Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 2, стр. 147-150

Одна из задач физиологии растений – выявление эндогенных механизмов защиты растительных клеток при стрессе. Действие экстремальных факторов, вызывающих состояние стресса, приводит к перестройке метаболизма клетки. Пограничные мембраны являются важными защитными барьерами и при действии стрессоров претерпевают изменения, способствующие преодолению негативных воздействий. В растительной клетке присутствуют две пограничные мембраны. Плазматическая мембрана ограничивает содержимое клетки от окружающей среды. Ее главная функция – поддержание целостности клетки и осуществление взаимосвязи с внешней средой. Плазматическая мембрана регулирует избирательный транспорт веществ в клетку, обеспечивает специфику межклеточных контактов, выполняет структурную, барьерную, информационную и защитную функции. Вакуолярная мембрана, как внутренняя мембрана протопласта, ограничивает вакуоль растительной клетки, обладает избирательной проницаемостью, активно участвует в процессах транспорта метаболитов, во многом определяет способность клетки к осморегуляции, к регуляции рН и ионного гомеостаза цитозоля, трансдукции сигналов различной природы и так же, как плазмалемма, принимает участие в защите клетки от абиотического стресса. Значительная часть этих функций связана с липидами пограничных мембран. Известно, что мембранные липиды принимают участие в защите растительной клетки от стрессовых воздействий [1]. Среди мембранных липидов именно стерины определяют такие свойства мембраны, как текучесть и проницаемость. Их роль в защите клетки от стресса в настоящее время не вызывает сомнений [2]. Доказана стабилизирующая роль стеринов – при увеличении их содержания происходит упорядочивание липидного бислоя мембраны. Они регулируют микровязкость, пластичность, ригидность мембран и участвуют в защите от стрессовых воздействий [3]. Цель настоящего исследования состояла в анализе качественного и количественного состава стеринов плазмалеммы и тонопласта при окислительном, гиперосмотическом и гипоосмотическом стрессовых воздействиях.

В качестве объекта исследования использовали плазматические и вакуолярные мембраны клеток корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris L., находящиеся на стадии покоя. Вакуолярные и плазматические мембраны получали описанными ранее методами [4, 5]. Чистоту мембранных фракций оценивали при помощи специфических ингибиторов H⁺-ATP-аз. Азид натрия (NaN₃), ванадат натрия (Na₃VO₄) и бафиломицин являются ингибиторами F-, P- и V-типа H⁺-ATP-аз, соответственно. В экспериментах по определению чистоты полученных фракций тонопласта азид натрия и ванадат натрия практически не влияли на активность Н⁺-ATP-аз изолированных везикул, в то время как бафиломицин подавлял активность на 95%. В экспериментах с фракцией плазмалеммы было установлено, что ванадат подавлял активность Н⁺-ATP-азы изолированных везикул на 97%, тогда как бафиломицин и азид ингибирующего влияния почти не оказывали. Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что мембранные фракции являются достаточно чистыми и могут быть использованы в экспериментах.

Методика создания и оценка эффективности окислительного и осмотического стрессов подробно описана в работе, опубликованной ранее [6]. Для создания гиперосмотического стресса корнеплоды в течение 3 суток выдерживали (подсушивали) на открытом воздухе при комнатной температуре, что приводило к снижению массы корнеплодов и увеличению осмоляльности клеточного сока (общая концентрация растворенных частиц в 1 кг воды). Для создания гипоосмотического стресса корнеплоды выдерживали в течение суток в дистиллированной воде при комнатной температуре, в результате чего уменьшалась осмоляльность клеточного сока. Осмоляльность оценивали на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия). Осмотика в контрольных корнеплодах составляла 645 ± 35 мОсм кг^–1 H₂O, после гиперосмотического стресса – 749.4 ± 42.3, а после гипоосмотического – 568.3 ± 7.6 мОсм кг^–1 H₂O. Для создания окислительного стресса кусочки ткани корнеплода размером 1 × 1 × 1 см инкубировали в растворе 100 мМ Н₂О₂ в течение суток также при комнатной температуре. В контрольном варианте использовали корнеплоды, не подвергнутые стрессам. Для характеристики стрессового воздействия на корнеплоды использовали кондуктометрический метод [7]. Также определяли содержание диеновых коньюгатов по методу [8]. Влияние стрессов на барьерные свойства мембран (стабильность мембран) изучали с использованием цейтраферной видеосъемки [9].

Из плазмалеммы и тонопласта, которые были выделены из контрольных и подвергнутых окислительному и осмотическим стрессам корнеплодов, экстрагировали липиды по методу [10]. Количество стеринов определяли методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии (GC–MS 7000/7890A Triple Quad chromatography-mass spectrometer, Agilent Technologies (США)). Идентификацию стеринов проводили путем сравнения их времен удержания со стандартами, а также использовали библиотеки масс-спектров NIST08 и WILEY7. Количественный анализ был проведен с использованием калибровочной кривой по холестерину, кампестерину, стигмастерину и β-ситостерину с учетом отклика внутреннего стандарта, в качестве которого использовали эргостерин.

Сравнивая контрольные варианты двух пограничных мембран, мы видим, что в плазмалемме сумма стеринов существенно выше, чем в тонопласте. В данном исследовании нас интересовали изменения как в суммарном содержании, так и в содержании отдельных классов стеринов при окислительном и осмотических стрессах. Результаты экспериментов показали, что в плазмалемме при осмотических стрессах идет двукратное снижение содержания стеринов, тогда как при окислительном стрессе наоборот их количество в 2 раза увеличивается (табл. 1). В тонопласте также отмечено увеличение содержания стеринов при окислительном стрессе, но заметно более существенное (в 3 раза). При осмотических стрессах изменения в суммарном содержании стеринов в тонопласте по сравнению с плазмалеммой отличаются еще более заметно. Так, при гиперосмотическом стрессе в тонопласте происходило такое же увеличение суммарного содержания стеринов, как и при окислительном стрессе, хотя в плазмалемме происходило существенное снижение общего содержания стеринов. При гипоосмотическом стрессе достоверных изменений в содержании общих стеринов в тонопласте не происходило, но не отмечено и снижение их содержания, которое мы видим у плазмалеммы. Увеличение содержания стеринов является важным защитным механизмом, поскольку хорошо известно, что стерины стабилизируют мембрану и способствуют упорядочению структурных компонентов мембраны [2].

В табл. 1 приведены результаты измерений содержания отдельных классов стеринов в плазмалемме и тонопласте при изучаемых стрессах. Видно, что все виды стресса вызывали изменения содержания всех классов стеринов. Так, содержание холестерина в плазмалемме уменьшалось и при окислительном, и при осмотических стрессах, тогда как в тонопласте оно, наоборот, возрастало в 4–6 раз. Известно, что хотя содержание холестерина в растительных мембранах сравнительно низкое, он играет заметную роль в регуляции биофизических характеристик мембран. Ранее было показано, что холестерин экранирует отрицательные заряды и тем самым снижает поверхностный заряд мембраны [11]. Это способствует более плотной упаковке углеводородных цепей в фазе геля, что играет важную роль в обеспечении барьерной функции клеточных мембран.

Содержание других классов стеринов в плазмалемме при гиперосмотическом стрессе снижалось в 3–4 раза, тогда как в тонопласте вновь отмечено заметное увеличение. При гипоосмотическом стрессе в плазмалемме содержание всех классов липидов заметно уменьшалось, за исключением β-ситостерина. В тонопласте при этом виде стресса снижалось только содержание стигмастерина, тогда как количество других стеринов не менялось, за исключением холестерина, содержание которого существенно возрастало.

Наиболее интересные изменения в содержании стеринов, на наш взгляд, отмечены после окислительного стресса. В этом случае происходило существенное увеличение содержания не только суммы стеринов тонопласта, но и всех отдельных классов стеринов. В плазмалемме отмечены похожие изменения, но не увеличивалось содержание кампестерина, и снижалось содержание холестерина. При гиперосмотическом стрессе существенно увеличивалось только суммарное содержание стеринов в тонопласте, тогда как в плазмалемме оно снижалось. Наименее заметные изменения в сторону увеличения содержания стеринов отмечены при гипоосмотическом стрессе.

Таким образом, при окислительном и осмотических видах стрессового воздействия изменения в содержании стеринов, связанные с выполнением защитных функций от стресса, были значительно более выражены на вакуолярной мембране. Полученные результаты позволяют выдвинуть предположение о существенной роли тонопласта в защите растительной клетки от стресса.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена с частичным использованием средств гранта РФФИ № 19-04-00013 на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.