Биология моря, 2019, T. 45, № 3, стр. 208-216

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Сведения об объеме изученного материала и районах его сбора приведены в таблице 1. Виды рода Porocottus пойманы на литорали: P. japonicus и P. allisi – с помощью сачка, P. minutus – руками под камнями, а P. camtschaticus – мальковым неводом. Рыб идентифицировали по внешним морфологическим признакам.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Молекулярно-генетический анализ

Полученные последовательности генов мтДНК депонированы в базе данных GenBank/NCBI под номерами, указанными в табл. 1. Секвенированные участки генов 16S рРНК, COI и цитохрома b длиной 613–614, 1009 и 841 пар нуклеотидов (пн) расположены в пределах 2009–2621, 5578–6586 и 14609–15350 пн согласно нумерации нуклеотидных позиций митохондриального генома Enophrys diceraus (GenBank KF039715).

В нуклеотидных последовательностях участка гена COI мтДНК изученных видов рода Porocottus (без учета внешних групп) обнаружено 130 филогенетически информативных сайтов (12.9%). Для гена цитохрома b установлено 113 информативных нуклеотидных позиций (13.4%). Фрагмент гена 16S рРНК характеризовался 19 информативными сайтами (3.1%).

В последовательностях мтДНК выявлены замены нуклеотидов, которые дифференцируют виды бахромчатых бычков. В последовательностях гена COI установлено 25, 24 и 50 таких специфических мутаций, гена цитохрома b – 15, 21 и 45, гена 16S рРНК – 2, 4 и 11 мутаций для P. minutus, P. japonicus и P. camtschaticus соответственно. В последовательности гена 16S рРНК P. japonicus обнаружена однонуклеотидная инсерция, отличающая этот вид не только от других бахромчатых бычков, но и от остальных представителей семейства Cottidae. Рассчитанные для объединенных последовательностей мтДНК р-дистанции приведены в табл. 2. Значения дивергенции между видами P. minutus и P. japonicus варьируют от 4.62 до 5.94 и в среднем составляют 5.25%. Виды P. minutus и P. camtschaticus различаются в среднем на 7.76% (с разбросом р-дистанций 7.32–8.27%). Представители P. japonicus и P. camtschaticus дифференцированы на 8.13% (с разбросом р-дистанций 7.47–8.99%).

Таблица 2.  

Значения p-дистанций (%) по данным о нуклеотидных последовательностях генов COI, цитохрома b, 16S pРНК (ниже диагонали) и участка гена COI (выше диагонали)

Вид (№ образца)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
1. Porocottus minutus (1930)	−	1.20	1.00	1.00	1.20	0.20	7.37	7.37	7.37	7.37	7.41	7.41	9.78	9.58	9.62	9.16	11.35	11.75	13.75	11.16	14.20	13.15
2. P. minutus (1934)	0.45	−	0.20	0.20	0.40	1.40	7.39	7.39	7.39	7.39	7.23	7.43	10.40	10.60	10.64	9.58	12.18	12.18	13.77	11.18	14.43	13.37
3. P. minutus (1936)	0.65	0.45	−	0	0.20	1.20	7.17	7.17	7.17	7.17	7.01	7.21	10.18	10.38	10.42	9.36	11.95	12.35	13.55	10.96	14.20	13.15
4. P. minutus (1938)	0.53	0.37	0.57	−	0.20	1.20	7.17	7.17	7.17	7.17	7.01	7.21	10.18	10.38	10.42	9.36	11.95	12.35	13.55	10.96	14.20	13.15
5. P. minutus (1939)	0.49	0.29	0.41	0.37	−	1.39	6.97	6.97	6.97	6.97	6.81	7.01	9.98	10.58	10.62	9.16	11.75	12.15	13.35	10.76	14.40	12.95
6. P. minutus (1996)	0.33	0.77	1.02	0.94	0.86	−	7.57	7.57	7.57	7.57	7.62	7.62	9.78	9.58	9.62	9.16	11.35	11.75	13.94	11.35	14.40	12.95
7. P. japonicus (1993)	5.82	5.77	5.88	5.90	5.65	5.94	−	0	0	0	0	0	9.98	10.58	10.62	9.76	11.55	11.75	13.55	10.96	15.20	14.14
8. P. japonicus (1997)	4.95	4.91	5.00	4.99	4.78	5.07	2.44	−	0	0	0	0	9.98	10.58	10.62	9.76	11.55	11.75	13.55	10.96	15.20	14.14
9. P. japonicus (1998)	4.79	4.74	4.89	4.83	4.62	4.95	1.25	1.46	−	0	0	0	9.98	10.58	10.62	9.76	11.55	11.75	13.55	10.96	15.20	14.14
10. P. japonicus (2011)	5.14	5.10	5.25	5.27	5.02	5.31	1.36	1.58	0.58	−	0	0	9.98	10.58	10.62	9.76	11.55	11.75	13.55	10.96	15.20	14.14
11. P. japonicus (2012)	5.51	5.42	5.57	5.59	5.34	5.67	1.49	1.83	0.91	0.41	−	0	10.04	10.64	10.69	9.82	11.62	11.82	13.43	10.82	15.09	14.03
12. P. japonicus (2013)	5.15	5.15	5.30	5.27	5.02	5.32	1.32	1.50	0.50	0.08	0.41	−	10.04	10.64	10.66	9.82	11.62	11.82	13.63	10.62	15.09	14.03
13. P. camtschaticus (1750)	7.50	7.62	7.86	7.83	7.58	7.63	8.62	7.87	7.47	7.76	8.19	7.89	−	0.60	0.60	10.58	14.17	14.17	13.97	13.37	15.23	14.77
14. P. camtschaticus (1751)	7.79	8.02	8.27	8.11	8.07	7.91	8.99	8.28	7.89	8.16	8.61	8.30	0.94	−	0	10.98	13.97	13.97	14.57	13.97	15.03	14.97
15. P. camtschaticus (1752)	7.32	7.56	7.84	7.69	7.61	7.45	8.77	7.93	7.50	7.82	8.31	7.95	0.90	0.78	−	11.02	14.03	14.03	14.63	14.03	15.09	15.03
16. P. allisi (KY305170)	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	11.16	11.55	12.55	12.75	16.00	14.94
17. P. leptosomus (KY305169)	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	0.40	14.14	14.34	15.80	13.35
18. P. leptosomus (KY305156)	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	14.34	14.54	16.20	13.55
19. Megalocottus platycephalus	9.00	9.16	9.33	9.21	9.04	9.13	9.85	9.23	9.03	9.42	9.66	9.56	9.74	10.14	9.98	−	−	−	−	11.95	14.60	14.14
20. Enophrys diceraus	9.98	10.06	10.15	10.18	9.93	10.03	10.55	10.39	9.98	10.44	10.72	10.50	10.55	11.25	10.96	−	−	−	9.20	−	13.00	14.34
21. Gymnocanthus pistilliger	10.80	10.83	11.13	11.00	10.80	11.13	11.26	10.61	10.19	10.69	10.97	10.71	10.92	11.29	11.12	−	−	−	10.26	10.59	−	14.00
22. Alcichthys elongatus	12.99	13.06	13.08	13.19	12.91	13.08	13.64	12.72	12.41	12.72	12.95	12.75	13.93	14.33	14.14	−	−	−	112.98	14.04	12.74	−

Построены два филогенетических дерева: по данным об объединенных последовательностях генов COI, цитохрома b, 16S рРНК мтДНК длиной 2463 пн (рис. 1) и по данным об участке гена COI длиной 582 пн с привлечением информации из GenBank (рис. 2). Положение в основании деревьев занимают ДНК-линии внешних групп: M. platycephalus, E. diceraus, G. pistilliger и A. elongatus. Типы мтДНК видов рода Porocottus формируют компактную группу, в которой P. camtschaticus, P. minutus и P. japonicus образуют собственные кластеры. В базальной части группы Porocottus находится ДНК-линия P. leptosomus (рис. 2). Основные оценки устойчивости основных узлов ветвления (РР ≥ 0.95) подтверждают достоверность ассоциаций типов ДНК видов рода Porocottus.

Рис. 1.

Байесовское дерево, полученное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов COI, цитохрома b, 16S рРНК мтДНК. Числа в основаниях кластеров – достоверные оценки апостериорной вероятности. В скобках – номера образцов.

Рис. 2.

Байесовское дерево, полученное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена COI, в том числе данных из GenBank/NCBI. Числа в основаниях кластеров – достоверные оценки апостериорной вероятности. В скобках – номера образцов.

Кариологический анализ

Описание кариотипа P. japonicus (2 самки, 2 самца) составлено по результатам анализа 44 рутинно окрашенных метафазных пластинок. Кариотип рыб состоит из 42 хромосом (2n), число хромосомных плеч (NF) 42, включая 36 СТ и 6 А хромосом (рис. 3а). Изменчивость по числу хромосом не обнаружена, различия по 2n и NF между кариотипами самцов и самок не выявлены.

Рис. 3.

Кариограммы Porocottus japonicus: 2n = 42; NF = 42 (а); P. allisi и P. minutus: 2n = 40, NF = 42 (б, в). Условные обозначения: М – мета-, СТ – субтело-, А – акроцентрические хромосомы. Увеличение: 10 × 100.

Проанализированы 20 рутинно окрашенных метафазных пластинок самки P. allisi. Кариотип: 2n = 40, NF = 42, состоит из двух М, 32 СТ и шести А хромосом (рис. 3б).

Изучены 35 рутинно окрашенных метафазных пластинок P. minutus (2 самки, 1 самец и 1 неполовозрелая особь). Кариотип: 2n = 40, NF = 42, состоит из двух М, 32 СТ и шести А хромосом (рис. 3в). Изменчивость по числу хромосом не обнаружена, различия по 2n и NF между кариотипами самок и самца не выявлены.

В кариотипах видов установлены маркерные хромосомы, хорошо идентифицируемые во всех исследованных метафазных пластинках. У P. japonicus это три пары крупных СТ хромосом (рис. 3а: пары 1–3), у P. allisi – пары крупных М и СТ хромосом (рис. 3б: пары 1, 2), у P. minutus – одна пара мелких М и три пары крупных СТ хромосом (рис. 3в: пары 1–4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Ареалы видов Porocottus japonicus, P. allisi, P. minutus и P. camtschaticus мозаичны и в сравнении с ареалом рода имеют небольшую протяженность (Неелов, 1979; Шейко, Федоров, 2000; Федоров и др., 2003; Соколовский и др., 2007). Биологические особенности бахромчатых бычков изучены крайне слабо. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о различиях по глубине обитания, предпочитаемым биотопам и спектру питания (Соколовский и др., 2011; Парин и др., 2014; Савельев, Колпаков, 2016; Поезжалова-Чегодаева, 2017).

На основании морфологических признаков, строения сейсмосенсорной системы P. japonicus, P. allisi, P. camtschaticus и P. minutus включены в подрод Crossias (Неелов, 1976, 1979). Изученные виды имеют на голове одну или две пары мочек. Строение мочек специфично, что позволяет дифференцировать бахромчатых бычков (Неелов, 1979). Японский бахромчатый бычок имеет лишь одну пару заглазничных мочек, состоящих из небольшого мясистого кожного тела, от которого беспорядочно отходят небольшие и разные по длине усики. Затылочные мочки отсутствуют или представлены маленьким кожным придатком (Неелов, 1979; Савельев, Колпаков, 2016). Бахромчатый бычок Эллиса и охотоморский бахромчатый бычок имеют две пары хорошо развитых мочек. У P. allisi заглазничные мочки состоят из 5–6 длинных тонких усиков одинакового размера, затылочные – обычно из четырех усиков (Неелов, 1979; Линдберг, Красюкова, 1987). У P. minutus заглазничные мочки состоят из 2–8 усиков; меньшего размера затылочные – из 1–4 усиков (Неелов, 1979). Заглазничные мочки P. camtschaticus устроены иначе. Они состоят из 8–20 коротких усиков, сидящих на мясистом основании, и имеют вид петушиного гребня. Затылочные мочки образованы 1–4 короткими усиковидными придатками (Неелов, 1979).

Проведенный молекулярно-генетический анализ позволил обнаружить существенную изменчивость мтДНК и гетерогенность рода Porocottus. Установлено, что значения р-дистанций между видами изменяются в широких пределах – от 5.25% между P. minutus и P. japonicus до 8.13% между P. japonicus и P. camtschaticus. Полученные оценки дивергенции между P. camtschaticus и остальными видами высокие при сравнении в пределах одного рода; в некоторых случаях р-дистанции достигают почти 9%, приближаясь к уровню различий между близкими родами семейства Cottidae. Например, представители родов Porocottus и Megalocottus различаются в среднем на 9.43%, Porocottus и Enophrys – на 10.3%, Megalocottus и Enophrys – на 9.2% (табл. 2). Такая значительная генетическая дифференциация вида P. camtschaticus согласуется с его морфологическими отличиями – это единственный вид рода, имеющий на голове мощный гребень из многочисленных коротких усиков.

Несмотря на существенные различия, на филогенетическом дереве (рис. 1) кластеры изученных видов бахромчатых бычков образуют единую группу, в которой первым обособляется P. camtschaticus, а затем обособляется P. minutus вместе с P. japonicus. Достоверность полученных данных о монофилии этой группы, последовательности дифференциации мтДНК видов, более тесной филогенетической связи охотоморского и японского бахромчатых бычков подтверждается высокими оценками вероятности узлов ветвления.

У бахромчатых бычков выявлен внутривидовой полиморфизм мтДНК, который обусловлен различиями между экземплярами, добытыми в разных точках ареала видов. Самый низкий уровень различий обнаружен у P. minutus – 0.57% (варьирование – 0.29–1.02%). Внутривидовая дифференциация P. camtschaticus несколько выше и составляет 0.87 (0.87–0.94)%. Самая существенная изменчивость установлена для P. japonicus (среднее значение 1.14%); при этом максимально (на 1.6%) отличается экземпляр, пойманный в б. Джигит (северное Приморье), значительно удаленной от места вылова остальных представителей вида (зал. Чихачева, Татарский пролив). Этот вид, ранее известный только из северной части Татарского пролива и западного побережья о-ва Сахалин, недавно обнаружен в прибрежных водах северного Приморья (Савельев, Колпаков, 2016).

Для проведения сравнительного молекулярно-генетического анализа были использованы данные по нуклеотидным последовательностям участка гена COI мтДНК всех видов рода Porocottus, имеющиеся в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Реконструированное филогенетическое дерево (рис. 2) свидетельствует, что P. allisi находится гораздо ближе к группе P. minutus – P. japonicus – P. camtschaticus (среднее значение р-дистанций составляет 9.78%, см. табл. 2), чем P. leptosomus (12.25%). Генетические отличия P. allisi и P. camtschaticus от P. minutus – P. japonicus имеют сходные значения – 9.54 и 10.27% соответственно.

Кариологический анализ P. minutus из двух точек ареала в Тауйской губе (зал. Одян и о-в Недоразумения), а также P. japonicus из б. Джигит (северное Приморье) и зал. Чихачева (Татарский пролив) показал, что их хромосомные наборы стабильны по числу хромосом.

На основании сравнительного анализа P. japonicus, P. allisi и P. minutus выявлены общие признаки, указывающие на их таксономическую близость. P. allisi и P. minutus сходны по числу (2n = 40) и морфологии хромосом (рис. 3б, 3в). Все изученные бахромчатые бычки имеют одинаковое число хромосомных плеч – 42. В кариотипах видов можно выделить сходные маркерные хромосомы. У P. allisi и P. minutus присутствует пара М хромосом (рис. 3б, 3в: пара 1). У японского и охотоморского бахромчатых бычков имеются крупные СТ хромосомы, размеры которых значительно превышают размеры всех остальных хромосом в их кариотипах (рис. 3а: пары 1–3; рис. 3в: пары 2–4). Крупные СТ хромосомы пары 3 у P. japonicus и пары 4 у P. minutus (рис. 3а, 3в) по размерам соответствуют крупным СТ хромосомам у P. allisi (рис. 3б: пара 2). У всех трех видов одинаковое количество А хромосом (рис. 3а: пары 19–21; рис. 3б, 3в: пары 18–20). Кариотипы P. japonicus, P. allisi и P. minutus содержат большое число одноплечих СТ и А хромосом (рис. 3).

Однако при общем сходстве в хромосомных наборах наблюдаются различия, которые, как и морфологические признаки, позволяют дифференцировать изученные виды бахромчатых бычков. М хромосомы P. allisi и P. minutus различаются по размерам (рис. 3б, 3в: пара 1). У бахромчатого бычка Эллиса они более крупные, чем все остальные хромосомы в его кариотипе. По сравнению с М хромосомами у P. allisi, у охотоморского бахромчатого бычка М хромосомы мелкие. У P. minutus М хромосомы по размерам соответствуют средним СТ хромосомам (рис. 3в: пара 1, пары 5–11).

Кариотип P. japonicus (2n = 42) отличается от такового у P. allisi и P. minutus (2n = 40) по числу и морфологии хромосом и представлен только одноплечими хромосомами (рис. 3). В хромосомном наборе P. japonicus содержится 18 пар СТ хромосом, у P. allisi и P. minutus на две пары СТ хромосом меньше – 16 пар (рис. 3а: пары 1–18; рис. 3б, 3в: пары 2–17). В кариотипе P. allisi отсутствуют две пары крупных СТ хромосом, маркерных для P. japonicus и P. minutus (рис. 3а: пары 1, 2; рис. 3в: пары 2, 3).

Общее сходство структуры хромосомных наборов и NF (42) у изученных бахромчатых бычков позволяет предположить, что М хромосомы у P. allisi и P. minutus образовались вследствие робертсоновских транслокаций, произошедших в ходе эволюции их кариотипов. Выявленные различия размеров маркерных М хромосом у P. allisi и P. minutus можно объяснить участием в их образовании разных одноплечих хромосом. Крупные М хромосомы P. allisi могли образоваться в результате центромерного слияния двух пар крупных СТ хромосом, а мелкие М хромосомы P. minutus – двух пар мелких или средних одноплечих хромосом. Проведенные кариологические исследования керчаковых рыб показали, что ведущее место среди структурных перестроек хромосом в этой группе занимают робертсоновские транслокации (Васильев, 1985; Морева и др., 2017). Они являются основным механизмом эволюционного изменения кариотипов у видов рода Myoxocephalus, приведшим к их существенным различиям (Морева, Борисенко, 2017).

Таким образом, в результате проведенного исследования установлены молекулярно-генетические и кариологические признаки, позволяющие проводить надежную идентификацию видов P. japonicus, P. allisi, P. minutus и P. camtschaticus. На основе молекулярно-генетического изучения обнаружена более тесная филогенетическая связь P. minutus с P. japonicus и выявлены существенные отличия P. camtschaticus от этих видов. Значительное сходство общей структуры кариотипов P. japonicus, P. allisi и P. minutus свидетельствует о их близком родстве. Обнаруженные различия видов соответствуют их дифференциации по морфологическим и биологическим признакам.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 15-29-02416_офи_м) и Программы “Дальний Восток” (проект № 18-4-002).