Биология моря, 2019, T. 45, № 2, стр. 125-132

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объект исследования – массовый вид аппендикулярий Oikopleura gracilis Lohmann, 1896 семейства Oikopleuridae. Животных собирали в летний период 2012 и 2017 годов планктонной сетью Джеди на глубине 10 м в районе Морской биологической станции “Восток” ННЦМБ ДВО РАН (зал. Восток, Японское море). Пробы просматривали под бинокуляром МБС-10 (РФ) при помощи камеры Богорова; обнаруженных аппендикулярий стеклянной пипеткой отсаживали в чашки Петри с фильтрованной морской водой для последующей фиксации.

Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) половозрелых особей O. gracilis фиксировали 2.5% раствором глутаральдегида на какодилатном буфере (КБ). После отмывки в КБ (0.05 М, pH 7.4) материал дофиксировали 1% водным раствором четырехокиси осмия и дегидратировали в спиртах и ацетоне. Образцы заливали в смолу Spurr Resin (SIGMA-ALDRICH). Полутонкие срезы толщиной 0.5 мкм, изготовленные на ультратоме Reichert-Ultracut E, окрашивали метиленовым синим и фотографировали при помощи светового микроскопа Keyonce Biorevo BZ9000 (Япония). Тонкие срезы толщиной 70 нм после контрастирования в водном растворе уранилацетата и растворе цитрата свинца изучали в трансмиссионных электронных микроскопах Jeol JEM 100S (Япония), Zeiss Libra 120 (Англия) и Zeiss Sigma 300 VI (Англия) в Центре коллективного пользования “Дальневосточный центр электронной микроскопии” ННЦМБ ДВО РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пищеварительный тракт Oikopleura gracilis представлен глоткой, пищеводом и желудком, состоящим из левой и правой долей, а также кишкой, которая подразделяется на вертикальный, средний и задний отделы и открывается наружу анусом, расположенным с вентральной стороны туловища (рис. 1а, б). Пищеварительный эпителий желудка O. gracilis однослойный, как и в других отделах пищеварительного тракта, в нем преобладают энтероциты с многочисленными микроворсинками и длинными ресничками (рис. 1г; рис. 2а, б). Ширина энтероцитов 2 мкм, высота – 2.5 мкм. Крупное, овальное ядро размером около 1.5–2 мкм занимает преимущественно центральную часть энтероцита (рис. 2б). В цитоплазме располагаются округлые митохондрии диаметром 0.4 мкм, везикулы разного диаметра с электронно-светлым содержимым и околоядерный шероховатый эндоплазматический ретикулум; в апикальной части цитоплазмы видны корешки ресничек (рис. 2б).

Рис. 1.

Строение пищеварительного канала аппендикулярии Oikopleura gracilis и локализация в нем инфицированных клеток. а – общий вид животного с дорсальной стороны (световая микроскопия); б – общая анатомия туловища зараженной особи; в – локализация зараженного энтероцита задней кишки; г – локализация зараженного энтероцита правой доли желудка (полутонкие парасагиттальные срезы). Условные обозначения: ap – анальная папилла, ci – реснички энтероцитов, en – эндостиль, es – пищевод, h – часть слизистого домика, hg – гермафродитная гонада, ht – сердце, ll – левая доля желудка, m – рот, oik – ойкопласт, ph – глотка, r – задняя кишка, rep – эпителий задней кишки, rl – правая доля желудка, tl – хвост. *Полость правой доли желудка, **гемоцель; большие черные стрелки указывают на энтероциты со спорами.

Рис. 2.

Ультраструктура энтероцитов пищеварительного эпителия аппендикулярии Oikopleura gracilis. а – ультраструктура двух зараженных энтероцитов желудка (между ними энтероцит, не содержащий клеток паразита); б – ядро нативного энтероцита; в – зараженный энтероцит эпителия задней кишки. Условные обозначения: bl – базальная пластинка, ci – реснички энтероцитов, dg – разрушенный участок цитоплазмы споры, mt – митохондрия энтероцита, mv – микроворсинки энтероцита, n1 – ядро нормального энтероцита, n2 – ядро зараженного энтероцита, rer – шероховатый эндоплазматический ретикулум, s – спора, s1 – клетки первого морфотипа, v – везикула. *Полость правой доли желудка, **гемоцель, ***полость задней кишки.

Признаки патологического заражения обнаружены в семи энтероцитах пищеварительного эпителия желудка, один зараженный энтероцит найден в эпителии задней кишки O. gracilis. В других отделах пищеварительного канала энтероциты с подобной патологической ультраструктурой не обнаружены. Зараженные энтероциты не визуализировались у живых особей O. gracilis, однако на гистологических препаратах, окрашенных метиленовым синим, в пищеварительном эпителии они заметно выделялись гипертрофированными размерами (рис. 1б–г). Апикальная поверхность зараженного энтероцита задней кишки O. gracilis разрушена, сохранилась только его базальная часть, в которой кроме спор паразита находятся ядро и митохондрии (рис. 1в; рис. 2в).

Ширина зараженных энтероцитов желудка 10–15 мкм, высота – 8–11 мкм (рис. 1г; рис. 2а; рис. 4а). Апикальная поверхность несет многочисленные короткие микроворсинки и несколько длинных ресничек (рис. 2а). Цитоплазма инфицированных энтероцитов электронно-светлая, в ней расположены крупные митохондрии (около 80 нм) и везикулы с гетерогенным содержимым диаметром около 50 нм (рис. 2а; рис. 3а, б). Ядра зараженных клеток вытянутой или овальной формы, размером 3.5 мкм, с признаками деформации, смещены к апикально-латеральной плазмалемме (рис. 2а). В цитоплазме энтероцита, расположенного между двумя зараженными, клетки паразита не обнаружены, однако он отличается от нормальных энтероцитов большей высотой (5 мкм) и крупным ядром (3.5 мкм по длинной оси). Размер лежащей рядом с ядром митохондрии также больше, чем у нативных энтероцитов аппендикулярии (рис. 2а, б).

Рис. 3.

Ультраструктура доспоровых стадий микроспоридиоподобных протистов в энтероците желудка аппендикулярии Oikopleura gracilis. а – клетки первого морфотипа в процессе деления и цитодифференцировки; б – клетки первого морфотипа рядом со спорами; в – везикулы комплекса Гольджи в клетках первого морфотипа; г – группа из трех клеток второго морфотипа; д – поперечный срез через клетку второго морфотипа. Условные обозначения: bl – базальная пластинка, int – интердигитации; mt – митохондрия энтероцита, mv – микроворсинки, ns2 – ядро клетки второго морфотипа, pf – полярный филамент, pm – цитоплазматическая мембрана энтероцита, pm1 – цитоплазматическая мембрана клетки первого морфотипа, pm2 – цитоплазматическая мембрана клетки второго морфотипа, s – спора, s1 – клетки первого морфотипа, s2 – клетки второго морфотипа, v – везикула, vg – везикула комплекса Гольджи, vl – вакуоль; белые стрелки указывают на цитоплазматические мостики между клетками первого морфотипа.

Рис. 4.

Три типа клеток микроспоридиоподобных протистов в энтероцитах желудка аппендикулярии Oikopleura gracilis (а) и специализированные органеллы в цитоплазме спор (б–г). Условные обозначения: bl – базальная пластинка, cs – цитоплазма споры, en – эндоспора, ex – экзоспора, g – электронно-светлый участок цитоплазмы вокруг спор, int – интердигитации; mt – митохондрия энтероцита, pf – полярный филамент, pp – поляропласт, pms – цитоплазматическая мембрана споры, s – спора, s1 – клетки первого морфотипа, s2 – клетки второго морфотипа, v – везикула.

Зараженные и нормальные энтероциты эпителия желудка инфицированных особей O. gracilis располагаются на общей базальной пластинке толщиной 40 нм, образованной коллагеноподобным веществом (рис. 2а, 3а). Плазмалеммы соседних энтероцитов у базальных полюсов формируют взаимные переплетения или интердигитации (рис. 3а; рис. 4а).

В энтероцитах желудка O. gracilis обнаружены споры паразита и клетки двух морфотипов, интерпретированные как доспоровые стадии (рис. 2–4a). Клетки первого морфотипа занимают периферию цитоплазмы энтероцитов хозяина, они вытянутые (3–5 мкм) или округлые (1.5–2.0 мкм) (рис. 2а, б; рис. 3а–в; рис. 4а); часто находятся в тесном контакте друг с другом, соединяясь между собой цитоплазматическими мостиками (рис. 3а–в). Цитоплазма клеток первого морфотипа электронно-плотная, в отдельных клетках отмечены многочисленные светлые овальные везикулы, распределенные по всему объему (рис. 3в). В вытянутых клетках первого морфотипа видны изогнутые элементы полярного филамента (рис. 3а; рис. 4а).

В апикальной части одного из зараженных энтероцитов желудка O. gracilis обнаружены клетки второго морфотипа, тесно контактирующие друг с другом и образующие группы из трех клеток (рис. 3г, д; рис. 4а). Форма клеток неправильная, близкая к прямоугольной, размер – 1.0–1.5 мкм; оболочка заметно толще, чем у клеток первого морфотипа, а цитоплазма помимо ядра содержит специализированную органеллу: полярный филамент, свернутый в 2–3 витка, которые расположены в один ряд, и вакуоль (рис. 3г, д). На поперечном срезе полярный филамент около 10–15 нм в диаметре, он представлен двумя концентрическими слоями: внутренним электронно-светлым и внешним электронно-плотным, в центре находится осевая электронно-плотная структура (рис. 3д). У некоторых клеток на одном из полюсов видна крупная вакуоль с электронно-светлым содержимым (рис. 3г).

Споры паразита находятся в центральной (преимущественно) или в базальной части энтероцитов. Каждая спора окружена электронно-светлым участком цитоплазмы клетки хозяина. На срезе в энтероците насчитывается от 10 до 15 спор округлой или овальной формы размером 0.7 × 0.9 мкм (рис. 2а; рис. 4а). Расположенная поверх цитоплазматической мембраны стенка споры состоит из двух слоев: электронно-светлого внутреннего толщиной 15 нм и электронно-плотного внешнего толщиной 8 нм. Выросты на поверхности внешнего слоя отсутствуют (рис. 4б–г). В гетерогенном содержимом электронно-плотной цитоплазмы различимы элементы полярного филамента (рис. 4б) и поляропласт в виде округлого осмиофильного тела (рис. 4г). Цитоплазма некоторых спор разрушена (рис. 2а, в).

ОБСУЖДЕНИЕ

Тип Microsporidia (Balbiani, 1882) – группа протистов, филогенетически близкая к грибам (Holomycota) (Karpov et al., 2014). Согласно современным представлениям, она относится к супертаксону ARM, который объединяет группы Aphelida, Roselida и Microsporida (Karpov et al., 2014; Keeling, 2014). Микроспоридии – это внутриклеточные паразиты, спектр хозяев которых очень широк (от одноклеточных до позвоночных); внутри клеток животного-хозяина они обычно располагаются свободно, но иногда локализуются внутри паразитофорной вакуоли. Образуют одноклеточные споры, стенка которых состоит из двух слоев: внешнего (экзоспора) и внутреннего (эндоспора), плотно прилегающего к плазматической мембране. Для микроспоридий характерно отсутствие митохондрий и жгутиков, а также наличие своеобразного экструзионного аппарата, состоящего из полярного филамента, поляропласта и задней вакуоли (Vávra, Larsson, 2014).

Общим эффектом микроспоридиоза является гипертрофическое расширение инфицированных клеток хозяина, обусловленное интенсификацией метаболических процессов и/или нарушением клеточного цикла, а также образованием в их цитоплазме большого количества спор паразита (Williams et al., 2014). Увеличение размеров зараженных энтероцитов Oikopleura gracilis позволило обнаружить их на окрашенных полутонких срезах с помощью световой микроскопии. У живых аппендикулярий очаги заражения на световом уровне не визуализировались. У некоторых прозрачных животных, например у креветок Litopenaeus setiferus и Caridina formosae или у циклопа Cyclops sp., симптомом заболевания микроспоридиозом становится появление белых непрозрачных ксеном – образований, в которых локализуются паразиты (Исси, Воронин, 2007; Wang et al., 2013; Sokolova, Hawke, 2016; Sokolova et al., 2016). Аппендикулярия O. gracilis – прозрачное животное, но у инфицированных особей не обнаружено патологических отличий от интактных. Известно об общеорганизменной реакции животных на микроспоридиоз. Так, у насекомых под воздействием этих паразитических простейших изменяются репродуктивное поведение и гормональный фон, влияющий на линьку. При этом гонады, нервы и нейроэндокринные клетки не поражаются микроспоридиями, которые локализуются в других тканях (Исси, Воронин, 2007). Для аппендикулярий подобная реакция на микроспоридиоз неизвестна.

В инфицированных микроспоридиями клетках, как правило, заметны деструктивные изменения (Исси, Воронин, 2007; Ardila-Garcia, Fast, 2012); у O. gracilis на такие изменения косвенно указывает деформация ядер зараженных энтероцитов. Поскольку микроспоридии лишены митохондрий и используют митохондрии клеток хозяина для восполнения своих энергозатрат (Исси, Воронин, 2007), то при микроспоридиозе характерно увеличение числа и размера этих клеточных органелл, отмеченное в инфицированных клетках исследованных аппендикулярий. Интересно, что ультраструктурным изменениям подвергся также энтероцит O. gracilis, расположенный между двумя зараженными. Размеры энтероцита, как и его митохондрий, были больше, чем нативных энтероцитов, но паразит в нем не обнаружен. Возможно, зараженные энтероциты опосредованно оказывают патологическое влияние на находящиеся с ними в тесном контакте близлежащие клетки. Однако протисты могли отсутствовать на срезах, поэтому нельзя исключить, что этот энтероцит также заражен. Неизвестно, происходит ли реинфицирование энтероцитов O. gracilis или из-за короткого онтогенеза аппендикулярии не успевают подвергнуться вторичному заражению.

По способу питания аппендикулярии – фильтраторы (Flood, 1991; Gorsky, Fenaux, 1998), поэтому споры обнаруженных микроспоридиоподобных протистов могли попасть в полость пищеварительного тракта исследованных аппендикулярий перорально вместе с отфильтрованными пищевыми частицами. Паразиты обнаружены только в энтероцитах желудка и задней кишки, т.е. в тех отделах пищеварительного канала, где происходит активное всасывание питательных веществ.

Попав в организм хозяина, клетка микроспоридий претерпевает несколько последовательных мерогониальных делений, в результате которых образуются меронты (Исси, Воронин, 2007). В энтероцитах O. gracilis паразитарные клетки, морфология которых соответствовала бы этой стадии развития, не обнаружены. Следующая стадия – споронты, которые появляются в результате спорогониальных делений. Для споронтов характерно накопление электронно-плотного материала на поверхности цитоплазматической мембраны, приводящее к утолщению оболочки клетки, а также увеличение числа элементов шероховатого эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи (КГ) (Исси, Воронин, 2007). В клетках паразита из энтероцитов аппендикулярий, отнесенных к первому морфотипу, обнаружены везикулы одного диаметра с электронно-светлым содержимым, которые интерпретированы как элементы КГ. Эта клеточная органелла необходима для формирования полярного филамента микроспоридий, поэтому его гипертрофия указывает на начало цитодифференцировки споронтов в споробласты (Sokolova et al., 2001; Temereva, Sokolova, 2017). Формирующийся полярный филамент отмечен в вытянутых клетках первого морфотипа.

Спорогония микроспоридиев завершается образованием споробласта, в котором специфические органеллы микроспоридий начинают приобретать окончательный вид. Для споробластов и молодых спор типично наличие толстой электронно-плотной оболочки и полярного филамента, скрученного в спираль с разным количеством витков (Исси и др., 1993; Sokolova et al., 2006; Исси, Воронин, 2007; Wang et al., 2013; Toguebay et al., 2014). Появление в цитоплазме клеток второго морфотипа полярного филамента и заметное утолщение оболочки этих клеток позволяют определить их как споробласты или молодые споры. Кроме этого они имеют вакуоль, которая может быть гомологична задней вакуоли микроспоридий. Ультраструктура полярного филамента, выявленного в данных клетках, сходна со строением полярного филамента микроспоридий (Исси, Воронин, 2007).

Развитие микроспоридий завершает стадия споры; для нее характерна поляризация клетки, органеллы в споре распределяются неслучайным образом. Кроме полярного филамента в споре имеется поляропласт – органелла в виде округлого электронно-плотного образования. Однако мембраны поляропласта спор, выявленных в энтероцитах аппендикулярии O. gracilis, не разрешены и на срезах выглядят как единое осмиофильное тело, что характерно для передней части поляропласта многих микроспоридий, например Perezea nelson (Sokolova, Hawke, 2016) и Alfvenia sibirica (Sokolova et al., 2016). Обнаруженные в энтероцитах O. gracilis споры паразита всегда окружены электронно-светлыми участками цитоплазмы, которые отмечены вокруг спор микроспоридий в цитоплазме зараженных клеток животных-хозяев из разных групп Metazoa (Sokolova et al., 2004; Исси, Воронин, 2007; Рязанова, Елисейкина, 2010; Ardila-Garcia, Fast, 2012; Temereva, Sokolova, 2017).

Протокол фиксации для аппендикулярий, примененный в настоящем исследовании, оказался неподходящим для спор протистов, так как плохое прохождение фиксатора через плотные оболочки спор не позволило детально описать их внутреннее строение и привело к разрушению некоторых из них. Однако обнаруженные ультраструктурные особенности морфологии протистов из энтероцитов аппендикулярии O. gracilis указывают на их сходство со споронтами, споробластами и спорами микроспоридий, которые отличаются от других протистов наличием аппарата экструзии, состоящего из поляропласта, якорного диска и полярного филамента (Keeling, 2014). К сожалению, полученных данных недостаточно для определения видовой принадлежности микроспоридиоподобных протистов, обнаруженных в энтероцитах пищеварительного канала аппендикулярии O. gracilis.

Автор выражает искреннюю признательность за обсуждение полученных данных Ю.Я. Соколовой (Институт цитологии РАН) и Т.Г. Симдянову (Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова); за помощь в сборе материала С.Ш. Даутову (ННЦМБ ДВО РАН), а в съемке живых аппендикулярий – И.А. Адамейко (Каролинский институт, Швеция, Стокгольм). Особую благодарность автор выражает сотрудникам Центра коллективного пользования “Дальневосточный центр электронной микроскопии” Д.В. Фомину и К.А. Шефферу за помощь в работе с электронными микроскопами.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ в рамках научного проекта № 18-34-00357.