Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 4, стр. 242-254

ВВЕДЕНИЕ

У растений фотосинтез происходит в энергопреобразующих органеллах – хлоропластах. Хлоропласты имеют сложную структуру. Внешняя оболочка хлоропласта состоит из двух липидных мембран, а внутреннее пространство (строму) пронизывают удлиненные мембраны (ламеллы), которые образуют замкнутые уплощенные пузырьки – тилакоиды. Плотно примыкающие друг к другу тилакоиды образуют граны, которые соединяются друг с другом посредством межгранных тилакоидов, являющихся продолжением гранальных тилакоидов [1–3]. В мембране тилакоидов располагаются пигмент-белковые комплексы, которые поглощают свет и обеспечивают протекание первичных процессов фотосинтеза: поглощение света пигментами светособирающих антенн фотосистемы 1 (ФС1) и фотосистемы 2 (ФС2), миграцию энергии поглощенных квантов света к реакционным центрам. В реакционных центрах ФС1 и ФС2 происходит первичное разделение зарядов и инициируются процессы переноса электронов по цепи электронного транспорта (ЦЭТ) [4–6]. Фотоиндуцированный транспорт электронов сопряжен с трансмембранным переносом протонов. Транс-тилакоидная разность электрохимических потенциалов ионов водорода ($\Delta {{\tilde {\mu }}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$) служит “движущей силой” для работы АТР-синтазного комплекса, обеспечивающего образование молекул ATP из ADP и неорганического фосфата (P_i). В строме расположены ферменты цикла Кальвина–Бенсона (ЦКБ), катализирующие реакции восстановления углерода [7].

Основу тилакоидных мембран хлоропластов составляет липидный бислой, в который встроены белковые комплексы. Одна из особенностей структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата в хлоропластах высших растений – неоднородное распределение электрон-транспортных и АТР-синтазных комплексов. Бóльшая часть комплексов ФС2 локализована в мембранах тесно примыкающих друг к другу тилакоидов гран [1–3]. Напротив, ФС1 и АТР-синтазные комплексы расположены в тех участках тилакоидной мембраны, которые экспонированы в область стромы (межгранные тилакоиды и торцевые участки тилакоидов гран). Цитохромные b₆f-комплексы распределены равномерно между гранальными и межгранными тилакоидами [8, 9].

Выяснение механизмов регуляции электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах – актуальная задача биофизики и биохимии фотосинтеза. Структурно-функциональная “гибкость” фотосинтетического аппарата обеспечивает его эффективную работу в изменчивых естественных условиях. В хлоропластах можно выделить два типа регуляторных процессов [10–16], которые включают в себя быстрые (секунды−минуты) и медленные (часы–сутки) механизмы регуляции. Быстрые механизмы связаны с активацией/деактивацией ферментов ЦКБ, перераспределением энергии поглощаемого света между ФС1 и ФС2 и ион-зависимой регуляцией электронного транспорта. Медленные механизмы обусловлены изменениями экспрессии белков фотосинтетического аппарата хлоропластов. Наряду с этим важную роль в регуляции фотосинтеза играют процессы светозависимого перемещения хлоропластов внутри растительной клетки [17].

Один из ключевых механизмов регуляции фотосинтетического транспорта электронов связан с изменениями pH внутритилакоидного пространства (pH_in), которые влияют на скорость переноса электронов между ФС2 и ФС1. Лимитирующим звеном в ЦЭТ хлоропластов является стадия окисления пластохинола (QH₂) цитохромным b₆f-комплексом [18, 19]. Окисление QH₂ сопряжено с выделением протонов во внутритилакоидный объем: при уменьшении pH_in скорость переноса электронов замедляется. Транстилакоидная разность рН (ΔрН), создаваемая за счет работы ЦЭТ хлоропластов, вносит основной вклад в величину “протон-движущей силы” $\Delta {{\tilde {\mu }}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$ [20], обеспечивающей работу АТP-синтазы (ADP + + P_i → АТР). Поток протонов через АТP-синтазу (J_ATP) влияет на величину ΔрН. При избытке субстратов для реакции синтеза АТР поток J_ATP и, соответственно, скорость синтеза АТР будут высокими. При этом поддерживается высокая скорость переноса электронов между фотосистемами (метаболическое “состояние 3”). После уменьшения концентрации ADP вследствие работы АТР-синтазы поток протонов, сопряженный с синтезом АТР, ослабевает, происходит дополнительное уменьшение pH_in, что вызывает торможение переноса электронов (метаболическое “состояние 4”) [15, 20–22].

В настоящей работе проведен теоретический анализ рН-зависимой регуляции электрон-транспортных процессов в хлоропластах в рамках математической модели, разработанной нами ранее [23–29]. Численное моделирование световых стадий фотосинтеза позволяет анализировать обратные связи в разветвленной сети внутриклеточных метаболических процессов [30, 31]. Использование математических методов оказывается плодотворным даже при том, что хлоропласты имеют сложную топологию – неоднородное распределение пигмент-белковых комплексов вдоль тилакоидных мембран [32, 33]. В данной работе основное внимание уделено анализу механизмов метаболического контроля в хлоропластах при функционировании ЦКБ и в условиях псевдоциклического транспорта электронов. Показано, что многофазная кинетика фотоокисления Р₇₀₀ (первичный донор электронов в ФС1) отражает перераспределение электронных потоков между циклическим и нециклическим путями переноса электронов, обусловленное активацией ЦКБ вследствие защелачивания стромы, а также смену лимитирующей стадии в цепи переноса электронов, индуцированную уменьшением рН внутритилакоидного пространства (pH_in). По мере снижения pH_in поток электронов между ФС2 и ФС1 ослабевает вследствие замедления окисления пластохинола и ослабления активности ФС2 в результате нефотохимического тушения (НФТ) возбуждения молекул хлорофилла.

ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ

В основу модели, использованной в настоящей работе, легла модель фотосинтетических процессов оксигенного типа, подробно описанная в [23–29, 34–39]. Схема рассматриваемых процессов электронного транспорта показана на рис. 1. Модель описывает альтернативные пути переноса электронов в хлоропластах: (1) нециклический перенос электронов от ФС2 к ФС1 и далее к NADP⁺, (2) псевдоциклический транспорт электронов с участием молекулярного кислорода в качестве акцептора электрона в ФС1, и (3) циклический перенос электронов вокруг ФС1. Наряду с этим рассматриваются процессы трансмембранного переноса протонов и синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата (P_i). Описывается поведение следующих переменных: $[{\text{P}}_{{700}}^{ + }]$ – концентрация окисленных центров Р₇₀₀ (первичный донор электронов в ФС1), $[{\text{P}}_{{680}}^{ + }]$ – концентрация окисленных центров Р₆₈₀ (первичный донор электронов в ФС2), [Pc] – концентрация окисленных переносчиков – непосредственных доноров электронов для окисленных центров ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ (пластоцианин в хлоропластах и/или цитохром с₆ у цианобактерий), [PQ] – концентрация окисленного пластохинона, [Fd] – концентрация окисленного ферредоксина, [N⁺] и [NH] – концентрации терминального акцептора ФС1 в окисленной и восстановленной формах – NADP⁺ и NADPH соответственно. Переменная [ATP] описывает изменения концентрации АТP. Переменные $[{\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }]$ и $[{\text{H}}_{{{\text{out}}}}^{ + }]$ описывают изменения концентраций ионов водорода во внутритилакоидном пространстве и в строме соответственно. При моделировании считается, что все переносчики электронов распределены однородно в мембране тилакоида и скорость переноса электронов не лимитируется диффузией мобильных переносчиков электрона (см. обоснование в [15, 22, 28]). Система обыкновенных дифференциальных уравнений, описывающих поведение переменных модели во времени, подробно описана нами ранее в [29].

Рис. 1.

Процессы электронного и протонного транспорта, рассматриваемые в модели. Обозначения: Fd – ферредоксин; FNR – ферредоксин-NADP-редуктаза; FQR – ферредоксин-хинон-редуктаза; Р₇₀₀ и Р₆₈₀ – первичные доноры электрона фотосистемы 1 (ФС1) и фотосистемы 2 (ФС2) соответственно; Рс – пластоцианин; РQ – пластохинон (окисленная форма); РQH₂ – пластохинол (восстановленная форма); b₆f – цитохромный комплекс b₆f. ЦКБ – цикл Кальвина–Бенсона. Константы у стрелок характеризуют скорости соответствующих реакций (подробности в тексте). Цифрами обозначены моделируемые пути электронного транспорта от ферредоксина: 1 – в ЦКБ, 2 – на молекулярный кислород (реакция Мелера), 3 – циклический путь вокруг ФС1.

Процессы электронного транспорта. Поток электронов от ФС1 к NADP⁺ (J_NADP) обеспечивает образование NADPH за счет электронов поступающих от ФС2 (нециклический транспорт электронов: Н₂О → ФС2 → PQ → b₆f → ФС1 → Fd → → NADP⁺). Акцептором электрона в ФС1 служит ферредоксин (Fd). Два электрона от двух восстановленных молекул Fd (Fd⁻) переносятся на NADP⁺ через ферредоксин-NADP-редуктазу (FNR). Восстановленная молекула NADP⁻ протонируется за счет ионов водорода, поступающих из стромы (NADP⁻ + Н⁺ → NADPН). Потребление NADPН и ATР описывается феноменологически с помощью функции k_CBC([NADPН],[ATР],pH_out), зависящей от концентраций [NADPН], [ATР] и рН стромы (pH_out), как предложено в работах [23, 24]. В модели предусмотрено, что фотоиндуцированное защелачивание стромы (увеличение pH_out) ускоряет потребление NADPН и ATР в ЦКБ (сигмоидная зависимость k_CBC от pH_out).

Второй путь оттока электронов от ФС1 – перенос электрона от ФС1 на молекулу О₂ (реакция Мелера [40–42]). В результате этого образуются супероксидные радикалы ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }}$, которые дисмутируют с образованием пероксида водорода (Н₂О₂) и молекулярного кислорода (2${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }}$+ 2Н⁺ → → Н₂О₂ + О₂); молекулы Н₂О₂ разлагаются до О₂ и воды. Таким образом, электроны от молекулы воды, разлагаемой в ФС2, переносятся к молекулам О₂, при этом конечным продуктом оказывается молекула воды (так называемый цикл вода–вода, Н₂О → ФС2 → ФС1 → Н₂О). Как и в случае нециклического переноса электронов, функционирование цикла вода–вода приводит к накоплению протонов в люмене.

Циклический поток электронов вокруг ФС1, при котором электроны возвращаются от Fd через ферредоксин-хинон-редуктазу (FQR) в ЦЭТ между ФС2 и ФС1 (на уровне пластохинона), обычно называют коротким циклом [43, 44]. Возможен, в принципе, и длинный путь циклического переноса электронов вокруг ФС1, когда электроны от NADPH возвращаются в ЦЭТ (на пластохиноновый участок) через NAD(P)-оксидоредуктазу [45]. Однако эффективность работы длинного пути циклического транспорта электронов, как правило, незначительна и поэтому в данной работе этот путь не учитывали.

Процессы трансмембранного переноса протонов. В модели рассматривается накопление протонов внутри тилакоидов в результате разложения воды в ФС2 и окисления QH₂ цитохромным b₆f-комплексом. Учитывается, что ионы водорода, локализованные внутри (люмен) и снаружи (строма) тилакоидов, могут связываться с протон-акцепторными (буферными) группами (Buf), концентрация которых значительно превышает концентрацию электронных переносчиков ([Buf]/[ФС1] ~ 100; подробнее см. [46]). Влияние буферных групп сказывается на скорости достижения стационарного состояния системы; однако, как отмечено ранее [46], стационарные значения переменных модели не должны зависеть от буферной емкости хлоропластов.

Выход протонов из тилакоидов в строму может происходить двумя путями: через АТР-синтазу (сопряженный с синтезом АТР поток протонов J_ATP) и путем пассивной утечки протонов, не связанной с синтезом АТР (поток протонов ${{J}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$). В модели также учитывается обмен протонами между стромой и цитозолем (поток протонов J_cell, см. подробнее [23–25]). Мы предполагаем, что концентрации ионов водорода в строме и в люмене не зависят от пространственных координат, что эквивалентно условию “быстрого перемешивания”. Значение pH_cyt в цитозоле (пространство между оболочкой хлоропласта и клеточной мембраной) считается постоянным за счет высокой буферной емкости цитоплазмы (pH_cyt 8).

Параметры модели. Система кинетических уравнений и методология выбора эффективных констант скоростей процессов, обозначенных на рис. 1, подробно описаны в наших работах [23–29]. Ключевой стадией, определяющей скорость переноса электронов между ФС2 и ФС1, является окисление пластохинола (QH₂) цитохромным b₆f-комплексом. Скорость этой реакции, как известно [15, 18–22], зависит от концентрации ионов водорода внутри тилакоидов, [${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$]. Скорость окисления QH₂ характеризуется функцией k_Q = f([Q],[Pc],[${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$]). Значение k_Q обратно пропорционально величине ${{\tau }_{{\text{Q}}}}$ – характерному времени окисления QH₂. Это время определяется скоростью взаимодействия QH₂ с цитохромным b₆f-комплексом и переносом электрона на молекулу пластоцианина [46].

Выбор функции k_Q = f([Q],[Pc],[${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$]) сделан на основании сравнения экспериментальной и теоретической зависимостей скорости восстановления окисленных центров ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ от pH_in после выключения света. Адекватный выбор этой функции играет ключевую роль при моделировании явления фотосинтетического контроля в хлоропластах. Для построения функции k_Q = f([Q],[Pc],[${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$]) мы использовали экспериментальную кривую, отражающую зависимость от рН_in времени полувосстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ после выключении белого света [47–49]. Рис. 2 показывает, что модельная рН-зависимость скорости восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ находится в хорошем согласии с экспериментом; при уменьшении рН_in скорость переноса электрона к ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ замедляется. В качестве дополнительного критерия адекватного выбора функции k_Q([Q],[Pc],[${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$]) мы использовали экспериментальные данные о значениях рН_in в метаболических состояниях 3 (условия интенсивного синтеза АТР) и 4 (состояние “фотосинтетического контроля”). При этом мы исходили из того, что стационарные значения pH люмена равны рН_in ≈ ≈ 6.0−6.25 (состояние 3) и рН_in ≈ 5.5−5.75 (состояние 4) [47, 50, 51]. Для описания потребления АТР и NADPH в ЦКБ мы использовали функцию ${{k}_{{{\text{CBC}}}}}([{\text{ATP],[NADPH],p}}{{{\text{H}}}_{{{\text{out}}}}})$, которая описывает активацию реакций ЦКБ в зависимости от рН стромы (pH_out). Подробное описание этой функции дано в наших работах [23–25].

Рис. 2.

Экспериментальная и теоретическая зависимости времени полувосстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ после выключения белого света от рН внутритилакоидного пространства. Светлые точки – эксперимент, темные точки – расчет. Экспериментальные точки получены для суспензии разобщенных хлоропластов, по материалам работы [49].

Можно найти множество работ, посвященных моделированию работы АТР-синтазы (например, на основе кинетических моделей с несколькими состояниями; см., например, обзоры [52, 53]). Для описания работы АТР-синтазы нами использована сравнительно простая модель работы АТР-синтазы, предложенная в [54]. Для моделирования процессов трансмембранного переноса протонов мы использовали функции, описывающие активный (сопряженный с синтезом АТР, J_ATP) и пассивный (утечка протонов через мембрану, ${{J}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$) потоки протонов, которые зависят от разности концентраций ионов водорода [${\text{H}}_{{{\text{in}}}}^{ + }$] и [${\text{H}}_{{{\text{out}}}}^{ + }$]. Поток протонов J_ATP зависит также от соотношения концентраций ADP и ATP – субстрата и продукта реакции, катализируемой АТР-синтазой. Обоснование того, как выбирается функция, описывающая трансмембранный перенос протонов через АТР-синтазу, а также описание функций и констант, определяющих потоки J_ATP и ${{J}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$, дано в нашей работе [29]. Конкретные значения констант, входящих в формулы потоков J_ATP и ${{J}_{{{{{\text{H}}}^{ + }}}}}$, выбраны путем фитирования экспериментальных данных так, чтобы получить наилучшее согласие расчетных и экспериментальных величин pH_in и скорости синтеза АТР при различных значениях pH_out. Функция утечки протонов, описывающая обмен протонами между стромой и цитозолем (J_cell), выбрана аналогично функции J_Н+ [25, 27, 29].

Вариации в стехиометрии пигмент-белковых комплексов ФС1 и ФС2 учитывали, выбирая разные соотношения параметров L₁ и L₂, характеризующих число квантов света, попадающих в единицу времени к Р₇₀₀ и Р₆₈₀ соответственно. Принято, что дальний красный свет (ДКС), возбуждающий преимущественно ФС1, соответствует отношению L₁/L₂ = 10, а белый свет (БС), эффективно возбуждающий обе фотосистемы, соответствует отношению L₁/L₂ = 0.8. Такие соотношение L₁/L₂ выбрано нами, исходя из сравнения спектров действия ФС1 и ФС2 [55, 56]. Кроме этого, как показали результаты наших предыдущих исследований [24, 25, 38], выбирая данные соотношения параметров L₁ и L₂, удается получить вполне правдоподобное описание многофазной кинетики фотоиндуцированных превращений Р₇₀₀ в листьях высших растений. Для моделирования НФТ возбуждения молекул хлорофилла в светособирающей антенне ФС2, которое, как известно [57], усиливается при закислении внутритилакоидного пространства, мы задавали L₂ в виде функции L₂(рН_in), уменьшающейся по мере снижения рН внутритилакоидного пространства (см. подробнее [29]). Максимальное ослабление активности ФС2 за счет генерации НФТ (в модели этому соответствует уменьшение параметра L₂) в результате снижения pH_in принималось равным трем (при pH_in ≤ 5.5).

В качестве начальных условий, если не оговорено специально, считали что пулы пластохинона и Fd окислены, а Р₇₀₀, Р₆₈₀ и пластоцианина восстановлены. Эти условия были приняты из следующих соображений. Пластоцианин − это высокопотенциальный переносчик электронов ($E_{{\text{m}}}^{{\text{'}}}$ ~ +380 мВ), который, как и Р₇₀₀ ($E_{{\text{m}}}^{{\text{'}}}$ ~ +500 мВ), после адаптации хлоропластов к темноте находится в восстановленном состоянии. Действительно, эффективный редокс-потенциал стромы гораздо ниже (см., например, [58]), а потому практически все молекулы Р₇₀₀ и Рс в начальном состоянии должны находиться в восстановленном состоянии. В соответствии с экспериментальными данными [18, 19, 59, 60] общую концентрацию молекул пластохинона (двухэлектронный переносчик) приняли в 10 раз больше [Р₇₀₀], концентрации пластоцианина – в 1.5 раза, а Fd – в 7 раз больше [Р₇₀₀].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метаболический контроль в хлоропластах класса Б. В настоящем разделе представлены результаты моделирования процессов, связанных с переходами между метаболическими состояниями (состояние 3 → состояние 4) в условиях псевдоциклического транспорта электронов (H₂O → → ФС2 → QH₂ → b₆f → Pc → ФС1 → O₂). В хлоропластах класса Б, лишенных оболочки, отсутствуют ферменты ЦКБ; однако при этом сохраняется целостность (замкнутость) тилакоидов, благодаря чему хлоропласты класса Б способны генерировать ΔpH и синтезировать АТР. Значение рН внешней среды принято равным рН 8. Этот выбор обусловлен тем, что мы моделируем рН-зависимые метаболические переходы в изолированных хлоропластах класса Б, суспендированных в буфере с рН 8, изученные ранее [15, 48]. Такой выбор рН определяется тем, что максимальная скорость синтеза АТР в хлоропластах класса Б наблюдается при рН 8 [33].

Основные закономерности фотосинтетического контроля, связанного с переходами между метаболическими состояниями 3 и 4, адекватно описываются в рамках нашей модели. На рис. 3 показаны результаты моделирования кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений P₇₀₀ (а) и PQ (б), а также изменений рН_in (в) в хлоропластах класса Б. Предполагается, что в строме pH_out 8 = const. В согласии с экспериментальными данными [48, 49] расчеты показали, что освещение хлоропластов ДКС, возбуждающим преимущественно ФС1, индуцирует окисление P₇₀₀. При этом также окисляется PQ. После включения БС, эффективно возбуждающего обе ФС, происходит быстрое восстановление ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ за счет притока электронов по ЦЭТ от ФС2 к ФС1. Ход кинетической кривой зависит от метаболического состояния хлоропластов. В отсутствие ADP, когда не происходит синтеза АТР (состояние 4), наблюдается незначительный спад концентрации ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ (рис. 3а), что отражает торможение переноса электронов вследствие снижения значений рН люмена до рН_in ≈ 5.8 при внешнем рН_out 8 (рис. 3в). В условиях синтеза АТР (состояние 3) протоны из люмена выходят во внешнее пространство через активно функционирующие АТР-синтазные комплексы. При этом рН_in снижается слабее, чем в состоянии 4, а потому поддерживается высокая скорость переноса электронов между ФС2 и ФС1 в состоянии 3. Более интенсивный поток электронов между ФС сопровождается заметным снижением [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] и некоторым увеличением [PQ].

Рис. 3.

Расчетная кинетика фотоиндуцированных изменений относительных концентраций окисленных реакционных центров ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ (а), окисленного пластохинона PQ (б) и фотоиндуцированных изменений внутритилакоидного рН_in (в) в зависимости от метаболического состояния хлоропласта класса Б. Состояние 3 – активный синтез ATP (в исходном состоянии [ATP]₀/[P₇₀₀]₀ = 150), состояние 4 – фотосинтетический контроль (АТР-синтаза неактивна), состояние 5 – разобщенные хлоропласты (ΔрН = 0).

По мере истощения пула молекул ADP хлоропласты переходят в метаболическое состояние 4. При этом [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] возрастает и в конечном итоге достигает уровня, характерного для состояния 4. В то же время, концентрация окисленного пластохинона уменьшается из-за замедления скорости окисления QH₂ в результате снижения pH_in (рис. 3в). При моделировании разобщенных хлоропластов (состояние 5), когда pH_in = pH_out = = const, скорость переноса электронов сохраняется высокой на протяжении всего времени действия БС, при этом происходит более заметное снижение [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] и уменьшается концентрация восстановленного пластохинона.

О скорости переноса электронов между ФС можно судить по кинетике восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ после выключения света [48, 49]. Если $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{}}$ − суть время полувосстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$, то обратная величина $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ может служить параметром, характеризующим скорость переноса электронов к окисленным центрам ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$. Рис. 4 иллюстрирует сказанное. На панели 4а показано, как происходит спад переменной [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] в ответ на выключение света после 20 с действия БС. Скорость спада [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] зависит от метаболического состояния хлоропластов: в состоянии 4 восстановление ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ происходит медленнее, чем в условиях синтеза АТР (состояние 3) или в состоянии 5 (разобщенные хлоропласты).

Рис. 4.

Кинетика спада переменной [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] после действовавшего в течение 20 с белого света, рассчитанная для различных состояний хлоропластов класса Б (панель а). Обозначения кинетических кривых соответствуют метаболическим состояниям 3в, 4 и 5 (см. определение в тексте). На панели б показаны расчетные зависимости скорости переноса электронов между ФС2 и ФС1 (параметр $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ ) от длительности действия белого света при различных метаболических состояниях хлоропласта класса Б. Кривые 3а, 3б, 3в относятся к состоянию 3 при различных исходных концентрациях АТP: а – [ATP]₀/[P₇₀₀]₀ = 100, б – [ATP]₀/[P₇₀₀]₀ = 150, в – [ATP]₀/[P₇₀₀]₀ = 200.

На рис. 4б показано как меняется значение кинетического параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$, характеризующего скорость восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$, по мере действия БС. Зависимость параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ от длительности действия БС свидетельствует, что скорость переноса электронов между ФС2 и ФС1 замедляется при переходе от метаболического состояния 3 в состояние “фотосинтетического контроля” (состояние 4). В отсутствие добавленного АТР торможение электронного транспорта наступает за время, равное ≈5 с, что обусловлено быстрым снижением рН_in. В метаболическом состоянии 3 (при избытке ADP) скорость переноса электронов остается высокой в начальный период освещения, поскольку утечка протонов через CF₀–CF₁ предотвращает слишком сильное закисление люмена (pH_in ~ 6.2 при pH_out 8.0). Создаваемая в состоянии 3 разность рН (ΔpH = 1.8) достаточна, чтобы поддерживать интенсивный синтез АТР [50]. При этом вследствие умеренного закисления люмена поток электронов между ФС2 и ФС1 остается высоким. По мере истощения ADP и образования избытка АТР приток электронов к ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ замедляется. Это происходит вследствие дополнительного снижения рН_in, что отражает смену метаболических состояний (состояние 3 → состояние 4). Результаты расчетов для разных исходных концентраций ADP хорошо согласуются с экспериментальными данными [15]. Как видно из рис. 4б, задержка, предшествующая торможению электронного транспорта (переход хлоропластов из состояния 3 в состояние 4), возрастает при увеличении исходной концентрации ADP, добавленного к хлоропластам, в согласии с измерениями скорости переноса электронов между ФС2 и ФС1 в хлоропластах класса Б [15]. В то же время, в состояниях 4 (ΔpH = 2.2 = const) и 5 (ΔpH = 0) скорости электронного транспорта остаются постоянными.

Сопоставление расчетных (рис. 4) и экспериментальных (рис. 5) данных показывает, что наша модель правильно отражает основные закономерности рН-зависимой регуляции псевдоциклического электронного транспорта. На рис. 5 приведены данные по динамике изменений кинетического параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$, полученные на основании исследования кинетики восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ в зависимости от длительности освещения изолированных хлоропластов бобов (Vicia faba) класса Б [15] и листьев китайской розы (Hibiscus rosa-sinensis) [61]. В отсутствие добавленного ADP (состояние 4) в хлоропластах бобов происходит быстрое замедление электронного транспорта, обусловленное достаточно сильным снижением рН внутритилакоидного пространства, характерным для состояния 4 (pH_in ~ 5.5). В присутствии добавленного ADP (2 мМ) торможения электронного транспорта не наблюдалось до тех пор, пока спустя ≈20 с после начала освещения не происходило замедления переноса электронов, обусловленного дополнительным снижением pH_in в результате ослабления работы АТР-синтезы из-за истощения АТР (переход в состояние 4). Длительность задержки Δt, которая характеризует нахождение хлоропластов в состоянии 3, зависела от концентрации добавленного ADP: лаг-фаза Δt возрастала по мере увеличения концентрации молекул ADP, добавленных в суспензию хлоропластов [15].

Рис. 5.

Динамика изменений кинетического параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$, построенная на основании результатов экспериментального исследования кинетики восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$, в зависимости от длительности освещения изолированных хлоропластов бобов (Vicia faba) класса Б (по результатам работы [15]) и листьев китайской розы (Hibiscus rosa-sinensis) (по результатам работы [61]). В опытах с изолированными хлоропластами бобов, суспензия содержала 10 мкМ метилвиологен (медиатор переноса электронов от ФС1 к молекулярному кислороду). Кроме того, в суспензию хлоропластов добавлено 2 мМ ADP (темные точки) или 10 мкМ АТP (светлые ромбы), как отмечено на рисунке. Остальные условия (методики выделения хлоропластов и проведения кинетических измерений методом ЭПР) описаны ранее (см. подробнее [15] и цитированные там работы). Параметр Δt характеризует время перехода хлоропластов из метаболического состояния 3 в состояние 4.

На рис. 5 также приведены данные по динамике изменений параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$, полученные для хлоропластов in situ в листьях китайской розы [61]. В этом случае постоянное значение $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ сохранялось при более длительном освещении листьев. Очевидно, это обусловлено тем, что в интактных хлоропластах, в отличие от изолированных хлоропластов класса Б, происходит регенерация ADP в результате гидролиза АТР при потреблении ADP в ЦКБ и других метаболических циклах.

рН-зависимая регуляция электронного транспорта в интактных хлоропластах. В интактных хлоропластах фотосинтетический транспорт электронов регулируется на двух участках ЦЭТ: (1) между ФС2 и ФС1, (2) на стадии оттока электронов от ФС1 в ЦКБ [21]. Кинетика фотоокисления Р₇₀₀ определяется соотношением скоростей оттока и притока электронов к ФС1. Наблюдаемое в эксперименте увеличение концентрации ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ может быть обусловлено не только ускорением оттока электронов от ФС1 в результате активации ЦКБ, но и ослаблением притока электронов к ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ вследствие фотоиндуцированного закисления люмена [61, 62]. Уменьшение pH_in может замедлять окисление QH₂ цитохромным b₆f-комплексом [15, 19–21], а также ослаблять активность ФС2 вследствие усиления НФТ возбуждения молекул хлорофилла в светособирающей антенне ФС2 [52]. Все три фактора регуляции электронного транспорта − активация ЦКБ, замедление окисления QH₂ и усиление НФТ − зависят от фотоиндуцированных изменений рН в строме и люмене. Светоиндуцированное защелачивание стромы (рН_оut 7 → рН_оut 8) способствует ускорению реакций ЦКБ, в то время как снижение pH_in вызывает замедление притока электронов к ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$. Фотоиндуцированные изменения рН_оut и pH_in проявляются в кинетике фотоокисления Р₇₀₀ в интактных хлоропластах, адаптированных к темноте [61, 62]. Перераспределение электронных потоков между нециклическими и циклическими путями также может сказываться на кинетике окислительно-восстановительных превращений Р₇₀₀.

Моделирование электрон-транспортных процессов с учетом ЦКБ и НФТ позволило нам описать вклад отмеченных выше факторов в кинетику фотоиндуцированных превращений Р₇₀₀ в листьях высших растений. На рис. 6 приведены результаты численных экспериментов, моделирующих влияние рН-зависимой регуляции ЦКБ и электронного транспорта между ФС2 и ФС1 на кинетику фотоиндуцированных редокс-превращений Р₇₀₀ (а), пластохинона (б), а также на изменения внутрилакоидного рН_in (в). Расчеты выполнены для начальных условий, соответствующих окисленному пулу пластохинона и избытку АDP. Вначале “включали” ДКС, возбуждающий преимущественно ФС1, а затем БС, возбуждающий обе ФС. Из рис. 6а видно, что функционирование цепи циклического транспорта электронов вокруг ФС1 несколько замедляет окисление Р₇₀₀ и PQ при действии ДКС. Заметно более сильное влияние циклического транспорта проявляется при действии БС. В случае, когда работает лишь цепь нециклического транспорта (кривые 1 и 2), происходит заметный спад [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] в ответ на включение БС. В этих условиях, когда циклический транспорт электронов пренебрежимо мал, кинетическая кривая имеет немонотонный вид с “провалом” в первое время после включения БС. Это обусловлено тем, что ЦКБ не активен в начальный период освещения, а потому отток электронов от ФС1 тормозит фотоокисление Р₇₀₀. По мере активации ЦКБ отток электронов от ФС1 усиливается, благодаря чему происходит рост [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$]. Интересно, что циклический транспорт электронов (кривые 3 и 4) способствует окислению Р₇₀₀ в условиях низкой активности ЦКБ. Это происходит вследствие того, что отток электронов от ФС1 облегчается из-за окисления Fd⁻ за счет работы цепи циклического транспорта электронов (ФС1 → Fd → PQ). Заметный вклад циклического транспорта четко проявляется в начальный период освещения БС, составляющий около 20 с (кривые 3 и 4). За счет перераспределения потоков на акцепторной стороне ФС1 провал на кинетической кривой ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ практически исчезает.

Рис. 6.

Кинетики фотоиндуцированных изменений относительных концентраций окисленных реакционных центров ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ (а), окисленного пластохинона PQ (б) и фотоиндуцированных изменений внутритилакоидного рН_in (в), расcчитанные с учетом различных условий электронного транспорта в интактных хлоропластах. Кривая 1 – контроль (без учета НФТ при низкой интенсивности циклического транспорта электронов вокруг ФС1), 2 – нефотохимическое тушение (максимальное ослабление активности ФС2 3 раза), 3 – циклический транспорт вокруг ФС1 (константа k_FQ увеличена в 10 раз по сравнению с кривыми 1 и 2), 4 – НФТ и циклический перенос электронов вокруг ФС1.

Форма кривой фотоокисления Р₇₀₀ зависит также от того, учтено ли в расчетах влияние НФТ. Генерация НФТ приводит к тому, что ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ достигает стационарного состояния быстрее, чем без НФТ, при этом устанавливается более высокий стационарный уровень ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ (кривая 2). Это связано с тем, что при НФТ приток электронов от ФС2 к ФС1 уменьшается, поскольку активность ФС2 ослабевает вследствие усиления рассеяния энергии в светособирающей антенне ФС2.

Кинетические кривые для концентраций окисленного пластохинона ([PQ]) показаны на рис. 6б. Первоначально практически все молекулы PQ находятся в окисленном состоянии, что характерно для хлоропластов, адаптированных к темноте. После включения БС происходит быстрое восстановление части пластохинонового пула. Учет НФТ и цепи циклического транспорта существенно влияет на кинетику фотоиндуцированных изменений [PQ] (кривые 2 и 4). Если НФТ неактивно (кривые 1 и 3), то пул пластохинона восстановлен более заметно вследствие замедления окисления PQH₂ из-за более сильного закисления люмена (рис. 6в). По сравнению с кинетикой фотоокисления ${\text{P}}_{{700}}^{{}}$, влияние НФТ на кинетику окислительно-восстановительных превращений пластохинона проявляется заметнее и приводит к повышению стационарного уровня PQ. Это объясняется тем, что PQ является акцептором электронов, донируемых ФС2, а НФТ ослабляет работу ФС2.

Динамика фотоиндуцированных изменений рН_in показана на рис. 6в. Интересно, что кинетика изменений pH_in практически не зависит от работы цепи циклического электронного транспорта вокруг ФС1 (ср. кривые 1 и 3). Это объясняется тем, что ЦЭТ влияет на перераспределение потоков на акцепторной стороне ФС1 во время индукционной фазы, но практически не затрагивает трансмембранные потоки протонов и работу АТР-синтазы. Как и следовало ожидать, в этом случае кинетические кривые, отражающие изменения pH_in (рис. 6в) и [АТР] (рис. 7б), практически не изменяются при наличии ЦЭТ вокруг ФС1. С другой стороны, кинетика закисления люмена чувствительна к НФТ. Если не работает механизм активации НФТ (кривые 1 и 3, рис. 6в), то происходит более сильное снижение pH_in, чем в случае генерации НФТ (кривые 2 и 4). Включение НФТ несколько ослабляет фотоиндуцированный спад pH_in, что отражается на кинетике фотоиндуцированных изменений переменных [${\text{P}}_{{700}}^{ + }$] и [PQ]. Кинетика фотоиндуцированных изменений переменной [ATP] также оказалась чувствительной к НФТ: стационарный уровень, отражающий баланс производства-потребления АТР оказался при этом на 20% ниже (кривые 2 и 4, рис. 7б).

Рис. 7.

Расчетные зависимости скорости переноса электронов между ФС2 и ФС1 (параметр $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$) от длительности действия белого света (а) и кинетические кривые, отражающие скорость производства-потребления АТР (б) с учетом факторов, влияющих на электронный транспорт; ослабление активности ФС2 вследствие усиления нефотохимического тушения возбуждения молекул хлорофилла в светособирающей антенне ФС2 и перераспределение электронных потоков между нециклическим и циклическими путями. Номера кривых соответствуют таковым на рис. 6. Для сравнения на панели (б) приведены расчетные кинетические кривые, моделирующие изменения [ATP] в хлоропластах класса Б в метаболических состояниях 3 и 4. Предполагается, что в состоянии 3 начальный уровень АТР составлял 10% от общей емкости пула нуклеотидов (ATP + ADP). В состоянии 4 синтез АТР не происходил, поскольку в этом случае было принято ΔpH = 0 (при pH_out = 8 = const).

На рис. 7а представлены результаты расчетов кинетического параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$, характеризующего скорость восстановления ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$, в зависимости от длительности действия БС на интактные хлоропласты. Зависимость $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ от длительности освещения показывает как скорость переноса электронов между ФС2 и ФС1 зависит от таких факторов регуляции электронного транспорта, как НФТ (кривые 2 и 4) и работа ЦЭТ вокруг ФС1 (кривые 3 и 4). Как и в случае хлоропластов класса Б, замедление потока электронов между ФС2 и ФС1 обусловлено снижением рН_in люмена. Если генерации НФТ не происходит, то поток электронов остается высоким в течение первых 10 с освещения, затем наступает торможение электронного переноса. По мере дальнейшего действия БС различие между скоростями переноса электронов к ${\text{P}}_{{700}}^{ + }$ становится незначительным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди процессов регуляции фотосинтетического транспорта электронов в хлоропластах особый интерес представляют регуляторные механизмы, связанные с фотоиндуцированными изменениями рН стромы и люмена. Изменение внутритилакоидного рН является одним из главных факторов, контролирующих поток электронов между ФС2 и ФС1. Фотоиндуцированное уменьшение pH_in вызывает замедление переноса электронов на участке ЦЭТ, связанном с b₆f-комплексом, и запускает механизм, способствующий увеличению рассеяния энергии в светособирающей антенне ФС2, препятствуя перевозбуждению реакционных центров ФС2 и чрезмерному закислению люмена. Эти механизмы обеспечивают стабильность работы фотосинтетического аппарата при изменении условий окружающей среды, например, при варьировании интенсивности освещенности и газового состава атмосферы [10–14].

Моделирование световых стадий фотосинтеза, учитывающее рН-зависимую регуляцию ключевых стадий фотосинтетического транспорта электронов, позволило адекватно описать ряд закономерностей сложной кинетики электрон-транспортных процессов в различных режимах работы хлоропластов. Показано, в частности, что многофазная кинетика фотоокисления Р₇₀₀ определяется сменой лимитирующей стадии: переключение потоков электронов на акцепторном участке ФС1 и торможение электронного переноса между ФС2 и ФС1 за счет закисления люмена. Модель описывает переходы между метаболическими состояниями хлоропластов, обусловленные изменениями фосфатного потенциала за счет работы мембранной АТР-синтазы. При активном синтезе АТР в интактных хлоропластах соотношение [ATP]/[ADP] меняется от начального значения 0.1 до 0.5. При этом кинетическая кривая, отражающая скорость производства-потребления АТР не изменяется при варьировании циклического транспорта (см. рис. 7б, кривые 1 и 3), однако она оказалась чувствительной к работе НФТ: стационарный уровень, отражающий баланс производства-потребления АТР понижается (см. рис. 7б, кривые 1 и 2).

Одним из показателей адекватности нашей модели могут быть результаты расчетов и их сравнение с экспериментальными данными по динамике изменений кинетического параметра $\tau _{{{1 \mathord{\left/ {\vphantom {1 2}} \right. \kern-0em} 2}}}^{{ - 1}}$ в зависимости от длительности освещения изолированных хлоропластов бобов (V. faba) класса Б и листьев китайской розы (H. rosa-sinensis) (ср. рис. 4 и 5). Как показали численные эксперименты, многофазная кинетика фотоокисления Р₇₀₀ отражает перераспределение электронных потоков между циклическим и нециклическим путями переноса электрона, обусловленное активацией ЦКБ вследствие защелачивания стромы, а также смену лимитирующей стадии в ЦЭТ, индуцированную уменьшением рН люмена. По мере снижения pH_in поток электронов между фотосистемами ослабевает, что вызвано замедлением скорости окисления пластохинола и ослаблением активности ФС2 вследствие НФТ.