричной по липидному составу мембраны.

ПОСТАНОВКА И РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

Рассмотрим асимметричную по составу мембрану общей площади S₀, каждый монослой которой содержит N_R доменов приблизительно одинаковой площади s_R каждый, так что при трансбислойном совмещении монослойных доменов в мембране может образоваться всего N_R бислойных доменов. Площадь L_o-фазы в каждом монослое равна S_0R = N_Rs_R; предполагается, что S_0R меньше, чем половина общей площади мембраны S₀, т.е. S_0R < S₀/2. Это условие важно лишь для простоты математических выкладок, однако расчеты легко обобщаются и на обратный случай. Площадь L_d-фазы в каждом монослое, соответственно, равна S_0S = S₀ – N_Rs_R. Пусть часть монослойных L_o-доменов перекрывается с L_d-фазой в противоположном монослое. Обозначим количество таких перекрытий N_int, среднюю площадь каждого перекрытия – s_int. Таким образом, общая площадь всех перекрывающихся участков L_o/L_d равна S_int = N_ints_int (рис. 1). Мы будем рассматривать мембрану в приближении Хельфриха [32], согласно которому мембрана считается бесконечно тонкой пленкой, характеризующейся модулем изгиба и не имеющей внутренней структуры. Асимметрия липидного состава мембраны по монослоям моделируется различными упругими характеристиками монослоев: модули изгиба L_o-фазы в верхнем и нижнем монослоях обозначим B_1R и B_2R соответственно; модули изгиба верхнего и нижнего монослоев L_d-фазы обозначим B_1S и B_2S. В рамках приближения Хельфриха модуль изгиба бислоя равен сумме модулей изгиба составляющих его монослоев. Таким образом, в рассматриваемой мембране имеются участки со следующими модулями упругости (рис. 1): 1) 2B_R = = B_1R + B_2R в области совмещенных монослойных доменов L_o-фазы (площадь такой области S_R = = S_0R – S_int/2); 2) 2B_s = B_1S + B_2S в области совмещенных монослоев L_d-фазы (площадь этой области S_S = S₀ – S_0R – S_int/2); 3) 2B_1int = B_1R + B_2S в области, где бислой состоит из верхнего монослоя L_o-фазы и нижнего монослоя L_d-фазы (площадь области S_int/2); 4) 2B_2int = B_2R + B_1S в области, где бислой состоит из нижнего монослоя L_o-фазы и верхнего монослоя L_d-фазы (площадь области S_int/2). Для общности введем также феноменологическое взаимодействие между монослоями L_o- и L_d-фаз, L_o и L_o, L_d и L_d в составе бислоя.

Введем декартову систему координат так, чтобы в основном состоянии мембрана совпадала с плоскостью xy (z = 0). Форма возмущенной мембраны описывается функцией u(x, y) – отклонением формы мембраны от основного состояния. В приближении Хельфриха деформации считаются малыми [32], хотя для липидных мембран линейная теория упругости хорошо работает и при больших деформациях [33–38]. Полная энергия системы с точностью до слагаемых второго порядка по деформациям запишется следующим образом:

где Δ – оператор Лапласа, W_int – эффективная поверхностная плотность энергии взаимодействия монослоев L_o- и L_d-фаз, которая играет роль внешнего “поля”. Отрицательное значение этой плотности энергии означает отталкивание L_o- и L_d-фаз в противоположных монослоях. В первом слагаемом идет интегрирование по области бислойной L_o-фазы; во втором слагаемом – по области бислойной L_d-фазы; в третьем и четвертом слагаемых – по областям перекрытия монослоев L_o- и L_d-фаз. Здесь и далее мы будем рассматривать только макроскопические домены. В этом приближении можно пренебречь вкладами в энергию, возникающими от границ доменов, и вычислить каждый вклад (каждое слагаемое) в плотности энергии (1) в предположении бесконечно большого домена независимо от других вкладов.

Разложим функцию отклонения формы мембраны от плоского состояния u(r) в ряд Фурье по координатам x и y: $u({\mathbf{r}}) = \frac{{{{h}^{2}}}}{{\sqrt S }}\sum\limits_{}^{} {\left( {{{u}_{{nm}}}} \right){{e}^{{ - i{{{\mathbf{q}}}_{{nm}}}{\mathbf{r}}}}}} $, где h – некоторый пространственный масштаб; q_mn – вектор с координатами $\left( {\frac{{2\pi n}}{{{{L}_{x}}}},\frac{{2\pi m}}{{{{L}_{y}}}}} \right)$; L_x, L_y – размер рассматриваемой области мембраны по направлениям x и y соответственно; S = L_xL_y – площадь рассматриваемой области, а сумма берется по всем векторам q_mn, таким, что $\left| {{{q}_{{nm}}}} \right| < {{q}_{{UV}}} = \frac{\pi }{a}$, где a – характерный размер, определяющий ультрафиолетовый предел волновых векторов, т.е. задающий максимально возможный волновой вектор, при котором еще можно использовать для мембраны модель сплошной среды. В используемых приближениях функционал деформационной энергии рассматриваемой области в представлении Фурье запишется в следующем виде:

где q_n = $\frac{{2\pi n}}{{{{L}_{x}}}}$, q_m = $\frac{{2\pi m}}{{{{L}_{y}}}}$; здесь и ниже B = B_S, B_R, B_1int, B_2int. Во втором равенстве учтено, что функция u(x, y) – вещественная. Для нахождения полной площади перекрытия L_o- и L_d-фаз необходимо вычислить среднее по всем возможным формам поверхности мембраны и площадям перекрытия фаз: где k_B – константа Больцмана; T – абсолютная температура. Обозначим функциональный интеграл по всем возможным формам мембраны через Z_def = $\int\limits_{}^{} {{{e}^{{ - W/{{k}_{{\text{B}}}}T}}}Du({\mathbf{r}})} $. Интеграл по всем возможным формам мембраны можно выразить через произведение интегралов по действительным и мнимым частям коэффициентов разложения смещения u_nm в ряд Фурье, предварительно перейдя к безразмерному смещению для удобства вычислений. Интегрирование нужно производить лишь по половине переменных u_nm, поскольку смещение u(x, y) вещественно:

Двойное произведение можно вычислить, взяв от него логарифм, перейдя от произведения под логарифмом к суммированию соответствующих логарифмов, и затем от суммирования к интегрированию. Проделав это, получим эффективную свободную энергию флуктуаций мембраны:

Заметим, что параметр a имеет порядок латерального размера липидной молекулы, и a² пропорционально средней площади молекулы липида в соответствующей области мембраны. Поэтому мы будем различать этот параметр в различных областях мембраны, обозначая его соответствующими индексами. Закон сохранения полного числа частиц (липидных молекул) накладывает следующее ограничение:

Для простоты записей введем некоторый средний характерный латеральный размер липидный молекулы a₀ и будем считать, что a_1int = a_2int = a_int. Перенормируем модули упругости следующим образом: $\tilde {B} = {{k}_{{\text{B}}}}T{{\left( {\frac{{2{{\pi }^{3}}}}{{{{e}^{2}}}}\frac{{{{h}^{4}}}}{{{{a}^{4}}}}\frac{B}{{{{k}_{{\text{B}}}}T}}} \right)}^{{\frac{{\pi a_{0}^{2}}}{{8{{a}^{2}}}}}}}$ для каждой из областей. Выражение (5) позволяет записать энергию системы W_total в виде:

Параметр α не входит в итоговое выражение для площади перекрытия монослоев L_o- и L_d-фаз S_int, поэтому здесь в явном виде не приводится. Уравнение (7) позволяет вычислить среднюю площадь перекрытия монослоев L_o- и L_d-фаз в явном виде.

Поскольку рассматриваются только макроскопические домены, то площадь домена, отнесенная к латеральной площади одной молекулы липида, является большой величиной, т.е. $\min \left\{ {{{S}_{{0R}}},{{S}_{{0R}}}} \right\}/{{a}^{2}} \gg 1$, и выражение (8) можно переписать в следующем виде:

т.е. при β < 0 перекрытие монослоев L_o- и L_d-фаз пренебрежимо мало по сравнению с площадью доменов (S_int ⪡ min{S_R, S_S}), а при β > 0, L_o- и L_d-фазы перекрываются полностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Приравнивая β нулю и используя условие сохранения числа частиц (6), мы окончательно находим критическую плотность энергии индуцированного взаимодействия W* монослоев L_o- и L_d-фаз, при которой домены будут существовать исключительно в бислойном состоянии:

В случае, когда упругие характеристики фаз одинаковы в противоположных монослоях (B_1R = B_2R = = B_R, B_1S = B_2S = B_S, a_1R = a_2R = a_1S = a_2S = a), из формулы (10) следует уточненный нами, полученный ранее результат [30]:

Выражение под логарифмом всегда больше единицы, поэтому W* > 0, и, следовательно, W_int < 0; это означает, что L_o- и L_d-фазы в противоположных монослоях отталкиваются, что эквивалентно эффективному притяжению доменов L_o-фазы в противоположных монослоях. В случае одинаковых параметров ультрафиолетовых пределов у всех фаз (a_1R = a_2R = a_1S = a_2S = a), получим выражение (10) в виде

Упорядоченная фаза в каждом из монослоев по своему определению имеет более высокий модуль изгиба, чем неупорядоченная фаза в том же монослое, т.е. B_1R > B_1S, B_2R > B_2S. Если считать, что разные фазы в противоположных монослоях лишь слабо напрямую взаимодействуют друг с другом, т.е. |W_int| ⪡ k_BT, то β > 0, и L_o-домены всегда будут бислойными. Таким образом, при слабом прямом взаимодействии между монослоями в мембране не могут образовываться макроскопические области, в которых один монослой находится в жидко-упорядоченном, а другой – в жидко-неупорядоченном состоянии. Учет асимметричности липидного состава мембраны не приводит к качественному изменению критической плотности энергии взаимодействия, а лишь к количественному уточнению величины этой энергии.

Рассмотрим эффект различия параметров ультрафиолетовых пределов в различных областях мембраны. Для упрощения анализа положим модули изгиба монослоев всех фаз равными некоторой величине B. Тогда выражение (10) с учетом условия сохранения числа частиц (6) преобразуется к следующему виду:

Раскладывая выражение (13) в ряд по малой разности a_R – a_S, получим:

Таким образом, видно, что из-за разности δ = a_R – a_S характерных размеров, определяющих ультрафиолетовые пределы в L_o- и L_d-фазах, могут возникать силы, направленные на разделение бислойных упорядоченных доменов на монослойные, т.е. различие параметров ультрафиолетовых пределов имеет обратный эффект по сравнению с разностью модулей изгиба монослоев упорядоченной и неупорядоченной фаз.

Таким образом, мы показали, что изгибные флуктуации формы мембраны индуцируют сопряжение монослойных жидко-упорядоченных доменов в бислойные структуры. Это связано с тем, что оба монослоя имеют почти одинаковую локальную кривизну при любых флуктуациях формы межмонослойной (средней) поверхности мембраны. Для минимизации полной энергии системы жидко-упорядоченные домены, имеющие большую изгибную жесткость, склонны распределяться в участки с наименьшей кривизной, совпадающие в противоположных монослоях. Это приводит к тому, что монослойные L_o-домены, отличающиеся по изгибной жесткости от фоновой L_d-фазы, сопрягаются друг с другом в противоположных монослоях. Движущая сила сопряжения – различие изгибных жесткостей участков мембраны – является общей, в том смысле, что проявляется независимо от природы возникновения доменов, их состава и т.д. Предложенный механизм позволяет также объяснить сопряжение полипептидов, адсорбированных на разных поверхностях мембраны [39]. Однако существенное различие площади на молекулу для липидов, составляющих L_o- и L_d-фазу, может индуцировать обратное разделение бислойных доменов на их монослойные части. Таким образом, в реальных системах оба эти фактора необходимо учитывать при количественной оценке энергии сопряжения монослойных доменов.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, а также при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 17-00-00488 и № 18-04-01363).