Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 5, стр. 322-331

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет 1-го типа (СД1), для которого характерны острый дефицит инсулина и сильно выраженная гипергликемия, сопровождается дисфункциями мужской и женской репродуктивных систем, дефицитом половых стероидных гормонов, нарушениями гаметогенеза и фолликулогенеза. В результате этого нарушается половое поведение, снижается фертильность и возникает бесплодие. Основными причинами репродуктивных дисфункций являются нарушения в различных звеньях гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси, включая снижение секреции гонадолиберина, рилизинг-фактора лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормонов гипоталамическими нейронами, ослабление регуляторных эффектов гонадотропинов на гонады и ингибирование в них процессов стероидогенеза и гаметогенеза [1, 2]. Для коррекции нарушений в гонадной оси необходимы как системная терапия СД1 с помощью инсулина, так и применение подходов, восстанавливающих функции репродуктивной системы. В наибольшей степени для этого подходят гонадотропины, поскольку использование гонадолиберина после мощной активации продукции гонадотропинов на начальном этапе в дальнейшем приводит к ингибированию их синтеза и дефициту половых стероидных гормонов, а заместительная терапия стероидными гормонами по механизму обратной отрицательной связи подавляет активность всей гонадной оси. Однако применяемые в клинике препараты гонадотропинов имеют ряд серьезных недостатков, что обусловлено их гетерогенностью, низкой селективностью по отношению к внутриклеточным сигнальным каскадам, быстрым снижением чувствительности к ним тканей-мишеней. При этом обычно используемые рекомбинантные формы гонадотропинов, хотя и являются относительно гомогенными препаратами, но существенно отличаются от природных гормонов по посттрансляционным модификациям, в первую очередь, по паттерну N-гликозилирования, что модифицирует их активность. В то же время выделяемый из мочи хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), структурный и функциональный гомолог ЛГ, хотя и сохраняет структуру нативного ХГЧ, но содержит ряд нежелательных примесей [3].

Эффективность ЛГ и ХГЧ при коррекции репродуктивных функций и дефицита стероидных гормонов в условиях СД1 в значительной степени снижается, особенно при тяжелых и среднетяжелых формах заболевания [2, 4]. Одной из причин этого является снижение числа функционально активных рецепторов ЛГ/ХГЧ в репродуктивных тканях, а также нарушение передачи генерируемого гонадотропинами сигнала в клетках-мишенях вследствие усиления в них стресса эндоплазматического ретикулума, нарушения окислительно-восстановительного баланса и усиления активности факторов воспаления [5, 6]. Альтернативой ЛГ и ХГЧ являются низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ/ХГЧ, которые в отличие от гонадотропинов, с высоким сродством связывающихся с внеклеточным доменом, проникают в полость трансмембранного канала рецептора и специфично связываются с расположенным там аллостерическим сайтом. Наибольшие успехи достигнуты в разработке низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ, имеющих структуру производных тиенопиримидина [7–11]. Ранее нами было показано, что 5-амино-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид (ТП03) с активностью агониста рецептора ЛГ стимулирует ответственные за стероидогенез cAMP-зависимые каскады в клетках Лейдига и усиливает продукцию ими тестостерона в условиях in vitro, а также повышает уровень этого гормона при внутрибрюшинном и пероральном способах введения самцам крыс [11, 12]. Молекулярные механизмы действия гонадотропинов и ТП03 на системы клетки, компетентные к ЛГ и ХГЧ, характеризуются рядом отличий, обусловленных различными сайтами их связывания и аллостерическими влияниями [12, 13]. Вследствие этого их восстанавливающий эффект на дефицит стероидных гормонов при СД1 может существенно различаться. С целью проверки этого предположения, проведено сравнительное исследование, в рамках которого изучали стимулирующее влияние ТП03 и ХГЧ на активность аденилатциклазной системы в тестикулярных мембранах самцов крыс со среднетяжелой формой стрептозотоцинового СД1 в условиях in vitro, а также регуляторные эффекты ТП03 и ХГЧ на уровень тестостерона в крови и на экспрессию генов стероидогенных белков в семенниках диабетических крыс в условиях in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали самцов крыс Вистар (возраст 4–5 месяцев), которых содержали в стандартных условиях. Все эксперименты выполняли в строгом соответствии с требованиями Комитета по биоэтике ИЭФБ РАН и European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC). СД1 средней тяжести индуцировали у мышей однократным введением стрептозотоцина (в/б, 45 мг/кг). Развитие СД1 оценивали через 10 дней по уровню глюкозы в крови, отбирая крыс с постпрандиальным уровнем глюкозы выше 12 мМ. Концентрацию глюкозы измеряли в крови, взятой из хвостовой вены, с помощью тест-полосок “One Touch Ultra” (США). Контрольным животным вместо стрептозотоцина в том же объеме и в те же сроки вводили его растворитель – 0.1 М цитратный буфер (pH 4.5).

Через 5 недель после индукции СД1 часть диабетических животных (n = 5), декапитировали под наркозом, забирали у них ткани семенников и использовали их для выделения плазматических мембран и оценки функциональной активности аденилатциклазной системы. Параллельно те же процедуры проводили с контрольными животными (n = 5). Оставшиеся контрольные и диабетические крысы в течение 5 дней получали в 10.00 ХГЧ (Московский эндокринологический завод, Россия) в суточной дозе 100 МЕ/крысу (п/к) (группы КГ и ДГ, n = 5) или ТП03 в суточной дозе 15 мг/кг (в/б) (КТ и ДТ, n = 5). Контрольные (К, n=5) и диабетические крысы (Д, n = 5) без обработки ХГЧ и ТП03 вместо препаратов получали их растворители. В первый день эксперимента измеряли начальный уровень тестостерона (9.00) и оценивали его изменение через 1 (11.00), 3 (13.00) и 5 ч (15.00) после введения ХГЧ или ТП03, рассчитывая значения площади под кривыми “концентрация тестостерона (нМ) – время (ч)” (AUC). На пятый день оценивали уровень тестостерона через 3 ч после введения препаратов, декапитировали крыс под наркозом, забирали и взвешивали ткани семенников, которые далее использовали для оценки в них экспрессии целевых генов. В конце эксперимента в крови животных также оценивали уровни глюкозы, инсулина и лептина. Кровь забирали из хвостовой вены, концентрацию тестостерона определяли с помощью набора Тестостерон-ИФА (Алкор-Био, Россия), концентрацию инсулина и лептина – с помощью наборов Rat Insulin ELISA (Mercodia AB, Швеция) и ELISA Kit for Leptin (Cloud-Clone Corp., США).

Фракции плазматических мембран из семенников крыс выделялипроводили, как описано ранее [14]. Измельченные ткани семенников гомогенизировали при охлаждении на льду в 40 мМ Tрис-HCl-буфере (pH 7.5), содержащем 5 мМ MgCl₂, 10% сахарозу и ингибиторы протеаз, после чего гомогенат центрифугировали (1500 g, 10 мин). Супернатант центрифугировали (20 000 g, 30 мин), осадок ресуспендировали в том же буфере без сахарозы, снова центрифугировали в тех же условиях. Осажденные мембраны ресуспендировали в 40 мМ Tрис-HCl-буфере (pH 7.5) и использовали для определения активности АЦ. Активность АЦ измерение, как описано ранее [15], для чего использовали инкубационную смесь, включающую 50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ cAMP, 1 мМ ATP, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы (Sigma, США), 37 кБк [α-³²P]ATP (Всерегиональное объединение “Изотоп”, Россия). Реакцию начинали добавлением в пробу 50–100 мкг мембранного белка, проводили в течение 12 мин при 37°C, останавливали 100 мкл 0.5 M соляной кислоты, которую затем нейтрализовали имидазолом. Образовавшийся в результате ферментативной реакции [³²P]cAMP отделяли с помощью адсорбционной хроматографии на нейтральном оксиде алюминия. Радиоактивность измеряли на счетчике LKB 1209/1215 RackBeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль cAMP/мин/мг мембранного белка.

Для проведения количественной ПЦР в реальном времени из семенников крыс выделяли суммарную РНК, используя реагент ExtraRNA (аналог TRIZol) (Evrogen, Россия). Обратную транскрипцию проводили, используя набор MMLV RT Kit (Evrogen, Россия). Амплификационный сигнал детектировали с помощью прибора 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Экспрессию генов, кодирующих рецептор ЛГ (Lhr), StAR-белок (Star), цитохромы Р450_scc (Cyp11a1) и Р450-17α (Cyp17a1), дегидрогеназы 3β-HSD (Hsd3b) и 17β-HSD (Hsd17b), определяли с помощью следующих праймеров: Lhr – CTGCGCTGTCCTGGCC (For) и CGACCTCATTAAGTCCCCTGAA (Rev); Star – AAGGCTGGAAGAAGGAAAGC (For) и CACCTGGCACCACCTTACTT (Rev); Cyp11a1 – TATTCCGCTTTGCCTTTGAG (For) и CACGATCTCCTCCAACATCC (Rev); Hsd3b – AGGCCTGTGTCCAAGCTAGTGT (For) и CTCGGCCATCTTTTTGCTGTAT (Rev); Cyp17a1 – CATCCCCCACAAGGCTAAC (For) и TGTGTCCTTGGGGACAGTAAA (Rev); Hsd17b – CCTTTGGCTTTGCCATGAGA (For) и CAATCCATCCTGCTCCAACCT (Rev). В качестве рефересного использовали ген Actb, кодирующий β‑актин. Результаты анализировали с использованием метода ΔΔС_t. Значения RQ рассчитывали по отношению к контрольной группе.

Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Office Excel 2007 (“AtteStat 12.5” и “Daniel’s XL Toolbox 6.52”). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп – дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали различия при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В группе Д отмечали снижение массы тела, сильно выраженную гипергликемию, сниженные уровни инсулина и лептина, а также тенденцию к снижению массы семенников (табл. 1). У животных с СД1 продолжительностью 5 недель в течение промежутка времени от 9.00 до 15.00 уровень тестостерона в крови был статистически значимо снижен в сравнении с контролем. Значение AUC_9.00–15.00 для интегрированной площади под кривыми концентрация тестостерона (нМ)–время (ч) у крыс группы Д составило 34% от значения у контрольных животных (34 ± 9 усл.ед. в группе Д против 99 ± 28 усл.ед. в группе К, P = 0.001). Эти данные указывают на развитие отчетливо выраженного андрогенного дефицита у самцов крыс со среднетяжелой формой СД1.

В тестикулярных мембранах диабетических крыс базальная активность АЦ, а также активность, стимулированная 5’-гуанилилимидодифосфатом (ГИДФ), негидролизуемым аналогом GTP, и дитерпеном форсколином, составили 17 ± 2, 185 ± 11 и 84 ± 4 пмоль cAMP/мин/мг мембранного белка, соответственно, и эти показатели были ниже, чем в контроле, где они составили 25 ± 2, 249 ± 9 и 157 ± 6 пмоль cAMP/мин/мг мембранного белка (P < 0.05). Эти данные свидетельствуют об ослаблении каталитической активности АЦ, на что указывают снижение базальной активности и стимулирующего эффекта форсколина, действующего на каталитический сайт фермента, а также об ослаблении сопряжения АЦ с G_s-белком, о чем свидетельствует снижение стимулирующего АЦ эффекта ГИДФ. Еще более заметно снижались стимулирующие АЦ эффекты ХГЧ и ТП03 (рис. 1). Так, при СД1 значения AUC, представляющие собой интегрированную площадь под кривыми прирост активности АЦ (пмоль сAMP/мин/мг белка)–концентрация агониста(M), для АЦ эффектов ХГЧ и ТП03 составили 508 ± 62 и 478 ± 46 усл.ед., в то время как у контрольных крыс они были существенно выше – 1208 ± 64 и 809 ± 53 усл.ед. соответственно (P < 0.0001). Снижение AUC обусловлено не только уменьшением максимального стимулирующего АЦ эффекта агонистов, но и снижением их сродства к рецептору ЛГ/ХГЧ. Так в семенниках контрольных и диабетических крыс значения EC₅₀ для АЦ эффекта ХГЧ составили 0.207 ± 0.014 и 0.387 ± 0.056 нМ (P < 0.01), для АЦ эффекта ТП03 – 473 ± 80 и 1080 ± 227 нМ (P < 0.01).

Рис. 1.

Стимулирующий эффект ХГЧ и ТП03 на базальную активность АЦ в тестикулярных мембранах контрольных и диабетических крыс. 1 – Контроль, ХГЧ; 2 – диабет, ХГЧ; 3 – контроль, ТП03; 4 – диабет, ТП03. По оси ординат представлен прирост активности АЦ (пмоль сAMP/мин на 1 мг белка), по оси абсцисс – концентрация ХГЧ и ТП03 (M). Данные представлены как M ± SD, n = 5.

Однократная обработка контрольных и диабетических крыс ХГЧ и ТП03 приводила к повышению уровня тестостерона в крови, причем стероидогенный эффект обоих препаратов в группе Д был существенно ниже, чем в контроле, на что указывает снижение значений AUC_9.00-15.00 для кривых концентрация тестостерона (нМ)–время (ч) у диабетических крыс, обработанных ХГЧ и ТП03 (рис. 2). Значения AUC_9.00-15.00 в группах КГ и КТ составили 546 ± 105 и 224 ± 55 усл.ед., в то время как в группах ДГ и ДТ – 183 ± 39 и 117 ± 34 усл.ед, что на 66 и 48% ниже, чем в соответствующих контрольных группах. Уровни тестостерона во всех временных точках при обработке диабетических крыс ХГЧ и ТП03 статистически значимо отличались от значений в группах КГ и КТ, за исключением уровня гормона в группах КТ и ДТ через 1 ч после обработки ТП03 (рис. 2).

Рис. 2.

Стимулирующий эффект ХГЧ и ТП03 на уровень тестостерона в крови контрольных и диабетических крыс при однократном введении препаратов. К – Kонтроль; КГ – контроль + ХГЧ; КТ – контроль + + ТП03, Д – диабет; ДГ – диабет + ХГЧ; ДТ – диабет + + ТП03. * ‒ различия между группами К и Д, КГ и ДГ, КТ и ДТ статистически значимы при P < 0.05. Данные представлены как M ± SD, n = 5.

Обработка диабетических крыс с ХГЧ и ТП03 в течение 5 дней не влияла существенно на массу тела, уровни глюкозы, инсулина и лептина (табл. 1). Не выявлено влияния на эти показатели и обработки теми же препаратами контрольных животных (данные не представлены). Введение ХГЧ контрольным и диабетическим крысам приводило к статистически значимому повышению у них массы семенников. У контрольных крыс она повышалась в сравнении с необработанными животными на 12% (до 3.65 ± 0.13 г, P< 0.05 в сравнении с группой К), у диабетических крыс – на 13% (табл. 1). Обработка крыс с помощью ТП03 в небольшой степени повышала массу семенников у контрольных и диабетических крыс, но отличия от групп К и Д не были статистически значимыми.

У контрольных животных стимулирующий эффект ХГЧ на продукцию тестостерона в пятый день (через 3 ч после обработки) немного снижался в сравнении с первым днем, а эффект ТП03 не менялся (рис. 2, 3). В группе диабетических крыс, которых 5 дней обрабатывали ХГЧ, стероидогенный эффект гонадотропина менялся незначительно, оставаясь существенно ниже, чем в группе КГ. В группе с ТП03 стероидогенный эффект низкомолекулярного агониста, оцениваемый по приросту уровня тестостерона в сравнении с группой Д, повышался в среднем в 2 раза и становился сопоставимым с группой КТ (рис. 2, 3). Таким образом, в отличие от ХГЧ, стимулирующий эффект ТП03 на продукцию тестостерона при его длительном введении диабетическим крысам возрастал, что не наблюдали у контрольных животных, и это указывает на кумулятивность стероидогенного эффекта этого низкомолекулярного агониста в условиях СД1.

Рис. 3.

Уровни тестостерона через 3 ч после обработки контрольных и диабетических крыс ХГЧ и ТП03 в пятый день эксперимента. Различия между контролем и группами КГ и КТ (*), между группой Д и группами ДГ и ДТ (#), а также между группами КГ и ДГ (@) статистически значимы при P < 0.05. Данные представлены как M ± SD, n = 5.

На заключительном этапе в семенниках крыс, получавших в течение 5 дней ХГЧ и ТП03, оценивали экспрессию генов, кодирующих рецептор ЛГ (Lhr), транспортный белок StAR (Star), осуществляющий перенос холестерина в митохондрии (скорость-лимитирующая стадия стероидогенеза), цитохром Р450_scc (Cyp11a1), катализирующий конверсию холестерина в прегненолон, 3β-гидроксистероиддегидрогеназу 3β-HSD (Hsd3b), превращающую прегненолон в прогестерон, цитохром Р450-17α (Cyp17a1), превращающий прогестерон в 17-гидроксипрогестерон и далее в андростендион, и 17β-гидроксистероиддегидрогеназу 17β-HSD (Hsd17b), осуществляющую заключительную стадию синтеза тестостерона.

В семенниках крыс с СД1 экспрессия генов Lhr и Star в сравнении с контрольными животными статистически значимо снижалась, в то время как экспрессия генов, кодирующих ферменты стероидогенеза, существенно не менялась (рис. 4). Обработка ХГЧ здоровых крыс снижала экспрессию генов Lhr и Hsd17b и при этом в значительной степени повышала экспрессию других изученных генов. В условиях СД1 стимулирующий эффект ХГЧ на экспрессию генов Star, Cyp11a и Cyp17a сохранялся, но был выражен в меньшей степени, чем в контроле, в то время как эффект ХГЧ на экспрессию гена Hsd3b усиливался с 62 до 240%. При этом в группе ДГ не выявлено ингибирующего эффекта ХГЧ на экспрессию гена дегидрогеназы 17β-HSD, которая сохранялась на контрольном уровне. Необходимо отметить, что в группе ДГ экспрессия гена Lhr в значительной степени подавлялась ‒ до 11 и 16% от уровня в группах К и Д (рис. 4).

Рис. 4.

Экспрессия генов Lhr, Star, Cyp11a, Hsd3b, Cyp17a и Hsd17b в семенниках контрольных и диабетических крыс и влияние пятидневной обработки ХГЧ и ТП03. К – Kонтроль; КГ – контроль + ХГЧ; КТ – контроль + ТП03, Д – диабет; ДГ – диабет + ХГЧ; ДТ – диабет + ТП03. Различия между контролем и другими группами (*), между группой Д и группами ДГ и ДТ (#), а также между группами КГ и ДГ или КТ и ДТ (@) статистически значимы при P < 0.05. Данные представлены как M ± SD, n = 5.

Обработка ТП03 контрольных крыс повышала экспрессию генов, кодирующих белок StAR и цитохром Р450-17α, слабо влияя на другие ферменты стероидогенеза. При этом ТП03 в 2.5 раза повышал экспрессию гена Lhr, вызывая эффект, противоположный таковому ХГЧ. В группе ДТ также не выявлено снижения экспрессии гена Lhr, которая имела тенденцию к повышению и не отличалась от этого показателя в группе К (рис. 4). При СД1 стимулирующие эффекты ТП03 на экспрессию генов Star и Cyp17a снижались, но статистически значимые отличия от групп Д и К отмечены только для гена Star. В то же время в группе ДТ значимо повышалась экспрессия гена Hsd3b (рис. 4). Таким образом, изменения экспрессии генов стероидогенеза при обработке контрольных и диабетических крыс ХГЧ и ТП03 в значительной степени зависят от природы агониста рецептора ЛГ/ХГЧ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Дефицит андрогенов у мужчин при СД1 влечет за собой ослабление репродуктивных функций, что выражается в снижении либидо, нарушении сперматогенеза и, в конечном итоге, приводит к бесплодию [1, 2]. Применение ЛГ и ХГЧ не может в полной мере компенсировать сниженную при СД1 продукцию половых стероидных гормонов. Это обусловлено ослаблением ответа семенников на гонадотропины с ЛГ-активностью в условиях СД1, как это показано при лечении пациентов с СД1 препаратами ХГЧ [16, 17]. Ранее нами в экспериментах in vitro выявлено снижение стимуляции гонадотропинами АЦ в тестикулярных мембранах крыс со стрептозотоциновыми моделями СД1 и СД2, а также ослабление стероидогенного ответа на ХГЧ у крыс с различными по тяжести формами стрептозотоцинового СД1 [18, 19].

В рамках предпринятого исследования при изучении функциональной активности ЛГ-компетентной аденилатциклазной системы в тестикулярных мембранах семенников диабетических крыс обнаружено значительное снижение ответа АЦ на стимуляцию ХГЧ и ТП03 в условиях среднетяжелого СД1. При этом снижался как максимальный АЦ-стимулирующий эффект гонадотропина и ТП03, так и их сродство к рецептору, оцениваемое по значениям EC₅₀ для АЦ эффектов. Это указывает на ослабление передачи генерируемого ХГЧ и ТП03 сигнала с рецептора ЛГ/ХГЧ к АЦ в условиях диабетической патологии. Обнаружено также, что в тестикулярных мембранах диабетических крыс снижается стимуляция АЦ негидролизуемым аналогом GTP (ГИДФ), что свидетельствует о нарушении функционального взаимодействия G_s-белка, ключевого компонента сигнального пути ЛГ/ХГЧ, с ферментом АЦ. Установлено, что функциональная активность АЦ и нижележащих cAMP-зависимых эффекторных белков, в том числе cAMP-активируемого транскрипционного фактора CREB, играет определяющую роль в реализации стероидогенных эффектов гонадотропинов в клетках Лейдига, поскольку через аденилатциклазную сигнальную систему осуществляется регуляции активности и экспрессии транспортного белка StAR, контролирующего процесс переноса холестерина в митохондрии, где осуществляются начальные стадии стероидогенеза, а также регулируется экспрессия ряда других стероидогенных белков [20, 21]. Вследствие этого, выявленное нами ослабление передачи генерируемого ХГЧ и ТП03 сигнала через рецептор ЛГ/ХГЧ может быть одной из ключевых причин андрогенного дефицита, характерного для пациентов и экспериментальных животных с СД1.

Одними из причин снижения активности рецептора ЛГ/ХГЧ и его сродства к ХГЧ может быть изменение паттерна гликозилирования рецептора в условиях продолжительной и сильно выраженной гипергликемии, а также нарушение его посттрансляционного процессинга в условиях повышения содержания активных форм кислорода и ослабления системы антиоксидантной защиты в семенниках. В этой связи необходимо отметить, что в условиях диабетической патологии в семенниках в значительной степени усиливаются процессы воспаления, окислительный стресс и стресс эндоплазматического ретикулума [5, 6, 22]. Определенный вклад в ослабление функций рецептора ЛГ/ХГЧ может вносить и снижение его экспрессии в семенниках. Однако, несмотря на статистически значимые отличия от контроля, снижение экспрессии гена Lhr в семенниках диабетических крыс было не очень значительным и, по нашему мнению, не может быть определяющей причиной снижения чувствительности АЦ тестикулярных мембран диабетических животных к гонадотропину. Однако полностью исключать этот фактор нельзя, поскольку имеются данные о снижении эффективности связывания гонадотропинов с рецепторами ЛГ/ХГЧ в семенниках крыс со стрептозотоциновой моделью тяжелой формы СД1 [23].

Показанное нами ослабление стероидогенного ответа семенников на ХГЧ в условиях in vivo может быть обусловлено не только нарушением функций ЛГ-компетентной аденилатциклазной системы, но и ослаблением активности и экспрессии стероидогенных белков. Мы показали, что в наибольшей степени при СД1 снижается экспрессия гена, кодирующего белок StAR, ключевой для стероидогенной функции. Ранее китайские ученые показали, что в клетках Лейдига в условиях сильно выраженной гипергликемии и повышения содержания конечных продуктов гликирования снижается не только экспрессия гена Star, но и генов Cyp11a1 и Hsd3b, кодирующих цитохром Р450_scc и дегидрогеназу 3β-HSD [22], которая в нашем случае, однако, менялась незначительно. С этими изменениями они связывают ослабление ответа клеток Лейдига на обработку ХГЧ, не исследуя функциональную активность самой ЛГ-компетентной сигнальной системы.

Низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ/ХГЧ в отличие от гонадотропинов связываются с расположенным в трансмембранном канале аллостерическим сайтом. Имеются основания полагать, что в отличие от высокоаффинного ортостерического сайта, который является мишенью для гонадотропинов и локализован в значительном по размеру внеклеточном домене, характеристики связывания аллостерического сайта не столь чувствительны к нарушениям посттрансляционных модификаций рецептора и его гипергликозилированию в условиях СД1. Необходимо также отметить, что тиенопиримидиновые производные, в том числе разработанное нами гидрофобное соединение ТП03, легко проникают через плазматическую мембрану в цитоплазматическое пространство клетки. Внутри клетки они способны связываться с еще “незрелыми” рецепторами ЛГ/ХГЧ и стабилизировать их активную конформацию, облегчая транслокацию в плазматическую мембрану и функционируя как низкомолекулярные шапероны рецепторных молекул [8].

Нами показано, что при введении диабетическим крысам ТП03 в полной мере сохраняет способность стимулировать продукцию тестостерона и интратестикулярную экспрессию генов стероидогенных белков. Этот эффект обусловлен особенностями активации тиенопиримидиновыми производными рецептора ЛГ/ХГЧ и шапероноподобной активностью, присущей этим соединениям [7–9, 12, 13]. Необходимо подчеркнуть, что в группе ДТ уровень экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛГ/ХГЧ, был значимо ниже, чем в группе КТ, в то время как стероидогенный эффект ТП03 в этих группах был сопоставимымым (рис. 3, 4). Эти данные свидетельствуют о том, что ТП03 в условиях СД1 запускает молекулярные механизмы, позволяющие повысить эффективность стимуляции рецептора ЛГ/ХГЧ даже при отсутствии стимуляции экспрессии этого рецептора, как это происходит в группе КТ.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что низкомолекулярный агонист ТП03 можно рассматривать как эффективный стимулятор синтеза тестостерона при тяжелых формах СД1 с характерной для этого заболевания сильно выраженной андрогенной недостаточностью и нарушениями репродуктивных функций. Необходимо подчеркнуть, что пациенты с СД2 и метаболическим синдромом также часто имеют признаки гипогонадизма и дефицит стероидогенной функции яичек [24]. Среди причин репродуктивных дисфункций при этих метаболических расстройствах важную роль играют инсулиновая и лептиновая резистентность, негативно влияющая на чувствительность клеток Лейдига к гонадотропинам с ЛГ-активностью [25]. Вследствие этого низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ/ХГЧ в перспективе могут использоваться и для коррекции андрогенного дефицита, и лечения ассоциированного с ним бесплодия у пациентов с СД2 и метаболическим синдромом.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 19-75-20122).