Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 4, стр. 257-267

ВВЕДЕНИЕ

Внешние оболочки животных клеток представляют собой липидные мембраны с погруженными в них белковыми молекулами. Как липидный, так и белковый состав мембран очень разнообразен – клеточные цитоплазматические мембраны содержат порядка ста видов различных липидов и сотни видов различных белков [1, 2]. Было показано, что латеральное распределение липидов и мембранных белков крайне неоднородно. Липиды и белки могут формировать специфические домены, состав которых существенно отличается от среднего состава мембраны. Одним из видов таких доменов являются так называемые рафты – домены, обогащенные сфингомиелином и холестерином [3], относительно устойчивые к действию неионных детергентов [4, 5]. Большой интерес к исследованию рафтов связан с тем, что содержащиеся в них белки принимают активное участие в таких жизненно важных процессах, как внутриклеточная передача сигналов [6], инфицирование клеток оболочечными вирусами [7], кавеолин-зависимый эндоцитоз [4], дефосфорилирование [8] и т.д. Для нормального функционирования белков требуется специфическое микроокружение, которое обеспечивается в рафтах благодаря специфическому липидному составу и их физико-химическим свойствам. При экстракции из плазматической мембраны холестерина, приводящей к разрушению рафтов [5], протекание некоторых клеточных процессов изменяется [9]. Экспериментальное исследование рафтов in vivo затруднительно из-за сложного состава клеточных мембран и относительно малого размера доменов, который составляет 10–200 нм [10–12]. Однако в модельных чисто липидных мембранах в результате фазового разделения в жидко-неупорядоченной (L_d) мембране могут формироваться жидко-упорядоченные (L_o) домены микронных размеров, которые используются в качестве модели клеточных рафтов и которые могут быть исследованы различными экспериментальными методами [13–16].

Одним из эффективных инструментов исследования мембранных доменов является атомно-силовая микроскопия (АСМ). В отличие от флуоресцентной микроскопии разрешение АСМ не ограничено дифракционным пределом видимого света. В АСМ экспериментах было установлено, что домены в плоскости мембраны, как правило, имеют форму круга, т.е., по-видимому, липид в них находится в жидком состоянии. Толщина L_o-бислоя на 1–2 нм больше толщины окружающей мембраны. Методами флуоресцентной микроскопии было обнаружено, что в модельных мембранах домены практически всегда имеют бислойную структуру, т.е. располагаются в монослоях мембраны один под другим [14, 16–18]. Ранее было показано [19], что одной из возможных причин стабилизации бислойной структуры L_o-доменов могут являться упругие деформации мембраны, возникающие на границе домена для компенсации разности толщин бислоев. Если бы при скачке толщины бислоя на границе домена в 1–2 нм мембрана оставалась бы недеформированной, это привело бы к контакту гидрофобной зоны мембраны с водой или с липидными полярными группами и, как следствие, к большой величине линейного натяжения границы – 20–40 пН. В такой ситуации энергетически выгодно деформировать мембрану на границе таким образом, чтобы полностью сгладить скачок толщины и обеспечить непрерывность поверхности мембраны. При этом с точки зрения минимизации энергии деформаций оказывается выгоден небольшой относительный сдвиг границ монослойных доменов, составляющих бислойный рафт, на величину 2–4 нм. Эти результаты, полученные в теоретических работах [19–21], подтверждаются данными молекулярного моделирования методами молекулярной динамики [22, 23]. Энергетически выгодно формирование бислойных доменов таких, что радиусы составляющих их монослойных соосных доменов в разных монослоях отличаются на 2–4 нм. Для определенности, бислойный L_o-домен будем называть рафтом; таким образом, рафт состоит из двух монослойных L_o-доменов. В экспериментах с гигантскими липосомами, мембранами Мюллера–Рудина и т.д. монослои мембраны одинаковы и находятся в практически идентичных условиях. Поэтому при фазовом разделении площади образующейся L_o-фазы в обоих монослоях должны совпадать. Однако в АСМ мембрана наносится на твердую слюдяную подложку. Липидный монослой, прилегающий к подложке, находится в физических условиях, отличающихся от физических условий, в которых находится противоположный монослой, обращенный в объемную водную фазу. Исследованию некоторых эффектов, возникающих вследствие такой асимметрии граничных условий, посвящена настоящая работа.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

В работе [24] было рассмотрено взаимодействие плоской мембраны с локально сферическим зондом в АСМ экспериментах. Сферичность зонда учитывалась в рамках теории Дерягина [25]. Считалось, что сила взаимодействия включает электростатическое взаимодействие мембраны с отрицательно заряженным зондом и ван-дер-ваальсово притяжение. Известно, что как у слюды, так и у полярных головок липидных молекул имеются гидратные оболочки, состоящие из частично ориентированных молекул воды; эти гидратные оболочки взаимно отталкиваются [26]. По аналогии с расчетом взаимодействия мембраны и зонда можно рассчитать взаимодействие мембраны и плоской подложки. С учетом электростатических взаимодействий, ван-дер-ваальсова притяжения и гидратационного отталкивания, полная сила взаимодействия мембраны с плоской заряженной подложкой, отнесенная к единице площади, может быть записана в виде [24, 26]:

где z – координата вдоль оси, перпендикулярной подложке; σ_m – поверхностная плотность заряда мембраны; σ_p – поверхностная плотность заряда подложки; ε₀ – диэлектрическая проницаемость вакуума; ε_w – диэлектрическая проницаемость воды; l_D – длина Дебая электролита; H_a – константа Гамакера, H_a ≈ (3–10) × 10^–21 Дж; P₀ – расклинивающее давление, P₀ ≈ 4 × 10⁷–10¹⁰ Па; l_h – характерная длина гидратационного отталкивания, l_h ≈ 0.1–0.3 нм [27]. Первое слагаемое в выражении (1) соответствует электростатическим взаимодействиям, второе слагаемое – ван-дер-ваальсовым, третье слагаемое – гидратационным. Свободная энергия взаимодействия мембраны и подложки, отнесенная к единице площади, может быть найдена согласно соотношению: где H – расстояние от подложки до мембраны. При физически разумных значениях параметров эта энергия имеет минимум, однако положение минимума H₀ не может быть найдено аналитически. Разлагая энергию в окрестности точки H₀ до второго порядка, найдем эффективный квадратичный потенциал, в котором находится мембрана: Для численной оценки коэффициента k_h будем считать, что мембрана находится в бинарном электролите с концентрацией 100 мМ. Дебаевская длина l_D находится согласно выражению: где e – заряд электрона; J – ионная сила раствора; k_B – константа Больцмана; T – абсолютная температура. В рассматриваемом случае 100 мМ бинарного электролита J = 1.2 × 10²⁶ м^–3 и l_D ≈ 1 нм. Считая, что мембрана не содержит заряженных компонентов, т.е. σ_m = 0, поверхностная плотность заряда подложки σ_p = –0.032 Кл/м² [24], ε₀ = 8.85 × 10^–12 Ф/м, ε_w = 81, заряд электрона e = = 1.6 × 10^–19 Кл, l_h = 0.2 нм, P₀ = 4 × 10⁷ Н/м² [27], H_a = 5 × 10^–21 Дж [24], для крутизны потенциала получается значение k_h = 0.3 × 10¹⁵ Дж/м⁴ = = 0.08 k_BT/нм⁴ (k_BT ≈ 4 × 10^–21 Дж). Минимуму энергии w_h соответствует расстояние между подложкой и мембраной H₀ ≈ 1 нм. При вариации характерной длины гидратационного отталкивания в диапазоне l_h = 0.1–0.3 нм [27] крутизна потенциала варьирует в диапазоне k_h = 1.13–0.02 k_BT/нм⁴, а положение равновесия – H₀ = 0.4–2 нм. При этом значения характерной длины гидратационного отталкивания l_h и, соответственно, параметров k_h и H₀, сильно зависят от химической структуры и поверхностной плотности липидных головок и могут быть разными при взаимодействии с подложкой монослойного домена и окружающей его мембраны. Заряд мембраны также существенно влияет на потенциал адгезии липидной мембраны к подложке. Если считать, что мембрана содержит 20 мол.% отрицательно заряженного липида (например, диолеоилфосфатидилсерина), то крутизна потенциала при l_h = 0.2 нм станет равна k_h ≈ 0.0003 k_BT/нм⁴, а равновесное расстояние H₀ ≈ 10 нм. В этом случае энергия взаимодействия мембраны с подложкой, по-видимому, недостаточна, чтобы удержать мембрану на слюде без добавления, например, кальция, образующего “мостики” между электрическим зарядами слюды и мембраны.

Таким образом, вблизи твердой подложки незаряженная или слабо заряженная мембрана оказывается в потенциале, минимум которого расположен на некотором расстоянии H₀ от подложки. Это налагает на систему дополнительные граничные условия. В частности, если в мембране сосуществуют макроскопические фазы с разной толщиной бислоя, то эффективный измеряемый методом АСМ перепад толщины на границе фаз должен быть бислойный, а не монослойный, как в случае свободной мембраны, поскольку вдали от границы домена H = H₀ для обеих фаз (рис. 1), при условии, что фазы одинаково взаимодействуют с подложкой. Кроме того, новое граничное условие приводит к изменению энергии границы рафта, т.е. ее линейного натяжения, что, в свою очередь, должно влиять на распределение рафтов по размерам [28]. Ниже вычисляется линейное натяжение границы рафта в случае мембраны, находящейся вблизи твердой подложки.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

Будем считать, что рафт представляет собой совокупность двух монослойных доменов, расположенных в разных монослоях мембраны; положения границ доменов могут не совпадать. Для простоты рассмотрим случай рафта большого радиуса, такого, что кривизной границ составляющих его доменов локально можно пренебречь и приближенно считать границы прямыми линиями. В этом случае система обладает трансляционной симметрией вдоль границы рафта. Деформации мембраны вблизи границ монослойных доменов будем описывать в рамках теории упругости жидких кристаллов, адаптированной к липидным мембранам [29]. Средняя ориентация липидных молекул характеризуется векторным полем единичных векторов n, называемых директорами. Будем учитывать две основные моды упругих деформаций – поперечный изгиб и наклон. Деформация изгиба характеризуется дивергенцией директора вдоль поверхности монослоя, деформация наклона характеризуется разностью директора и единичной нормали N к поверхности монослоя. Деформации предполагаются малыми, и поверхностная плотность энергии монослоя вычисляется в квадратичном приближении по ним согласно выражению [29]:

где B – модуль изгиба; K_t – модуль наклона. Для нижнего монослоя помимо упругой энергии необходимо учесть также взаимодействие с подложкой согласно выражению (3). Полная энергия верхнего (W_u) и нижнего (W_d) монослоев, таким образом, может быть записана в виде: Здесь и ниже индексы “u” и “d” относятся к верхнему и нижнему монослоям соответственно; интегрирование ведется по поверхности соответствующего монослоя. Полная энергия бислойной мембраны дается выражением: Минимизация функционала (7) по распределению директора в верхнем и нижнем монослоях и форме межмонослойной поверхности приводит к системе линейных дифференциальных уравнений Эйлера–Лагранжа. Обозначим толщину монослоя L_o-домена h_r, а толщину L_d-монослоя окружающей мембраны – h_s. При условии возможного латерального сдвига границ монослойных доменов, расположенных в противоположных монослоях, вариационные уравнения необходимо решить в трех зонах, характеризующихся различным соотношением толщин монослоев (рис. 1): 1) бислойная L_d-мембрана, h_u = h_s, h_d = h_s; 2) переходная зона “гибридного” бислоя, h_u = h_s, h_d = h_r (рис. 1а) либо h_u = h_r, h_d = h_s (рис. 1б); 3) бислойный L_o-домен, h_u = h_r, h_d = h_r.

Решения дифференциальных уравнений Эйлера–Лагранжа содержат неопределенные коэффициенты, которые находятся из следующих граничных условий: 1) деформации ограничены и затухают при удалении от границы рафта, 2) директор непрерывен в каждом из монослоев, 3) поверхность каждого монослоя непрерывна. Оставшиеся после подстановки этих граничных условий неопределенные коэффициенты находятся путем минимизации по ним полной энергии системы (7). В силу трансляционной симметрии системы вдоль границы рафта энергию будем относить к единице длины вдоль границы, т.е. вычислять линейное натяжение границы рафта. Более подробно алгоритм вычисления изложен в Приложении.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения количественных результатов будем использовать следующие численные значения параметров: модуль изгиба B = 10 k_BT (на один монослой) [30], модуль наклона K_t = 40 мН/м (на один монослой) [29], толщина монослоя рафта h_r = 1.8 нм, толщина монослоя окружающей мембраны h_s = 1.3 нм [22, 23].

На рис. 2а представлена зависимость линейного натяжения от величины относительного сдвига границ монослойных доменов, составляющих бислойный рафт (от ширины гибридной зоны, L), в случае “свободной” мембраны, т.е. мембраны, находящейся вдали от подложки, для которой k_h = 0. Из графика видно, что в этом случае минимальной граничной энергии соответствует конфигурация, в которой расстояние между границами монослойных доменов составляет некоторую конечную величину (L ≈ 3 нм на рис. 2а). Подобный равновесный сдвиг границ монослойных доменов, составляющих бислойный рафт, наблюдался в ряде работ методами молекулярной динамики [22, 23]. Этот же результат был получен нами в предшествующих теоретических работах [19–21]. Из зависимости рис. 2а следует, что упругие деформации, возникающие на границе рафта при компенсации гидрофобного несоответствия, стабилизируют его бислойную структуру с точностью до небольшого сдвига границ ∼3 нм. Кроме того, при отражении свободной мембраны относительно плоскости межмонослойной поверхности структура границы рафта и, следовательно, энергия деформаций мембраны остаются неизменными, т.е. конфигурации конического рафта и обратного конического рафта имеют одинаковую энергию. Иными словами, в симметричной по липидному составу монослоев свободной мембране, расположенной далеко от подложки, при условии равенства площадей L_o-фазы в обоих монослоях с точки зрения минимизации граничной энергии выгодно формирование ансамбля рафтов, такого, что у половины рафтов нижний домен имеет радиус на 3 нм больший, чем верхний (конический рафт), а у другой половины – верхний домен имеет радиус на 3 нм больший, чем нижний (обратный конический рафт) (рис. 1). Более точный расчет энергии круглых доменов, подтверждающий этот вывод, проделан в работе [20].

Наличие подложки нарушает симметрию границы рафта. На рис. 2б–2г приведена зависимость граничной энергии бислойного рафта от разности координат границ верхнего и нижнего монослойных доменов при различных значениях длины гидратационного отталкивания l_h упорядоченной фазы. Значение l_h определяется средней степенью гидратации полярных головок липидов, которая, в свою очередь, определяется их химической структурой и поверхностной плотностью. Различия параметров в L_o- и L_d-фазах обусловлены различной концентрацией сфингомиелина, предположительно ослабляющего гидратационное отталкивание L_o-фазы и слюдяной подложки. Мы рассмотрели три значения длины гидратационного отталкивания L_o-фазы: l_h = 0.1 нм (рис. 2б), l_h = 0.2 нм (рис. 2в) и l_h = 0.3 нм (рис. 2г), зафиксировав при этом l_h = 0.1 нм для L_d-фазы окружающей мембраны. При данных значениях длины гидратационного отталкивания получаются следующие величины жесткости потенциала k_h и равновесного расстояния H₀: l_h = 0.1 нм соответствует k_h = 1.1 k_BT/нм⁴ и H₀ = 0.37 нм; l_h = 0.2 нм соответствует k_h = 0.07 k_BT/нм⁴ и H₀ = 1.2 нм; l_h = = 0.3 нм соответствует k_h = 0.02 k_BT/нм⁴ и H₀ = 2.2 нм. На каждом графике изображены зависимости энергии от ширины гибридной зоны L для конического и обратного конического рафтов (рис. 2). Из приведенных графиков видно, что оптимальная ширина переходной области ∼3 нм слабо зависит от величины l_h и конфигурации границы. Также видно, что при взаимодействии с подложкой появляется асимметрия, т.е. при одинаковой ширине переходной области линейное натяжение границы конического рафта будет отличаться от линейного натяжения границы обратного конического рафта. При оптимальной ширине переходной области (L ≈ 3 нм) линейное натяжение границы конического рафта оказывается выше линейного натяжения границы обратного конического рафта (рис. 2б–2г).

Несмотря на небольшое различие в энергии различных типов границ, оно может приводить к существенному дисбалансу количества конических и обратных конических рафтов. Рассмотрим систему при l_h = 0.3 нм (рис. 2г). При оптимальной ширине гибридной зоны линейное натяжение границы обратного конического рафта равно 0.52 k_BT/нм, конического рафта – 0.59 k_BT/нм. Таким образом, разница погонной энергии границы в этих двух конфигурациях составляет 0.07 k_BT/нм. Для рафта диаметром 10 нм это соответствует разности энергий E = π × 10 нм × × 0.07 k_BT/нм ≈ 2.2 k_BT, при диаметре 50 нм – E = = π × 50 нм × 0.07 k_BT/нм ≈ 11 k_BT. В равновесных условиях долю рафтов определенного типа можно считать пропорциональной больцмановскому фактору ∼exp(–E/k_BT). С учетом этого фактора, в случае рафтов диаметром 10 нм доля конических рафтов будет составлять ∼11% от полного числа рафтов. При среднем диаметре рафтов 50 нм доля конических рафтов будет составлять ∼1.7 × 10^–3%, т.е. практически все домены будут иметь обратную коническую структуру.

Разница радиусов монослойных доменов в противоположных монослоях должна приводить к разности площадей L_o-фазы в верхнем и нижнем монослоях. Этот дисбаланс, в принципе, может компенсироваться образованием монослойных L_o-доменов в нижнем монослое мембраны, прилегающем к подложке, таким образом, чтобы все рафты имели энергетически выгодную обратную коническую структуру, а избыток L_o-фазы образовывал монослойные L_o-домены в нижнем монослое. Формирование монослойных доменов должно приводить к повышению общей энергии системы за счет увеличения длины совокупной границы L_o- и L_d-фаз. Предположим, что избыток площади L_o-фазы от каждого L_o-домена собирается в n монослойных доменов, где n может быть меньше единицы, что означает конденсацию избытка от 1/n рафтов в один монослойный домен. При таких предположениях эффективное линейное натяжение конического/обратного конического рафта дается выражением:

где R – радиус домена, $\gamma _{0}^{{d,u}}$ – линейное натяжение границы конического/обратного конического рафта при оптимальной ширине гибридной зоны, $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{{u,d}}$ – линейное натяжение монослойного домена, расположенного в верхнем/нижнем монослое соответственно. γ_mono вычисляется аналогично линейному натяжению границы бислойного домена при учете энергии деформаций только в области бислойной L_d-фазы и в гибридной зоне и условии L → ∞. При l_h = 0.1 нм $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{d}$ = 0.30 k_BT/нм, $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{u}$ = 0.30 k_BT/нм; при l_h = 0.2 нм $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{u}$ = = 0.31 k_BT/нм, $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{d}$ = 0.40 k_BT/нм; при l_h = 0.3 нм $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{u}$ = 0.32 k_BT/нм, $\gamma _{{{\text{mono}}}}^{d}$ = 0.49 k_BT/нм. Зависимость эффективного линейного натяжения рафтов от их радиуса при n = 1 приведена на рис. 3. Видно, что при малых радиусах доменов энергетически выгодна конфигурация конических рафтов, а при больших радиусах – обратных конических рафтов (рис. 3б, 3в). При увеличении n и радиусов доменов кривые будут приближаться к своим асимптотикам, т.е. значениям, даваемым минимумом соответствующих кривых, приведенных на рис. 2.

На рис. 4 показаны характерные профили верхней поверхности мембраны вблизи границы рафта для обоих типов границ. Из рисунка видно, что в случае свободной мембраны различие уровней верхних поверхностей L_o- и L_d-фаз мембраны вдали от границы составляет 0.5 нм, что соответствует разности толщин упорядоченного и неупорядоченного монослоев (рис. 4, красные кривые). При одинаковой длине гидратационных взаимодействий L_o- и L_d-фаз l_h = 0.1 нм различие уровней составляет 1 нм, что соответствует разности толщин упорядоченного и неупорядоченного бислоев (рис. 4, синие кривые). При различной длине гидратационных взаимодействий L_o- и L_d-фаз разность уровней верхних поверхностей мембраны определяется комбинацией перепада толщины бислоя на границе фаз (1 нм) и разностью равновесных расстояний H₀ между подложкой и нижними L_o- и L_d-монослоями (рис. 4, зеленые кривые). Во всех случаях взаимодействия мембраны с подложкой профили верхней поверхности мембраны слабо зависят от типа границы (конический/обратный конический рафты), т.е. практически неразличимы методом атомно-силовой микроскопии. При одинаковой длине гидратационных взаимодействий l_h = 0.1 нм для L_o- и L_d-фазы деформации затухают на расстоянии порядка 10 нм от границы (рис. 4, синие кривые). В случае различного взаимодействия с подложкой липидов упорядоченной и неупорядоченной фаз деформации затухают на расстоянии от переходной области порядка 5 нм в сторону неупорядоченной фазы и на расстоянии порядка 15 нм в сторону упорядоченной фазы (рис. 4, зеленые кривые).

Кроме непосредственного влияния подложки на конфигурацию доменов в мембране, она также должна изменять латеральное распределение линейно-активных липидов, действие которых аналогично действию поверхностно-активных веществ в трехмерных системах. В работе [31] было показано, что ганглиозид GM1 накапливается на границе упорядоченных доменов, существенно изменяя их распределение по размерам. Там же было показано, что преимущественной областью распределения GM1 является упорядоченный монослой в гибридной зоне границы. В случае “обратной конической” конфигурации рафта эта область расположена в верхнем монослое, а в случае “конической” конфигурации – в нижнем монослое, обращенном к подложке. Таким образом, наличие подложки в данном случае ведет к тому, что экзогенно добавляемый ганглиозид GM1 будет распределяться на границу практически всех доменов, поскольку энергетически выгодна конфигурация обратных конических рафтов, и именно в этой конфигурации в промежуточной приграничной области мембраны верхний монослой находится в упорядоченном состоянии (рис. 1б). При отсутствии взаимодействия с подложкой лишь в половине доменов выгодная для распределения ганглиозида зона будет доступна из объемной водной фазы, и экзогенно добавленный компонент будет преимущественно распределяться на границу только половины общего числа рафтов.