Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2023, T. 40, № 2, стр. 142-146

Для восприятия внешних стимулов клетки экспрессируют на плазматической мембране различные рецепторы, связывание которых с первичными медиаторами, такими как экстраклеточные гормоны, нейротрансмиттеры, цитокины или факторы роста, приводит к выработке внутри клетки вторичных посредников. Вторичные медиаторы представляют собой небольшие молекулы, которые передают сигналы к эффекторным молекулам, запуская многочисленные биохимические процессы, результатом которых являются специфические клеточные ответы на внеклеточные стимулы. Универсальными вторичными медиаторами являются молекулы циклического аденозинмонофосфата (cAMP) и ионы кальция (Ca²⁺).

Первой молекулой, идентифицированной как вторичный медиатор, был cAMP, который регулирует множественные внутриклеточные процессы. Активация гептаспиральных (G-protein coupled receptor, GPCR) рецепторов, сопряженных с Gs- или Gi/o-белком, приводит к стимуляции или ингибированию аденилатциклазы соответственно, в результате чего уровень внутриклеточного cAMP изменяется. Действие cAMP опосредовано работой первичных эффекторных молекул, а именно протеинкиназы А (PKA), фактора обмена гуанин-нуклеотидов (Epac) и циклонуклеотид-зависимых ионных каналов. Активация PKA приводит к фосфорилированию множества белков-мишеней, в том числе различных факторов, усиливающих транскрипцию определенных генов. Работа циклонуклеотид-зависимых каналов играет ключевую роль в фоторецепции, обонянии и сердечной сократимости. Epac стимулирует активность GTP-азы Rap1, что приводит к активации фосфолипазы Cε и стимуляции внутриклеточных и ядерных Ca²⁺-сигналов. Передача cAMP-сигналов завершается посредством действия фосфодиэстераз, деградирующих cAMP, и фосфатаз, противодействующих PKA-опосредованному фосфорилированию [1, 2].

Ионы Ca²⁺ являются универсальным вторичным медиатором, контролирующим множество важнейших физиологических процессов, от передачи нервного импульса и сокращения мышечных волокон до пролиферации, дифференцировки и программируемой клеточной гибели. В связи с этим уровень внутриклеточного Ca²⁺ жестко контролируется при участии соответствующих каналов, насосов и Са²⁺-связывающих белков. В ответ на различные внешние сигналы уровень цитоплазматического Ca²⁺ может значительно повышаться за счет входа Ca²⁺ снаружи или его высвобождения из внутриклеточных депо. Например, активация GPCR-рецепторов, сопряженных с Gq-белком, приводит к активации фосфолипазы Cβ и последующему расщеплению фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP₂) и продукции инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP₃) и диацилглицерина (DAG). Связывание IP₃-рецепторов с IP₃ и Ca²⁺ приводит к высвобождению Ca²⁺ из эндоплазматического ретикулума и усилению этих Ca²⁺-сигналов преимущественно при помощи механизма Ca²⁺-индуцированного выброса Ca²⁺ из внутриклеточных депо (Сa²⁺-induced Ca²⁺ release). Частичное опустошение ретикулума приводит к взаимодействию белков его мембраны STIM с Сa²⁺-каналами плазматической мембраны Orai, входу наружного Ca²⁺ в цитозоль (store-operated calcium entry) и его загрузке в ретикулум посредством Ca²⁺-ATP-азы [1, 2].

Функционируя в ткани, клетки в норме могут подвергаться одновременному воздействию многих стимулов, активирующих различные сигнальные пути. В этих условиях Ca²⁺- и cAMP-сигнальные системы активны одновременно и могут оказывать влияние друг на друга. Так, Ca²⁺ модулирует активность аденилатциклаз, стимулируя AC1, AC8 и AC3, ингибируя AC5 и AC6, а также Ca²⁺-чувствительных фосфодиэстераз. При этом механизмы генерации Ca²⁺-сигналов регулируются при участии cAMP/PKA-пути на всех уровнях. Например, активация cAMP/PKA-пути приводит к фосфорилированию Gq-белков и фосфолипазы Cβ, что подавляет выработку IP₃, контролируя таким образом начальные стадии трансдукции Ca²⁺-сигнала. На уровне высвобождения Ca²⁺ из внутриклеточных депо cAMP напрямую или посредством PKA может повышать вероятность открытия IP₃-рецепторов, причем рианодиновые рецепторы также являются субстратом для PKA. Активация PKA также регулирует вход Ca²⁺ через STIM/Orai. В кардиомиоцитах активация PKA посредством воздействия на фосфоламбан потенцирует работу Ca²⁺-ATP-азы саркоплазматического ретикулума, способствуя выбросу депонированного Ca²⁺. Заключительная стадия Ca²⁺-сигнала контролируется PKA посредством активации IP₃-киназы, преобразующей IP₃ в IP₄, а также с помощью активации Ca²⁺-ATP-азы плазматической мембраны [1, 2].

Методы исследования внутриклеточных сигнальных путей, в частности, основаны на мониторинге соответствующих вторичных медиаторов. Мониторинг внутриклеточного Ca²⁺ традиционно осуществляется методом микрофотометрии (Ca²⁺-imaging) с помощью синтетических флуоресцентных Са²⁺-зондов. Способность таких зондов проникать через плазматическую мембрану и аккумулироваться внутри живой клетки дает возможность изучать Ca²⁺-процессы в динамике и на уровне одиночных клеток. Синтетических флуоресцентных зондов для cAMP не разработано, в связи с этим мониторинг cAMP внутри живой клетки стал возможен только с появлением генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров. Работа большинства таких сенсоров основана на Фёрстеровском переносе энергии (FRET), однако методика измерения FRET крайне сложна и требует специализированного оборудования для регистрации эмиссии флуоресценции на двух длинах волн. Недавно были разработаны одноволновые флуоресцентные генетически кодируемые сенсоры cAMP, что сделало мониторинг этой молекулы более доступным технически [3, 4]. Для мониторинга внутриклеточного Ca²⁺ также созданы генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, обладающие различными спектральными характеристиками [5]. Таким образом, последние разработки в области генетически кодируемых сенсоров делают возможным проведение мониторинга внутриклеточных cAMP и Ca²⁺ одновременно, что позволяет исследовать взаимодействие этих сигнальных путей. Данная работа была направлена на получение клеток, коэкспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры cAMP и Са²⁺. Представляется, что для повышения эффективности работы такого инструмента необходимо, чтобы базовые клетки эндогенно экспрессировали множество рецепторных и сигнальных белков. Таким свойством обладают клетки HEK-293, в связи с чем именно эта линия была выбрана в качестве материнской [6].

Для проведения одновременного мониторинга флуоресценции нескольких сенсоров необходимо, чтобы не пересекались либо спектры возбуждения их флуоресценции (λ_ex), либо спектры эмиссии флуоресценции (λ_em) всех используемых сенсоров. Для мониторинга внутриклеточного cAMP на сегодняшний день разработано несколько одноволновых флуоресцентных генетически кодируемых сенсоров, одними из лучших характеристик среди них обладает Pink Flamindo, флуоресцирующий в оранжевой области спектра (λ_ex = 567 нм, λ_em = 590 нм) [4]. Имеющиеся в настоящий момент генетически кодируемые сенсоры Са²⁺ характеризуются разнообразными спектральными характеристиками, и для работы в комбинации с Pink Flamindo нами был выбран GEM-GECO1, флуоресцирующий в синей и зеленой областях спектра (λ_ex = 390 нм, λ_em1 = 455 нм, λ_em2 = 511 нм) [5]. Ни спектры возбуждения, ни спектры эмиссии Pink Flamindo и GEM-GECO1 не пересекаются, что позволяет проводить одновременный и независимый мониторинг внутриклеточных cAMP и Са²⁺. Таким образом, для получения заявленной клеточной линии HEK-293 трансфицировали плазмидными векторами, обеспечивающими гетерологичную экспрессию сенсоров Pink Flamindo и GEM-GECO1.

Следует отметить, что в результате липофекции клеток HEK-293 плазмидным вектором доля клеток, экспрессирующих целевой белок, редко достигает половины даже после селекции в присутствии антибиотика, при этом уровень экспрессии белка интереса значительно варьируется от клетки к клетке и быстро падает с течением времени. Между тем, в качестве эффективного инструмента для исследования физиологических процессов желательно, чтобы большая доля модельных клеток экспрессировала генетически кодируемые сенсоры постоянно и на высоком уровне. Такого результата можно достичь, получив моноклональную клеточную линию.

В данной работе клетки HEK-293 культивировали в среде DMEM (Gibco), содержащей 4.5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma) во влажной атмосфере c 5% содержанием CO₂ в воздухе при 37°C. С целью индукции экспрессии Pink Flamindo и GEM-GECO1 клетки трансфицировали плазмидными векторами Pink Flamindo (#102356 Addgene) и CMV-GEM-GECO1 (#32442 Addgene) одновременно. Для трансфекции использовали набор для липофекции Lipofectamine 3000 (Invitrogen) по оптимизированному согласно рекомендациям производителя протоколу. Затем клетки в течение 2 недель культивировали в присутствии 700 мкг/мл селективного антибиотика G418 (Invitrogen), устойчивость к которому несет плазмидный вектор Pink Flamindo. В результате селекции на чашке оставались колонии клеток, обладающие различным уровнем флуоресценции, обусловленным различиями в уровне экспрессии встроенных сенсоров. С помощью клеточного сортера FACSAria SORP (BD Biosciences) отбирали субпопуляцию клеток, обладающих наибольшей интенсивностью флуоресценции как GEM-GECO1 (λ_ex = 407 нм, λ_em = = 525 ± 10 нм), так и Pink Flamindo (λ_ex = 561 нм, λ_em = 582 ± 7.5 нм) (рис. 1а–1в). Затем отобранные клетки рассаживали по одной в лунку 96-луночного планшета, содержащую ростовую среду с повышенным до 15% содержанием сыворотки. Одиночные клетки порождали колонии клеток, которые наращивали до количества, достаточного для проведения физиологических тестов.

Рис. 1.

Характеристики клеток линии HEK-PF/GG. а, б – Конфокальные изображения клеток линии HEK-PF/GG при возбуждении флуоресценции Pink Flamindo (а) и GEM-GECO1 (б). в – Cуперпозиция флуоресцентных изображений, представленных в а и б. Изображения а – в были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SPE (Leica), оборудованного объективом с масляной иммерсией Plan Apochromat HCX PL APO Lambda Blue 63× 1.4 Oil UV (Leica), и программы Leica Application Suite Advanced Fluorescence. Флуоресценцию возбуждали при 543 и 405 нм, эмиссию регистрировали в областях 580–640 и 440–530 нм для Pink Flamindo и GEM-GECO1 соответственно. г, д – Репрезентативные регистрации Са²⁺- и cAMP-ответов клеток линии HEK-PF/GG на стимуляцию активатором фосфолипазы С m-3M3FBS (100 мкМ) и активатором аденилатциклазы Forskolin (35 мкМ) (г) и норадреналином (1мкМ) (д). Моменты и продолжительность аппликаций веществ обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальных кривых. Изменение внутриклеточного Ca²⁺ и сАМР характеризовали относительной флуоресценцией GEM-GECO1 и Pink Flamindo соответственно, используя параметр ΔF/F₀. Для GEM-GECO1 ΔF = F₀ – F, для Pink Flamindo ΔF = F – F₀, где F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии индикатора и его эмиссии в начале регистрации соответственно.

Клетки всех полученных моноклональных линий тестировали в физиологических экспериментах, а именно с помощью микрофотометрии оценивали характеристики сигналов, генерируемых клетками в ответ на стимуляцию активатором аденилатциклазы форсколином (10–50 мкМ) и активатором фосфолипазы С m-3M3FBS (100 мкМ). Для этого клетки прикрепляли ко дну фотометрической камеры с помощью адгезивного материала Cell Tak (Corning) и выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 110, KCl – 5.5, CaCl₂ – 2, MgCl₂ – 0.8, HEPES – 10, глюкозу – 10. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой EMCCD камерой LucaR (Andor Technology). Флуоресценцию клеток возбуждали при 572 ± ± 17.5 и 380 ± 5.5 нм, эмиссию регистрировали в областях 634 ± 34 и 523 ± 23 нм для Pink Flamindo и GEM-GECO1 соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы NIS Elements (Nikon). По результатам физиологического тестирования была отобрана моноклональная линия HEK-PF/GG, клетки которой демонстрировали обратимые и максимальные ответы на стимуляцию форсколином и m-3M3FBS (рис. 1г). Клетки полученной линии HEK-PF/GG также генерировали быстроразвивающиеся cAMP- и Са²⁺-ответы на стимуляцию норадреналином (1 мкМ) (рис. 1д). Известно, что этот агонист стимулирует аденилатциклазный и фосфолипазный сигнальные пути, взаимодействуя с адренергическими рецепторами разных типов [7]. Тот факт, что нам удалось детектировать cAMP- и Са²⁺-ответы клеток HEK-PF/GG на стимуляцию норадреналином в физиологических концентрациях, говорит о возможности их использования для исследования сигналов, вызываемых и другими природными агонистами GPCR-рецепторов.

Полученная в результате описанной работы моноклональная линия, клетки которой позволяют проводить одновременный мониторинг цитозольных cAMP и Са²⁺ в режиме реального времени, является без преувеличения долгожданным инструментом для исследования соответствующих внутриклеточных сигнальных систем и их взаимодействия.

Авторы благодарят Д.М. Поташникову за помощь в проведении работ на клеточном сортере FACSAria SORP в рамках Программы развития МГУ и А.Б. Никифорову за помощь в проведении работ на конфокальном микроскопе Leica TCS SPE.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-75-10 068.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.