Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 1, стр. 45-52

ВВЕДЕНИЕ

Na⁺,K⁺-ATP-аза – ATP-аза Р-типа, осуществляющая обмен трех ионов внутриклеточного натрия на два иона внеклеточного калия против электрохимического градиента. В состав фермента входят как минимум два типа субъединиц: каталитическая α- и регуляторная β-субъединица с молекулярными массами ~100 кДа и ~55–65 кДа соответственно. В ходе катализа фермент пребывает в двух основных конформациях (Е1 и Е2), которые обладают разным сродством к ионам натрия и калия. Для Е1-конформации характерно более высокое сродство к Na⁺, для Е2 – к K⁺. Процесс катализа сопряжен с переносом концевой фосфорильной группы ATP на консервативный остаток аспарагиновой кислоты активного центра фермента в конформации Е1 (с образованием Е1-Р) с последующим переходом в конформацию Е2-Р и дефосфорилированием фермента, индуцированным связыванием фермента с внеклеточным K⁺. Эти процессы сопряжены с переносом катионов через мембрану [1, 2].

Каталитическая α-субъединица Na⁺,K⁺-ATP-азы представлена четырьмя изоформами (α1–α4). α1-изоформа экспрессируется во всех типах клеток, экспрессия остальных изоформ тканеспецифична [3]. В почках млекопитающих обнаружена только α1-изоформа. Изоформы α-субъединицы различаются по сродству к АТР, ионам-активаторам и специфическому ингибитору – уабаину, принадлежащему к классу кардиотонических стероидов (КТС) [4]. В клетках грызунов экспрессируется резистентная к КТС α1-изоформа (α1R) Na⁺,K⁺-ATP-азы, сродство которой к этим ингибиторам снижено в 1000 раз по сравнению с α1-чувствительной (sensitive) изоформой Na⁺,K⁺-ATP-азы (α1S), обнаруженной в клетках других млекопитающих. Это различие обусловлено заменой в α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азе двух аминокислотных остатков: глутамина и аспарагина в позициях 111 и 122 на остатки аргинина и аспарагиновой кислоты в α1R-Na⁺,K⁺-ATP-азе [5].

Среди КТС, в состав которых входит стероидное ядро и лактоновое кольцо в 17-м положении, выделяют две основных группы: карденолиды, которые содержат 5-ти членный лактон, и буфадиенолиды, содержащие 6-ти членный лактон. Большинство карденолидов в 3-м положении стероидного ядра содержат остатки сахаров, буфадиенолиды часто представляют собой агликоны [4]. Карденолиды в значительных количествах содержатся в растениях, тогда как буфадиенолиды – у земноводных (в основном в слизи тропических жаб). Недавно было обнаружено, что в небольших количествах КТС синтезируются в организмах млекопитающих, включая человека [6, 7].

КТС не только ингибируют Na⁺,K⁺-ATP-азу, но, связавшись с ферментом, индуцируют различные сигнальные пути за счет связывания с Na⁺,K⁺-ATP-азой белков-партнеров. Таким путем (независимо от ингибирования фермента) уабаин вызывает смерть эпителиальных клеток почек собаки (линия C7-MDCK) [8, 9]. Это сопровождается фосфорилированием р38 MAPK [8]. Однако у грызунов уабаин не вызывает смерти клеток в концентрациях, которые полностью подавляют активность Na⁺,K⁺-ATP-азы, при этом активируется другая MAPK - ERK½. Экспрессия в клетках грызунов только α1-чувствительной изоформы Na⁺,K⁺-ATP-азы приводит к смерти клеток под действием уабаина. Эти данные позволили предположить, что особенности в аминокислотной последовательности α1S- и α1R-изоформ Na⁺,K⁺-ATP-азы определяют различия в конформациях фермента и, соответственно, приводят к связыванию с ними различных белков, индуцируя в клетках грызунов и других млекопитающих различные сигнальные каскады, один из которых приводит к смерти клеток, а другой, напротив, к их выживанию [10]. До настоящего времени в литературе не описано различий в конформации α1S- и α1R-изоформ Na⁺,K⁺-ATP-азы при связывании с КТС.

Протеолиз является широко используемым методом анализа общей структуры и конформации белков. В случае Na⁺,K⁺-ATP-азы для этих целей часто используют трипсин, поскольку он расщепляет только α-субъединицу фермента, не затрагивая ее β-субъединицу [11]. Поэтому после обработки фермента трипсином обнаруживаются только пептидные фрагменты α-субъединицы.

Классическая картина трипсинолиза α-субъединицы была описана Питером Йоргенсеном (Peter Jørgensen) [12]. В конформации Е1 трипсин осуществляет быстрый протеолиз пептидной связи перед Lys30 и более медленный перед Arg262. В результате происходит накопление большого протеолитического фрагмента с молекулярной массой около 77 кДа и минорных фрагментов. При трипсинолизе α-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы в конформации E2 трипсин обеспечивает накопление полипептидов с молекулярной массой 58 и 41 кДа. При длительном протеолизе (30–60 мин) обеих конформаций фермента наблюдается накопление фрагментов с молекулярной массой 44, 37, 23 и 15 кДа [13–15]. Эти эксперименты были проведены на препаратах Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек кролика, собаки и свиньи при соотношении трипсин/Na⁺,K⁺-ATP-аза = 1/25 или 1/20.

Цель настоящей работы заключается в доказательстве существования различий в конформации чувствительной и резистентной α1R- и α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы, которые индуцируются связыванием трех КТС: двух кардиенолидов (уабаин, дигоксин) и одного буфадиенолида (маринобуфагенин). В качестве метода исследования мы использовали ограниченный протеолиз α1-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы, поскольку известно, что изменение конформации может сопровождаться экспозицией или маскировкой участков протеолиза, доступных трипсину [13].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы. Трипсин бычий и ингибитор трипсина из плодов сои были куплены у фирмы ПанЭко (Россия). Остальные реактивы были поставлены компанией Sigma (США), ThermoScientific (США), Bio-Rad (США).

Выделение фермента. Na⁺,K⁺-ATP-азу из наружного медуллярного слоя почек свиньи и почек крысы получали в соответствии с методами, описанными ранее [16, 17]. Конечный осадок ресуспендировали в растворе, содержащем 25 мМ имидазола (рН 7.5), 1 мМ EDTA, 0.25 М сахарозы, до концентрации белка 5–10 мг/мл, после чего суспензию разливали в пробирки по 20–50 мкл и хранили в замороженном состоянии при –80°С.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли по методу Лоури и соавторов [18]. Для растворения мембранных белков вместо воды добавляли 0.1% раствор дезоксихолата натрия. В качестве стандарта использовали коммерческий раствор бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2 мг/мл (ThermoScientific, США).

Определение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы. Активность Na⁺,K⁺-ATP-азы в полученных препаратах определяли по методу Ратбуна и Бетлах [19], измеряя накопление неорганического фосфата в среде следующего состава: 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ MgCl₂, 3 мМ ATP, 30 мМ имидазола (рН 7.4). Концентрация белка составляла 1–5 мкг/мл. Реакцию начинали внесением АТР в пробу. Более подробно этот метод описан нами ранее [20].

Трипсинолиз. Трипсинолизу подвергали Na⁺,K⁺-ATP-азу из почек свиньи и почек крысы, которую предварительно переводили в Е1 или Е2-Р конформацию. Для этого фермент разводили в 20 раз в буфере А (Е1-конформация) или буфере Б (Е2-Р- конформация). Состав буфера А: 10 мМ NaCl, 30 мМ имидазола, 1 мМ EDTA (рН 7.4); состав буфера Б: 30 мМ имидазола, 1 мМ EDTA, 3 мМ MgCl₂, 3 мМ P_i/Трис (рН 7.4). Далее фермент преинкубировали 10 мин при температуре 37°С с 1 мМ уабаина, дигоксина или маринобуфагенина. Трипсинолиз проводили в течение 5 или 10 мин при температуре 37°С. Соотношение трипсин/Na⁺,K⁺-ATP-аза (w/w) составляло 1/10. Протеолиз останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов в 2-х кратном избытке по отношению к трипсину (w/w). Затем проводили анализ триптических фрагментов методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS).

Электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в 6% концентрирующем и в 12% разделяющем ПААГ в присутствии SDS по методу Лэммли [21]. Белки на геле окрашивали Кумасси G-250. Образцы готовили на 4-х кратном буфере, содержащем 250 мМ Трис-HCl (рН 6.8), 8% SDS, 40% сахарозу и бромфеноловый синий, затем прогревали в течение 15 мин при 50°С. Электрофорез проводили при силе тока: 25мА на одно стекло в концентрирующем геле и 50мА на одно стекло в разделяющем геле. Полученные гели сканировали и обрабатывали (денситометрировали фрагменты протеолиза) с помощью программного пакета TotalLab TL120.

Статистические различия. Статистические различия определяли с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (One Way ANOVA), различия считали статистически значимыми при р < 0.01.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Препараты Na⁺,K⁺-ATP-азы, использованные в нашей работе, были получены из медуллярного слоя почек свиньи и крысы. Активность препаратов Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи и крысы составляла 1800–2000 и 500–800 мкмоль Ф_н/(мг белка в ч) соответственно при 37°C. Эта активность полностью ингибировалась высокими концентрациями уабаина (1 мМ для фермента из почек свиньи и 5 мМ для фермента из почек крысы).

На гелях, полученных после проведения электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, препаратов из почек свиньи и крысы обнаруживается белковая полоса с подвижностью, соответствующей белку молекулярной массой около 100 кДа (рис. 1а, 3а) и размытая полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 55–65 кДа. Белок с молекулярной массой 100 кДа, обнаруженный в обоих препаратах, при иммуноблоттинге окрашивался специфическими антителами против α1-субъединицы (не показано). Это позволяет нам идентифицировать эти белки как α- и β-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы. В препарате Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи обнаруживаются и другие белки, общее содержание которых, рассчитанное по интенсивности окрашивания Кумасси G-250, не превышало 15%.

Рис. 1.

Результаты трипсинолиза α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи в конформации Е1 в присутствии КТС (1 мМ). Время трипсинолиза 5 мин при 37°С. Соотношение Na⁺,K⁺-ATP-аза/трипсин 10/1. а – Результаты разделения препарата белков и протеолитических фрагментов α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. На дорожки нанесены: 1 – исходный препарат Na⁺,K⁺-ATP-азы (7.7 мкг); 2 – трипсин и ингибитор трипсина; 3 – Na⁺,K⁺-ATP-аза и трипсин; 4 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–уабаин и трипсин; 5 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–дигоксин и трипсин; 6 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–маринобуфагенин и трипсин. б – Интенсивность окрашивания белковых полос, соответствующих α1-субъединице Na⁺,K⁺-ATP-азы и ее пептидных фрагментов с молекулярной массой 40 и 35.5 кДа. Представлены результаты трех экспериментов, показаны стандартные отклонения; * – p < 0.01.

В препарате из почек крысы присутствовал также белок с молекулярной массой около 130 кДа. Наши попытки удалить его из препарата путем внесения модификаций в процедуру выделения не привели к успеху. Мы проанализировали белки этой полосы с использованием метода хромато-масс-спектрометрии (LC/MS) и обнаружили пептидные фрагменты трех белков: α-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы, аланиламинопептидазы и мембранной аланиламинопептидазы. При обработке фермента трипсином количество белка в этой полосе уменьшалось незначительно (рис. 3), таким образом, его протеолиз не изменял общую картину трипсинолиза α-субъединицы.

В нашей работе соотношение трипсин/Na⁺,K⁺-ATP-аза (w/w) составляло 1/10, а время инкубации с трипсином – 5 мин. Это обусловлено тем, что связывание КТС значительно увеличивает скорость трипсинолиза [17].

На рис. 1 представлены данные электрофоретического анализа продуктов трипсинолиза, полученных из α1S-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы почек свиньи в конформации Е1 (соотношение трипсин/Na⁺,K⁺-ATP-аза 1/10, 5 мин при 37°С). Видно, что интенсивность окрашивания α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы (~100 кДа) после протеолиза существенно снижается (дорожки 1 и 3). При этом образуется пептидный фрагмент с молекулярной массой около 40 кДа и небольшое количество пептидного фрагмента с молекулярной массой 35.5 кДа. В небольших количествах появляются еще два пептидных фрагмента с молекулярными массами около 23 и 19 кДа, которые отсутствовали в препарате фермента до протеолиза.

Преинкубация фермента из почек свиньи с уабаином и дигоксином в концентрациях, полностью ингибирующих Na⁺,K⁺-ATP-азу (1 мМ), приводит к существенному и практически одинаковому снижению количества α1S-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы и увеличению количества полипептидного фрагмента с молекулярной массой около 40 кДа. В то же время в результате преинкубации Na⁺,K⁺-ATP-азы с карденолидами уабаином и дигоксином существенно возрастает количество белка с молекулярной массой 35.5 кДа. Этот белок не обнаруживается после преинкубации фермента с буфадиенолидом маринобуфагенином и последующего трипсинолиза (рис. 1а, дорожка 6). Таким образом, в присутствии карденолидов на поверхности белка экспонируется дополнительный участок расщепления полипептидной цепи трипсином, который недоступен для протеолиза, если фермент преинкубирован с маринобуфагенином. Это означает, что конформация α-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы после ее связывания с уабаином и дигоксином отличается от конформации, индуцированной связыванием маринобуфагенина.

На рис. 2 представлены результаты, полученные при электрофоретическом разделении продуктов протеолиза α1-субъединицы Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи в конформации Е2-Р (условия трипсинолиза такие же, как на рис. 1). В результате протеолиза в отсутствие КТС наблюдается уменьшение количества α1-субъединицы, увеличивается количество продуктов протеолиза с молекулярной массой 40 кДа и 35.5 кДа. Но преинкубация с любым из исследуемых кардиотонических стероидов приводит к появлению большого количества дополнительного фрагмента с молекулярной массой 45 кДа. Это показывает, что в конформации Е2-Р связывание любого из кардиотонических стероидов обеспечивает одинаковое изменение конформации α1-субъединицы фермента.

Рис. 2.

Результаты трипсинолиза α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи в конформации Е2-Р в присутствии КТС (1 мМ). Время трипсинолиза 5 мин при 37°С. Соотношение Na⁺,K⁺-ATP-азы/трипсин 10/1. а – Результаты разделения препарата белков и протеолитических фрагментов α1S-Na⁺,K⁺-ATP-азы методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. На дорожки нанесены: 1 – трипсин и ингибитор трипсина; 2 – исходный препарат Na⁺,K⁺-ATP-азы (7.7 мкг); 3 – Na⁺,K⁺-ATP-аза и трипсин; 4 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–уабаин и трипсин; 5 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–дигоксин и трипсин; 6 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–маринобуфагенин и трипсин. б – Интенсивность окрашивания белковых полос, соответствующих α1-субъединице Na⁺,K⁺-ATP-азы и ее пептидных фрагментов с молекулярной массой 45 и 40 кДа. Представлены результаты трех экспериментов, показаны стандартные отклонения; * – p < 0.01.

Рис. 3.

Результаты трипсинолиза α1R-Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек крысы в конформации Е1 (а) и в конформации Е2-Р (б) в присутствии КТС. Время трипсинолиза 5 мин при 37°С. Соотношение Na⁺,K⁺-ATP-аза/трипсин 10/1. Результаты разделения препарата белков и протеолитических фрагментов α1R-Na⁺,K⁺-ATP-азы методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. На дорожки нанесены: 1 – трипсин и ингибитор трипсина; 2 – исходный препарат Na⁺,K⁺-ATP-азы (7.7 мкг); 3 – Na⁺,K⁺-ATP-аза и трипсин; 4 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–уабаин и трипсин; 5 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–дигоксин и трипсин; 6 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–маринобуфагенин и трипсин; 7 – комплекс Na⁺,K⁺-ATP-аза–уабаин и трипсин. Концентрация кардиотонических стероидов при преинкубации α1R-Na⁺,K⁺-ATP-азы с уабаином, дигоксином и маринобуфагенином на дорожках 4–6 – 1 мМ, на дорожке 7 – 10 мМ.

При протеолизе α1R- Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек крысы в конформации Е1 и Е2-Р мы наблюдали образование фрагментов с молекулярными массами 40 кДа и не обнаружили появления фрагментов с молекулярной массой 35.5 кДа. Преинкубация фермента с любым кардиотоническим стероидом не изменяла набора продуктов протеолиза и их молекулярной массы в случае пребывания фермента в обеих конформациях (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами данные по протеолизу α1R-Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи отличаются от данных, полученных ранее другими авторами: мы обнаружили, что под действием трипсина α-субъединица расщепляется с получением в основном фрагмента с молекулярной массой 40 кДа и небольших количеств пептидных фрагментов с молекулярной массой 35.5 кД, 23 и 19 кДа (причем в количественном отношении преобладает фрагмент с молекулярной массой около 40 кДа). Другие авторы сообщают о получении фрагментов с молекулярными массами 44, 37, 23 и 15 кДа. Однако различия в 3–4 кДа в величине молекулярных масс белков, определенных по электрофоретической подвижности, находятся в пределах ошибки самого метода. Поэтому можно полагать, что получены те же самые полипептиды, о которых сообщали другие авторы [13–15]. Доказать, что наши результаты не отличаются от результатов предшественников, можно лишь путем определения N-концевой последовательности этих пептидов, однако это не являлось целью нашего исследования. Более того, эти авторы не идентифицировали указанные фрагменты таким способом.

В результате нашей работы установлено, что при протеолизе Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи в конформации Е1 (но не Е2-P) образуется статистически значимое количество пептида с молекулярной массой около 35.5 кДа только в том случае, если с ферментом связаны карденолиды уабаин или дигоксин, но не буфадиенолид маринобуфагенин. В присутствии маринобуфагенина этот фрагмент при трипсинолизе вообще не образуется. Это позволяет считать, что маринобуфагенин при связывании с Na⁺,K⁺-ATP-азой (по крайней мере, в Е1-конформации) обеспечивает создание конформации, отличной от таковой, что создается в присутствие уабаина и дигоксина. Это согласуется с другими нашими данными, полученными на клеточной культуре MDCK [22]. Ранее мы показали, что уабаин индуцирует смерть клеток эпителия почек при значительно более низкой концентрации, чем маринобуфагенин. Возможно, это обусловлено тем, что маринобуфагенин, связываясь с Na⁺,K⁺-ATP-азой не способен создавать конформацию необходимую для связывания с белком-партнером, который индуцирует сигнальный каскад, приводящий к гибели клетки.

Также нами установлено отсутствие различий в продуктах протеолиза, полученных после трипсинолиза комплекса Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек крысы со всеми тремя исследованными КТС, как в конформации Е1, так и в конформации Е2-P. Эти данные показывают, что α1S- и α1R-изоформы фермента различаются не только по их чувствительности к КТС, но и по их способности переходить вследствие связывания КТС в конформацию, которая характерна для Na⁺,K⁺-ATP-азы из почек свиньи и, по-видимому, необходима для связывания нужного белка-партнера. Именно по этой причине α1S- и α1R-изоформы Na⁺,K⁺-ATP-азы после их связывания с КТС способны, по-видимому, инициировать различные сигнальные каскады.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-34-00308.