Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 4, стр. 262-270

ВВЕДЕНИЕ

Исследование изменений структуры и свойств миелина при проведении нервным волокном возбуждения является важным направлением молекулярной физиологии. Известно, что миелин изолирует паранодальную область волокна, снижая ее эффективную электрическую емкость и тем самым обеспечивая более высокую общую скорость проведения возбуждения по миелинизированному волокну. При проведении возбуждения или активации ряда рецепторов Шванновских клеток (ШК) меняется не только структура миелина, но и содержание в его компартментах ионов калия и кальция [1]. С помощью электронной микроскопии доказано, что структура миелина характеризуется чередующимися плотными (контрастными) и неплотными слоями: период составляет 16–18.5 нм (периферическая нервная система) и 15–17 нм (центральная нервная система), а длина интернодального сегмента варьирует от 150–200 мкм (в ЦНС) до 1 мм (в ПНС) [2–4]. С помощью сканирующей рентгеновской дифракционной микроскопии показано, что в интернодальной области ламеллы миелина характеризуются периодом порядка 200 Å [2]. Вероятно, одной из причин микрогетерогенности миелина может быть различная ориентация липидных бислоев (ЛБ) относительно друг друга вдоль нервного волокна. Важно, что направление упаковки ламелл миелина не является радиальным [2, 4]. Структурами, приводящими к локальной дезорганизации миелина, являются насечки Шмитта–Лантермана (НШЛ), которые вызывают нерегулярное расширение цитоплазмы между слоями миелина.

Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) позволяет исследовать колебательные энергетические спектры молекул, благодаря чему можно производить анализ химической структуры и конформации молекулы [5]. КР использовали для исследования состояния липидов миелина нервных волокон при проведении серии ПД [6–14]. Однако при регистрации КР от различных отделов миелинового волокна (миелин, перехват ШК) возникает целый ряд вопросов. Например, размер фокального объема (объем пространства при регистрации КР) сравним с размером части объекта. Кроме того, наличие в миелине нервного волокна каротиноидов представляет собой не только научный интерес [9], но и предоставляет возможность создания технологии тестирования состояния ЛБ. Например, в зависимости от химической структуры каротиноидов, молекулы могут быть ориентированы в ЛБ различным образом: молекулы неполярных каротиноидов (бета-каротин) могут быть ориентированы как перпендикулярно, так и параллельно ЛБ. Важно, что ориентация молекулы каротиноидов может влиять на упорядоченность “хвостов” жирных кислот мембранных фосфолипидов в ЛБ и, соответственно, на физико-химические свойства миелина [15, 16]. В связи с этим мы использовали метод поляризационной спектроскопии КР (ПКР) для исследования ориентационной упорядоченности каротиноидов и липидов [17, 18].

Цель данной работы состояла в разработке подхода к количественному описанию упорядоченности молекул в ЛБ и выявлению микродоменной организации миелина нервного волокна.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили миелиновые нервы травяной лягушки (Rana temporaria). Животных анестезировали пропофолом (50 мг/кг). Одиночные нервные волокна размещали в пластиковой камере с раствором Рингера (NaCl (Sigma) 100 мМ, KCl (Sigma) 2 мМ, CaCl₂ (Sigma) 1.08 мМ, HEPES (Sigma) и покрывали стеклом (0.17 мм). В эксперимент отбирали нервные волокна, контактирующие с поверхностью покровного стекла, что позволяло контролировать угол наклона объекта и минимизировать аберрации.

Микроспектроскопия КР. КР регистрировали с помощью системы WITec alpha–300, используя ND: YAG непрерывный твердотельный лазер (длина волны 532 нм). Линейно поляризованный свет фокусировали на объекте с помощью 20× (NA = 0.4) или 50× (NA = 0.8) объективов. Средняя мощность лазера на выходе из объектива составляла около 0.5 мВт. Время накопления одиночных спектров варьировало от 10 с до 2 мин. Для измерения анизотропии КР анализатор помещали перед пинхолом микроскопа, что позволяло регистрировать плоскополяризованный свет. Измерения КР включали в себя одиночные КР-спектры, КР-спектры, зарегистрированные вдоль линии, или двумерные изображения. Величины латерального и аксиального разрешения составляли 1.2 и 9.7 мкм для 20× и 0.9 и 7.5 мкм для 50× объективов. [10–14]. Для выявления вклада колебания характерных связей молекулы каротиноида и жирных кислот фосфолипидов миелинового нервного волокна использовали ряд соотношений спектра КР (см. ниже). Полосы КР-спектра миелинового нервного волокна идентифицировали, используя спектры каротиноидов и лецитина [5].

Лазерная интерференционная микроскопия. Измерения оптической разности хода светового луча (ОРХ) проводили с помощью автоматического интерференционного микропрофилометра МИА-1, собранного на базе МИИ-4 интерферометра Линника (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия). Объекты освещали неполяризованным светом от светодиодного лазера длиной волны 650 нм и мощностью 5 мВт. Мощность излучения на исследуемой клетке составляла не более 3 мВт. Фокусировку изображения проводили с помощью 30× объектива с числовой апертурой NA = 0.65, а регистрацию изображения – с помощью черно-белой 12-битной видеокамеры VS-415U (NPK Videoscan, Россия). Разрешение получаемых изображений составляло 512 × 512 пикселей [19].

Статистическая обработка результатов. Все полученные данные разделяли на две группы. К первой относятся отношения интенсивностей полос спектра КР, ко второй – параметры упорядоченности ⟨P₂⟩ и ⟨P₄⟩. Нормальное распределение выборочных средних позволило использовать t-тест Стьюдента для сравнения математических ожиданий двух генеральных совокупностей, соответствующих контролю и опыту. Таким образом, t-тест Стьюдента с неравными дисперсиями был использован для сравнения отношений интенсивностей полос КР с уровнем значимости 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что КР-спектр миелинового нервного волокна представляет собой суперпозицию спектров β-каротина и лецитина (рис. 1). В области сканирования 900–1700 см⁻¹ выявлены полосы, характеризующие: изгибные колебания боковых метильных групп –CH₃ в молекулах каротиноидов (1004 см⁻¹); колебания –С–С–связей каротиноидов (1160 см⁻¹); вращательные колебания –CH₂–алкильных радикалов в составе липидов (1300 см⁻¹); изгибные колебания –CH₂– алкильных радикалов в составе липидов (1440 см⁻¹); колебания –С=С–связей каротиноидов (1527 см⁻¹); колебания –С=С–связей алкильных радикалов ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов (1655 см⁻¹). В области 2800–3000 см⁻¹ обнаружены симметричные колебания метиленовых групп липидов –CH₂– (2850 см⁻¹); несимметричные колебания метиленовых групп липидов –CH₂– и – CH₂– (2884–2885 см⁻¹); колебания метиленовых групп липидов –CH₂– и симметричных колебаний –CH-групп (2932–2940 см⁻¹) [19, 20]. Из всего набора перечисленных выше полос для анализа состояния липидов миелина использовали следующие соотношения интенсивностей (рис. 1): 1) I₁₅₂₇/I₁₁₆₀ (конформация каротиноидов ЛБ) – отношение возрастает при увеличении упорядоченности липидов (обозначается как I₁); 2) I₁₆₅₅/I₁₄₄₀ – отношение возрастает при увеличении степени ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов ЛБ (обозначается как I₂); 3). I₂₈₈₄/I₂₉₃₂ (конформация “хвостов” жирных кислот фосфолипидов в ЛБ), отношение возрастает при увеличении упорядоченности липидов ЛБ (обозначается как I₃).

Установлено, что спектр КР интернодальной области миелинового нервного волокна симметричен относительно центра c выраженными максимумами у края волокна (рис. 2). Неоднородное распределение интенсивности КР в паранодальной области волокна обусловлено неупорядоченной упаковкой ЛБ, участвующих в формировании так называемых паранодальных петель – концевых фрагментов миелина. Отметим, что распределение интенсивностей полос КР-спектра каротиноидов повторяют форму распределения амплитуд полосы КР-спектра жирных кислот фосфолипидов, что свидетельствует о локализации этих молекул в ЛБ.

В ходе регистрации распределения величины интенсивности фокального дублета (ФД) была выявлена гетерогенность в распределении данных молекул в ЛБМ: на некоторых участках миелина (ФД^– тип) ФД отсутствовали (рис. 3б), а на других участках миелина (ФД⁺ тип) регистрировали ФД на противоположной стороне волокна (рис. 3а). Промежуточные значения интенсивности ФД не учитывали, например, второй максимум (рис. 3в). Вероятно, возникновение ФД связано с “потерями” света в миелине: если структура миелина была идеальным оптическим резонатором, то световые волны циркулировали бы внутри. ФД⁺ тип связан с тем, что при данной кривизне поверхности миелина угол падения световой волны может не соответствовать углу полного внутреннего отражения, а также с рассеянием света на неоднородных структурах миелина. Таким образом, с помощью данного подхода можно исследовать структуру ЛБ в различных участках миелинового нервного волокна. В этих опытах при регистрации КР плоскость поляризации возбуждающего лазера была параллельна оси нервного волокна. Из спектров КР каротиноидов и жирных кислот фосфолипидов рассчитывали I₁, I₂ и I₃ (рис. 4). Установлено, что мембраны миелина в составе участков ФД⁺ типа характеризуются более высокой степенью разупорядоченности и ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов. Вероятно, для ЛБ с высокой степенью разупорядоченности липидов формирование плотных контактов между соседними слоями миелина затруднено по сравнению с более упорядоченными мембранами ФД^– типа. Известно, что для структуры миелина свойственны различные локальные неоднородности, такие как, например, насечки Шмидта–Лантермана (НШЛ), которые формируют “каналы” цитоплазмы ШК внутри миелина. Как отмечалось ранее, результаты рентгеновской дифракционной микроскопии также свидетельствуют о наличии структурных гетерогенностей миелина в пределах интернодальной области нервного волокна. Чтобы связать микроскопические различия в структуре ЛБ с плотностью их упаковки, использовали метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) [19]. В данной серии экспериментов выявлена гетерогенность распределения ОРХ вдоль нервного волокна: минимальное значение ОРХ соответствует перехвату Ранвье. Таким образом, в пределах интернодальной области некоторые свойства миелина (распределение жирных кислот по степени их насыщенности и конформация каротиноидов) могут варьировать.

При исследовании ориентации молекул каротиноидов и жирных кислот фосфолипидов миелина регистрировали КР нервных волокон при различных положениях плоскости поляризации луча лазера относительно волокна и фиксированной плоскости поляризации при регистрации полученного сигнала (рис. 5). Полосы КР-спектра каротиноидов (1160 и 1527 см⁻¹) и полосу 2885 см⁻¹ липидов использовали для расчета отношений интенсивностей: ⟨J_zz⟩/⟨J_zy⟩ и ⟨J_yy⟩/⟨J_yz⟩ и построения ориентационной функции распределения (ОФР) (доля частиц, ориентированных с определенным углом) (рис. 6). В случае симметричной объемной фазы (растянутый полимер или мембрана) с молекулами, обладающими цилиндрической симметрией, их ОФР (N(θ, φ, ψ) является функцией только одного аргумента – угла θ между осью молекулы и нормалью к мембране. Основываясь на выводах теории Bower, подобную ОФР можно разложить в ряд по полиномам Лежандра [20]:

Наличие C_2h симметрии у молекул каротиноидов позволяет использовать в уравнении только четные члены. Измеряя спектры КР с различными положениями поляризатора и анализатора, можно получить значения ⟨P₂⟩ и ⟨P₄⟩ коэффициентов, решив систему уравнений, как описано в работах Everall и др., и использовать их для построения ОФР [21]. Установлено, что молекулы каротиноидов расположены преимущественно перпендикулярно к поверхности ЛБ, а их ориентация зависит от химической структуры и состава мембраны [16–18, 20].

Ранее в качестве неоднородностей интернодальной области миелина рассматривали только НШЛ (рис. 7). Мы установили, что микродоменная структура миелина включает и радиальные области плотного миелина, занимающие определенный участок вдоль волокна (рис. 7д). Подобная организация структуры миелина подразумевает локальную корреляцию со свойствами соседних ЛБМ. Отметим, что в отличие от НШЛ подобные микродомены не могут быть выявлены с помощью стандартной оптической микроскопии, и для их исследования необходимо применение разработанного нами метода визуализации.

Настоящая работа поддержана грантом РНФ (проект № 19-79-30 062).