Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 2, стр. 123-128

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время интерес исследователей привлекает особое состояние протонов на поверхности мембраны. Предполагают, что обмен протонов, связанных на поверхности, с водным раствором происходит через высокий потенциальный барьер. Из-за барьера перемещение протонов в мембране между донором и акцептором может происходить вдоль ее поверхности, а не через водный раствор [1]. На этом основаны различные гипотезы окислительного фосфорилирования [2]. Ключевой вопрос, ответ на который позволяет проверить подобные механизмы, состоит в оценке величины потенциального барьера между протонами на поверхности и в воде. Для выяснения этого вопроса проводились исследования диффузии протонов вдоль мембраны с применением флуоресцентных зондов [3–6]. Один из экспериментальных способов обеспечить скачок концентрации протонов на поверхности мембраны основан на применении фотоактивируемых соединений “Caged-H⁺”, молекулы которых связаны на мембране и освобождают протоны при поглощении кванта света [3, 7, 8]. Одно из таких соединений изучалось нами ранее. Было показано, что при фотоактивации этого соединений вспышкой УФ-света происходит изменение емкости мембраны и скачка электростатического потенциала на ее границе [9]. Были сделаны оценки изменения рН около мембраны, составляющие менее 0.1 ед. [10], но они представляются заниженными и, возможно, отражают изменение рН не на поверхности, а в неперемешиваемом слое в воде около мембраны Для корректного изучения связывания протонов на поверхности мембраны желательно использовать рН-чувствительный зонд с известными характеристиками. В данной работе исследуется возможность использования в качестве такого зонда молекул стириловых красителей di-4-ANEPPS и RH-421 (рис. 1а). Ранее они использовались нами как мишени синглетного кислорода, измерение скорости окисления которых на поверхности мембраны позволяло оценить эффективность фотосенсибилизаторов [11]. Оказалось, что адсорбция этих красителей на мембране зависит от рН [12]. В настоящей работе влияние рН на адсорбцию красителей на липидной мембране изучено более подробно, и показано, что эти красителя могут быть использованы и как pH-зонды, позволяющие регистрировать скачок концентрации протонов, связанных на поверхности мембраны, при фотоактивации “Caged-H⁺”.

Рис. 1.

а – Структуры di-4-ANEPPS и RH-421. б – Зависимости изменения граничного потенциала БЛМ (сплошные символы, шкала слева) и флуоресценции липосом (пустые символы, шкала справа) при адсорбции RH-421 (кружки) или di-4-ANEPPS (треугольники) от рН раствора. Данные для di-4-ANEPPS взяты из [12]. Концентрация RH-421 при измерении Δφ_b составляла 3 мкМ, при измерении флуоресценции – 1 мкМ. Раствор содержал 20 мМ KCl, 2 мМ цитрат, 2 мМ HEPES. Зависимость Δφ_b от рН получена при добавлении di-4-ANEPPS или RH-421 в раствор с одной стороны мембраны, а HCl или KOH – с двух сторон мембраны. Значения потенциала, нормированные на величины в области плато при высоких рН, получены усреднением по результатам не менее трех экспериментов. Кривая проведена по уравнению $\Delta {{\varphi }_{{\text{b}}}} = \frac{1}{{1 + {{{10}}^{{{\text{pK}} - {\text{pH}}}}}}}$ с параметром pK = 4.5.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бислойные липидные мембраны (БЛМ) формировали методом Мюллера–Рудина в тефлоновой ячейке на отверстии диаметром 0.8 мм из раствора дифитаноилфосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, США) в н-декане в концентрации 15 мг/мл. Растворы готовили на дважды дистиллированной воде c использованием KCl, лимонной кислоты (Россия), HEPES, Трис и имидазола (Sigma, США). В экспериментах использовались стириловые красители di-4-ANEPPS и RH-421 (Sigma-Aldrich, США), а также Caged-H⁺ – 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS), синтезированный А.И. Иловайским в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. При освещении БЛМ постоянным светом использовали ультрафиолетовый светодиод LED-003W-48C-000-000LM-EL-P с длиной волны 375 нм и электрической мощностью 3 Вт (Artleds, Россия). Caged-H⁺ добавляли в дальний (по отношению к источнику света) отсек ячейки. Растворы в обоих отсеках ячейки непрерывно перемешивались с помощью магнитной мешалки.

В измерениях использовали хлорсеребряные электроды с агаровыми мостиками, заполненными тем же раствором, который находился в ячейке. Разность граничных потенциалов измеряли методом компенсации внутримембранного поля, разработанным в [13] (см. также обзоры [14, 15]). Экспериментальная установка для измерений этим методом была идентична использованной в наших предыдущих работах [11].

Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре “Флуорат-2 “Панорама” (Люмэкс, Россия) при длине волны возбуждения 500 нм, регистрации – 594 нм. Липосомы готовили из дифитаноилфосфатидилхолина с помощью экструдера, используя фильтры с размером пор 100 нм. Концентрация липида составляла 0.2 мг/мл. Флуоресценция красителей в водном растворе в отсутствие липосом не наблюдалась.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования адсорбции стириловых красителей на мембране показали, что она зависит от рН. Зависимость адсорбции красителей от рН изучалась двумя методами: по измерению разности граничных потенциалоа Δφ_b на плоских БЛМ и флуоресценции липосом. Зависимости Δφ_b и флуоресценции от рН в случае di-4-ANEPPS изучались нами ранее [12], а для RH-421 эти зависимости были получены в настоящей работе. Для удобства сравнения двух красителей потенциалы нормировались на величины в области плато, наблюдавшееся при высоких значениях рН. Полученные зависимости изображены на рис. 1б.

Известно, что молекулы красителей обладают значительным дипольным моментом, образованным положительно заряженным атомом азота в середине молекулы и отрицательно заряженной сульфогруппой на ее конце (рис. 1а). Они адсорбируются на поверхности мембраны в нейтральном виде, встраиваясь в мембрану гидрофобным концом молекулы, и создают на ней дипольный скачок потенциала со знаком плюс внутри мембраны [16]. Исчезновение этого потенциала при уменьшении рН можно объяснить тем, что при низких рН происходит протонирование второго атома азота молекулы красителя, из-за чего она становится положительно заряженной. При этом гидрофобная область молекулы становится более полярной, что значительно уменьшает ее сродство к мембране. Протонированные молекулы красителей в водном растворе были обнаружены по спектрам поглощения, которые зависели от рН [17].

При уменьшении рН исчезает и флуоресценция красителей на липосомах, поскольку способностью к флуоресценции обладают только те молекулы красителей, которые связаны с липидной мембраной [12]. Поэтому интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве молекул красителя, адсорбированных на мембранах липосом. Зависимость интенсивности флуоресценции от рН приведена на рис. 1б. Как показывает рисунок, флуоресценция обоих красителей при уменьшении рН исчезала. В целом зависимости от рН флуоресценции и Δφ_b оказались похожи, но спад флуоресценции происходил при более низких значениях рН, чем спад Δφ_b.. Как можно видеть на рисунке, зависимости Δφ_b и флуоресценции от рН для обоих красителей (di-4-ANEPPS и RH-421) близки. Совпадение зависимостей объясняется сходством структур этих красителей. У обоих красителей имеется два атома азота, один из которых всегда заряжен, а второй протонируется и становится заряженным при низких рН. Главное различие структур красителей состоит в строении ароматических колец: у ANEPPS имеется нафталиновое кольцо, а у RH-421 – бензольное. Это различие, как показывает рис. 1б, не оказывает заметного влияния на зависимость их адсорбции на мембране от рН. По зависимости Δφ_b от рН была проведена оценка рK протонирования красителей. Ее величина составила около 4.5. Эта величина оказалась близка к значению, полученному из измерений зависимости от рН спектров поглощения водных растворов RH-421, которое составляло около 4.9 [17].

Зависимость адсорбции стириловых красителей от рН позволяет использовать их как зонды рН на поверхности мембраны. Представлялось интересным использовать их для оценки изменения рН на поверхности мембраны при фотоактивируемом выделении протонов с помощью Caged-H⁺, в качестве которого использовалось соединение MNPS. Типичная кинетика изменения потенциала представлена на рис. 2. Сначала в ячейку добавляли MNPS, в результате чего происходило изменение граничного потенциала, вызванного адсорбцией анионов MNPS на поверхности мембраны. При освещении мембраны с адсорбированными на ней ионами MNPS кинетика изменения потенциала была аналогична наблюдавшейся нами ранее [9]. Как показано в [9], это изменение потенциала вызвано разрушением MNPS и протонированием поверхности БЛМ. Далее в ячейку добавляли di-4-ANEPPS и дожидались окончания адсорбции, о чем свидетельствовало достижение стационарной величины потенциала. После включения освещения происходило изменение граничного потенциала с более сложной кинетикой, чем в отсутствие красителей. В начальный момент после включения света изменение потенциала было положительного знака и напоминало изменение потенциала, наблюдавшееся в отсутствие di-4-ANEPPS. В дальнейшем изменение потенциала происходило в отрицательную сторону. По амплитуде оно было близко к величине изменения потенциала, вызванного адсорбцией di-4-ANEPPS. Очевидно, это изменение потенциала связано с уходом молекул di-4-ANEPPS с поверхности мембраны, вызванным выделением протонов при освещении MNPS. При прекращении освещения происходило частичное восстановление потенциала, кинетика которого также отличалась от той, что была в отсутствие красителей. Потенциал изменялся сначала в отрицательном направлении, затем – в положительном. Начальное отрицательное изменение потенциала напоминает восстановление потенциала, наблюдавшееся в отсутствие di-4-ANEPPS. Оно вызвано, очевидно, адсорбцией анионов MNPS и восстановлением равновесия протонов на поверхности мембраны [9]. Эти процессы происходят быстрее, чем адсорбция di-4-ANEPPS, которая вызывает медленное изменение потенциала в положительную сторону. Это объясняет начальную быструю отрицательную фазу и последующую медленную положительную фазу изменения потенциала в темноте. Аналогичная кинетика изменения потенциала при освещении с MNPS была получена и с другим красителем – RH-421.

Рис. 2.

Кинетика изменения разности граничных потенциалов при адсорбции на БЛМ 300 мкМ MNPS и 2 мкМ di-4-ANEPPS и освещении непрерывным светом. Моменты включения и выключения света обозначены стрелками вверх и вниз с надписями Light и Dark. Исходный раствор содержал 20 мМ KCl и по 0.2 мМ Трис, HEPES и цитрата, рН 8.0.

Кинетика изменения потенциала при освещении напоминает наблюдавшуюся нами ранее при разрушении молекул di-4-ANEPPS синглетным кислородом, образующимся при освещении в присутствии фотосенсибилизаторов [11, 12], где для количественной оценки скорости разрушения красителей определяли наклон относительного изменения потенциала в момент начала освещения. Аналогичный параметр был использован и в настоящей работе. Он определялся как наклон зависимости от времени медленной фазы изменения потенциала в момент начала освещения, нормированный на величину потенциала, возникающего при адсорбции этих красителей. Этот параметр оказался пропорционален интенсивности освещения (рис. 3).

Рис. 3.

Зависимость скорости медленного изменения потенциала в отрицательную сторону в начальный момент включения освещения от его электрической мощности. Средние значения скорости определяли по результатам не менее трех измерений. Исходный раствор содержал 20 мМ KCl и по 0.2 мМ Трис, HEPES и цитрата, рН 8.0. С одной стороны мембраны добавлены 300 мкМ MNPS и 2 мкМ RH-421.

Поскольку измерения проводились при рН 8, а заметное уменьшение потенциалов адсорбции красителей наблюдалось при рН меньше 5 (рис. 1б), можно предположить, что уменьшение рН на поверхности мембраны при фотолизе MNPS составляет несколько единиц. Эта величина намного превышает полученную нами ранее в [10] оценку (0.1 единиц), где изменение рН при фотолизе MNPS, вызванном вспышкой света, определяли по изменению потенциала разомкнутой цепи селективной по протонам мембраны с пентахлорфенолом. Конечно, сравнение этих экспериментов не совсем корректно, поскольку в [10] использовалась вспышка света, а в настоящей работе – непрерывное освещение. Другая существенная причина расхождения этих оценок состоит в том, что они отражают изменение рН в разных областях. Оценка, сделанная в работе [10], отражает изменение рН в воде около мембраны, поскольку равновесный потенциал мембраны, селективной по протонам, определяется разностью рН в водных растворах. В настоящей работе для оценки изменения рН использовались молекулы стириловых красителей, встроенные в мембрану, и изменение потенциала происходило при их протонировании непосредственно в мембране, из-за чего происходила десорбция молекул красителей в водный раствор.

Таким образом, стириловые красители могут быть использованы в качестве рН-зондов на поверхности мембраны. С их помощью удалось показать, что изменение рН на поверхности мембраны при фотоактивируемом фотолизе MNPS составляет несколько единиц.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № АААА-А20-120101090002-4, фотоэлектрические измерения с MNPS), а также проектов РНФ № 19-13-00410 (спектральные измерения) и РФФИ № 19-04-00694 (измерения граничных потенциалов на БЛМ).