Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 2, стр. 152-160

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на большие успехи в изучении процессов канцерогенеза, в разработке новых высокоэффективных лекарственных препаратов и методов ранней диагностики различных опухолей, темпы снижения онкологической летальности до сих пор не достаточны. По этой причине поиск новых противораковых средств остается актуальной задачей современной фармакохимии.

Особый интерес в этой связи представляют алкоксиамины. В определенных условиях эти соединения способны продуцировать свободные радикалы, которые могут быть использованы для индукции окислительного стресса в опухолевых клетках. В частности, оксимы дициклогексилкарбамимидоила могут при температурах выше 80°С запускать радикальную полимеризацию [1]. Таким образом, встает вопрос о выборе химического скаффолда, который может быть использован для дальнейшей модификации оксимов дициклогексилкарбамимидоила с целью снижения температуры образования свободных радикалов при разработке противораковых препаратов. При выборе стратегии химической модификации также следует учесть и сведения о биологической активности близкородственных веществ. В частности, N,N'-дициклогексил-4-морфолинкарбоксамидин является селективным блокатором почечных ATP-чувствительных K⁺-каналов и может быть использован в качестве перорального калийсберегающего мочегонного средства [2]. Пралидоксим, тримедоксим, HI-6, обидоксим и метоксим (производные пиридинальдоксимов) применяются в качестве антидотов при поражении нервно-паралитическими ядами и пестицидами, поскольку реактивируют фосфорилированную ацетилхолинэстеразу и используются для восстановления нервно-мышечной передачи [3]. WIN 64338 является первым непептидным антагонистом рецептора брадикинина В2 [4, 5].

Необходимым этапом на пути создания современного фармакологического средства является изучение его взаимодействия с клеточной мембраной как первичной мишенью действия любых экзогенных соединений. При разработке противораковых препаратов, действующих путем индукции окислительного стресса, необходимо исключить возможность влияния пролекарства, предшественника свободных радикалов, на свойства мембран, а также обеспечить избирательность действия соединения на опухолевые клетки. Клеточные мембраны – это сложноорганизованные структуры, поэтому для изучения влияния на них различных экзогенных соединений во многих случаях целесообразно использовать модельные системы, плоские липидные бислои и липосомы.

Целью работы являлось исследование механизмов взаимодействия дициклогексилсодержащих производных О-иминоизомочевины с бислойными липидными мембранами. Химическая структура тестируемых соединений представлена в табл. 1. Полученные результаты расширяют представления о влиянии молекул-предшественников свободных радикалов на свойства модельных и биологических мембран. Эти результаты имеют важное значение для оценки перспектив использования этих структурных матриц для дальнейшей химической модификации дициклогексилсодержащих производных О-иминоизомочевины при разработке противораковых препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали: 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ), 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфо-1'-rac-глицерин (ПОФГ), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-1'-rac-глицерин (ДПФГ), KCl, KOH, HEPES, диметилсульфоксид (ДМСО), EDTA, тритон Х-100, кальцеин, пентан, этанол (Sigma-Aldrich).

Синтез соединений 1–3. Оксимы 1–3 синтезированы в Университете Марселя совместно с Санкт-Петербургским государственным педиатрическим медицинским университетом согласно методике [6]. Структура и состав полученных соединений были доказаны с помощью масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Формирование плоских липидных бислоев и регистрация токов, протекающих через модельные мембраны. Формирование бислойных липидных мембран проводили по методу Монтала и Мюллера [7]. Плоские липидные бислои формировали из ПОФХ или ПОФГ. Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе разделяемых мембраной водных растворов электролита (0.1 M KCl, 5 мМ HEPES-KOH, рН 7.4). Тестируемые соединения 1, 2 и 3 добавляли из раствора в ДМСО (78 мМ, 104 мМ, 150 мМ соответственно) в цис-отсек камеры до конечной концентрации 1.5, 1.6 и 2.0 мМ. Для каждой системы “агент–липидный бислой” было проведено не менее трех независимых экспериментов (повторов).

Измерения и оцифровку трансмембранных токов проводили в режиме фиксации потенциала с помощью усилителя Axopatch 200B и аналого-цифрового преобразователя Digidata 1440A (Axon Instrument, США). Для обработки данных использовали 8-полярный фильтр Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) и частоту фильтрации 1 кГц. Обработку записей трансмембранных токов осуществляли с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Статистический анализ полученных данных проводили при помощи программы Origin 8.0 (Origin Lab., США).

Оценка изменений электрического потенциала на границе мембрана/водный раствор. Ионофор нонактин из раствора в этаноле добавляли в омывающие растворы с обеих сторон ПОФХ- или ПОФГ-мембраны до конечной концентрации 0.1–1.0 мкМ. Проводимость липидного бислоя (G) рассчитывали как отношение стационарного трансмембранного тока, индуцированного комплексом нонактина с ионами калия, к трансмембранному потенциалу, равному 50 мВ. Изменения электрического потенциала на границе мембрана/водный раствор при введении тестируемых производных 1–3 (Δφ_d) определяли как описано ранее в [8, 9]:

где $G_{m}^{0}$ и G_m – значения стационарной K⁺-проводимости бислоя, индуцированной нонактином до и после введения агента.

Проводили независимые эксперименты (4–6) и определяли среднее значение изменения граничного потенциала мембран при адсорбции тестируемых соединений для каждой из экспериментальных систем (среднее ± SE).

Измерение утечки флуоресцентного маркера из липидных везикул. Липосомы из ПОФХ или ПОФГ формировали методом экструзии с использованием мини-экструдера производства Avanti Polar Lipids (США) и заполняли раствором, состоящим из 35 мМ кальцеина, 10 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, pH 7.4, как описано ранее в [10, 11]. В каждый экспериментальный образец вводили соединение 1, 2 или 3 из исходного раствора в ДМСО до соотношения липид : агент, равного 1 : 1. Максимальная утечка кальциена из липосом в присутствии ДМСО в эквивалентных добавке тестируемых соединений концентрациях составляет не более 4%.

Проницаемость одноламеллярных липосом для флуоресцентного красителя кальцеина определяли с помощью спектрофлуориметра “Флюорат Панорама-02” (Россия) путем измерения интенсивности флуоресценции маркера, вытекающего из липидных везикул при длине волны возбуждения (490 нм) и эмиссии (520 нм).

Относительную величину утечки красителя из липосом под действием соединений 1–3 определяли как:

где I_i и I₀ – интенсивности флуоресценции образцов при добавлении производных и в их отсутствие соответственно, I_max – интенсивность флуоресценции раствора после введения 10 мМ тритона X-100 (коэффициент 0.9 введен для учета разбавления экспериментального образца тритоном). Полученные зависимости IF от времени аппроксимировали экспоненциальными функциями с параметрами, равными максимальной относительной утечке (IF_max) и характеристическому времени (τ).

Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия липосом. Гигантские одноламеллярные липосомы формировали из ДПФХ или ДПФГ в электрическом поле c помощью прибора Nanion vesicle prep pro (Германия), как описано в [11, 12]. Концентрация липида в суспензии составляла 5 мМ. В экспериментальные образцы вводили тестируемые соединения 1, 2 или 3 в эквимолярном соотношении к липиду, а в ячейку сравнения добавляли эквивалентный объем ДМСО. Термограммы липосомных суспензий получали при помощи дифференциального сканирующего микрокалориметра µDSC7 (Setaram, Франция) при скорости сканирования 0.2°С/мин. Пики на термограммах характеризовали температурой предперехода (T_p), а также температурой плавления (T_m) и шириной пика, соответствующего основному фазовому переходу (ΔTα). Значение минимальной и максимальной температуры при установлении ширины пика основного фазового перехода определяли по резкому возрастанию и снижению скорости изменения теплового потока с ростом температуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Введение оксимов 1, 2, 3 в растворы, омывающие ПОФХ-мембраны, до концентрации 1.5, 1.6 и 2.0 мМ соответственно не вызывает изменений ионной проницаемости бислоев указанного состава. Дальнейшее увеличение концентрации оксимов приводит к дестабилизации мембран и последующему их разрушению. Замена незаряженного ПОФХ на отрицательно заряженный ПОФГ в физиологических условиях сопровождается снижением пороговой концентрации соединений: разрыв ПОФГ-бислоев происходит при концентрациях агентов, в 1.5–2.0 раза меньших, чем в случае ПОФХ-мембран. Стоит отметить, что в присутствии соединения 2 в концентрации 0.5–0.8 мМ в омывающем мембраны растворе при трансмембранном напряжении более 150 мВ наблюдаются ступенеобразные флуктуации трансмембранного тока, имеющие различную амплитуду и в подавляющем большинстве случаев предшествующие полному разрушению бислоев из ПОФГ. На рис. 1 представлен пример записей подобных флуктуаций тока, которые могут быть результатом появления под действием соединения 2 в мембране ион-проницаемых дефектов.

В табл. 2 представлены характеристические параметры влияния тестируемых соединений на физико-химические свойства липидных бислоев различного состава. Для установления влияния тестируемых соединений на электрические параметры была проведена оценка изменения граничного потенциала модельных липидных мембран (Δφ_b) при добавлении соединений 1–3. Максимальная величина уменьшения граничного потенциала ПОФХ-мембран не зависит от типа оксима и в среднем составляет не более 5 мВ (табл. 2). Адсорбция соединений 1 и 3 приводит к сходному незначительному падению граничного потенциала ПОФГ-мембран (не более 4 мВ), в то время как введение агента 2 сопровождается более ощутимым эффектом – ростом φ_b на 40 мВ (табл. 2). Граничный потенциал мембраны представляет собой сумму двух компонент – поверхностного и дипольного потенциалов. Первая, экранируемая компонента обусловлена наличием заряда у мембранообразующих или сорбирующихся на бислое молекул, а вторая, неэкранируемая – специфической взаимной ориентацией диполей мембранообразующих молекул и воды [13–15]. Учитывая электронейтральность тестируемых соединений при рН 7.4 (табл. 1), при их адсорбции можно ожидать изменения только дипольной компоненты граничного потенциала. Нами оценены величины дипольных моментов соединений 1, 2 и 3 в вакууме (табл. 1). Среди тестируемых соединений производное 2 имеет наибольший дипольный момент, что хорошо согласуется с его высокой модифицирующей способностью в отношении ПОФГ-бислоев. При этом различная эффективность электронейтрального агента 2 для нейтральных и отрицательно заряженных мембран может указывать на различие его ориентации в ПОФХ и ПОФГ мембранах.

Проницаемость липосомальных мембран для кальцеина определяли путем измерения флуоресценции красителя, высвобождаемого из липосом под действием тестируемых соединений. На рис. 2 представлены временны́е зависимости высвобождения кальцеина из везикул различного состава при добавлении соединений 1, 2 и 3. Кинетические зависимости высвобождения кальцеина из липосом под действием тестируемых оксимов удовлетворительно описываются экспоненциальными функциями с параметрами, равными максимальной относительной утечке (IF_max) и характеристическому времени (τ). В табл. 2 представлены параметры экспоненциальных функций, аппроксимирующих полученные временны́е зависимости утечки кальцеина из незаряженных и отрицательно заряженных липосом в присутствии агентов 1–3 в суспензии при эквимолярном отношении липид : агент. Из представленных данных видно, что соединения 1 и 3 способны высвобождать около 15% захваченного ПОФХ-липосомами кальцеина, а производное 2 – около 25% (табл. 2). В случае адсорбции соединений 1 и 3 наблюдается сходный рост проницаемости ПОФГ-липосом (IF_max составляет около 15%) (табл. 2). Введение агента 2 в суспензию ПОФГ-везикул сопровождается большей утечкой флуоресцентного красителя (около 50%) (рис. 2б, табл. 2). Из табл. 2 видно, что τ не зависит от липидного состава везикул, а определяется видом оксима: высвобождение красителя под действием соединения 2 происходит медленнее, чем утечка, индуцированная агентами 1 и 3.

Возрастание в ряду 2 ≤ 3 < 1 десятичного логарифма коэффициента распределения между октанолом и водой (табл. 1) не позволяет объяснить бóльшую величину IF_max в присутствии оксима 2 по сравнению с 1 и 3 (табл. 2) его бóльшей липофильностью. Кроме того, электронейтральность производного 2 (табл. 1) не позволяет говорить о преимущественном взаимодействии этого производного с отрицательно зараженными мембранами, что могло бы быть причиной различия IF_max для ПОФХ и ПОФГ мембран (табл. 2). Причиной различий во влиянии тестируемых агентов на утечку маркера из липосом может быть изменение трансмембранного распределения латерального давления в присутствии оксимов. По всей вероятности, соединение 2 характеризуется бóльшим разупорядочивающим действием на липидные бислои по сравнению с 1 и 3, что может быть связано как с бóльшей глубиной погружения оксима 2 в мембрану, так и с различием в ориентации тестируемых соединений при встраивании в липидный матрикс. Различная способность оксима 2 вызывать утечку кальцеина из ПОФХ- и ПОФГ-липосом хорошо согласуется с предположением о различной ориентации этого производного в мембранах указанного состава. Кроме того, более выраженное влияние соединения 2 на ПОФГ-везикулы по сравнению с ПОФХ-липосомами может быть объяснено способностью этого оксима индуцировать дополнительные транспортные пути для кальцеина за счет формируемых им ион-проницаемых дефектов в ПОФГ-мембранах (рис. 1).

Предположение о различном разупорядочивающем действии тестируемых агентов верифицировали с помощью дифференциальной сканирующей микрокалориметрии суспензии липосомальных везикул, сформированных из ДПФХ или ДПФГ. В отсутствие растворителя и тестируемых соединений основные характеристики эндотерм плавления ДПФХ и ДПФГ хорошо согласуются с данными литературы [16–19]. Известно, что ДМСО вызывает рост температуры фазовых переходов липидов, в частности, увеличивает температуру предперехода и основного фазового перехода ДПФХ [20]. Считается, что сдвиг в сторону больших температур является результатом конденсации и связывания липидов молекулами ДМСО на поверхности мембраны [21, 22]. Сходные эффекты ДМСО были обнаружены при изучении плотности упаковки дипальмитоилфосфоэтаноламиновых, дипальмитоилфосфоглицериновых и дипальмитоилфосфосериновых монослоев [21].

Нами определены эндотермы плавления ДПФХ и ДПФГ в присутствии разных объемных концентраций ДМСО, которые были выбраны с учетом растворимости тестируемых оксимов. Введение ДМСО в суспензию липосом до концентраций 20, 0.5 и 3% соответствует содержанию растворителя в пробах при добавлении соединений 1, 2 и 3 до эквимолярного отношения липид : агент. На рис. 3а–3д представлены термограммы плавления липидов в присутствии указанных количеств ДМСО (сплошные линии). Сравнение представленных на рис. 3б и 3д термограмм с термограммами плавления ДПФХ и ДПФГ в отсутствие растворителя (вставки на рис. 3а, 3г) позволяет заключить, что ДМСО в концентрации 0.5% практически не влияет на эндотермы плавления ДПФХ и ДПФГ. Увеличение концентрации ДМСО до 3% приводит к значительному росту температуры предперехода ДПФХ и менее выраженному увеличению температуры основного фазового перехода ДПФХ и ДПФГ, что согласуется с литературными данными об увеличении температуры фазового перехода липидов под действием ДМСО. Увеличение концентрации растворителя до 20% приводит к существенной модификации эндотерм плавления липидов: температура плавления ДПФХ и ДПФГ возрастает, ширина пиков, соответствующих основному фазовому переходу ДПФХ и ДПФГ, увеличивается, в случае ДПФГ также наблюдается разделение основного пика на несколько компонент (рис. 3а, 3б). Влияние производных 1–3 на эндотермы плавления мембранообразующих липидов оценивали по изменению температуры предперехода ДПФХ (ΔT_p), изменению температуры плавления ДПФХ и ДПФГ (ΔT_m) и ширины пика, соответствующего основному фазовому переходу указанных липидов (ΔΔTα) по сравнению с липосомными суспензиями в присутствии эквивалентных количеств растворителя (табл. 2). При эквимолярном отношении липид : агент соединения 1 и 3 вызывают значительное падение температуры предперехода ДПФХ (пик сдвигается влево почти на 6°C), менее существенное уменьшение температуры плавления (на 1.1–1.6°C) и ширины основного пика, соответствующего переходу ДПФХ из риппл-фазы в жидкокристаллическое состояние (на 0.6–0.7°C) (рис. 3а, 3в, табл. 2). Добавление в липосомальную суспензию производного 2 приводит к исчезновению предперехода, уменьшению температуры плавления ДПФХ (на 1.7°C) и увеличению ширины основного пика почти на 3°C (рис. 3б, табл. 2). Оксимы 1 и 3 вызывают незначительное уменьшение ширины пика, соответствующего основному фазовому переходу ДПФГ (изменения не превышают 0.2–0.3°C) (рис. 3г, 3е), при этом наблюдается и некоторое уменьшение температуры плавления ДПФГ (в присутствии оксимов 1 и 3 пик сдвигается влево на 0.4 и 0.2°C соответственно). Как и в случае незаряженных липосом из ДПФХ, производное 2 вызывает значительный рост ширины основного пика на термограмме плавления ДПФГ (почти на 2°C) при его сдвиге влево на 0.5°C (рис. 3д, табл. 2).

Анализируя результаты измерения утечки флуоресцентного маркера из липосом и изучения термотропного поведения липидов в присутствии тестируемых агентов, можно отметить следующие закономерности: 1) высвобождение кальцеина из липидных везикул под действием соединений 1 и 3 не зависит от их состава; 2) способность агента 2 индуцировать утечку маркера из ПОФГ-липосом выше, чем везикул из ПОФХ; 3) производное 2 характеризуется большей эффективностью в отношении увеличения проницаемости ПОФХ- и ПОФГ-мембран для кальцеина по сравнению с оксимами 1 и 3; 4) соединения 1 и 3 вызывают незначительный рост размера кооперативной единицы ДПФХ и ДПФГ в присутствии ДМСО; 5) размер кооперативной единицы ДПФХ и ДПФГ под действием оксима 2 существенно падает.

Таким образом, данные о влиянии соединений 1 и 3 на плавление мембранообразующих липидов и утечку флуоресцентного красителя из липосом (табл. 2) свидетельствует об их незначительном разупорядочивающем действии, которое обусловлено малым погружением в липидный бислой. Напротив, соединение 2 характеризуется выраженным разупорядочивающим действием, заключающимся в увеличении проницаемости липидных везикул для кальцеина и падении размера кооперативной единицы из мембранообразующих липидов, что указывает на значительное погружение этого оксима в мембрану.

Полученные результаты расширяют представления о молекулярных механизмах действия тестируемых оксимов на свойства модельных липидных мембран как на первичную мишень действия молекул-предшественников свободных радикалов. Эти результаты имеют значение для оценки перспектив использования дициклогексилсодержащих производных О-иминоизомочевины в разработке противораковых препаратов. На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что наиболее предпочтительными матрицами для дальнейшей химической модификации при разработке противораковых соединений являются соединения 1 и 3, поскольку они не оказывают выраженного действия на электрические и эластические свойства липидного матрикса мембран в отличие от производного 2.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00110).