Биология моря, 2020, T. 46, № 1, стр. 3-13

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа выполнена на двустворчатых моллюсках Spisula sachalinensis (Schrenck, 1862) и Callista brevisiphonata (Carpenter, 1864), а также на морских звездах Aphelasterias japonica (Bell, 1881) и Asterias amurensis (Lütken, 1871). Животных собирали в б. Восток (зал. Петра Великого, Японское море). Моллюсков вскрывали и из сердечной сумки шприцем набирали гемолимфу; целомическую жидкость морской звезды выделяли, надрезая кончик луча. Гемолимфу и целомическую жидкость сразу помещали на покровные стекла и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки фиксировали в 4% растворе формалина на морской воде. После фиксации препараты окрашивали гематоксилин–эозином, обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Распластанные клетки фотографировали с помощью цифровой камеры (10 Мпикс) микроскопа Zeiss Axiovert 200M Apotome, выводили на экран планшетного компьютера, зарисовывали и переводили в однобитный формат. Всего обработано 458 гемоцитов S. sachalinensis и 628 гемоцитов C. brevisiphonata, 569 целомоцитов A. japonica и 400 целомоцитов A. amurensis. Анализировали как силуэтные, так и контурные двумерные изображения распластанных клеток. В контурных изображениях использовали однопиксельный абрис внешней границы клетки. Фрактальный анализ выполняли при помощи плагина FracLac 2.5 для программы анализа изображений ImageJ 1.41, линейные параметры просчитывали средствами ImageJ 1.41 и с помощью Photoshop SC3. Статистическую обработку результатов осуществляли в программных пакетах STATISTICA 12.0 и NCSS 2007.

Для параметризации клеток использовали 36 параметров, включая 19 параметров линейной морфологии и 17 параметров квазифрактального анализа (Каретин, 2016; Karetin, Pushchin, 2017), из которых для описания клеточной морфологии и классификации отобрали 18 параметров: Area – площадь; Per – периметр клетки; LCFD PreLac – мера гетерогенности или трансляционной инвариантности изображения при разных вариантах наложения решетки; in50/out50 – отношение площади клетки во внешней половине описывающей клетку окружности к площади клетки во внутренней половине окружности; 1/2half – соотношение площадей частей клетки, оказавшихся в двух половинах описывающей клетку окружности, диаметр которой проводится в направлении, максимально неравномерно разделяющем изображение клетки (этот параметр используется как мера асимметричности клетки); AR – соотношение максимального и минимального радиусов описывающего объект эллипса; M/M RadCirc – отношение максимального радиуса к минимальному из центра описывающей объект окружности на границу выпуклой оболочки; M/MHull'sCM – соотношение максимального и минимального радиусов из центра масс выпуклой оболочки на точку на границе объекта; BiggestD – фрактальная размерность контурных изображений, подсчитанная с учетом квадратов лишь больше среднего размера; outMeanD – среднее значение фрактальной размерности, рассчитанное методом подсчета квадратов с учетом множественного наложения решетки с разной ориентацией квадратов на контурное изображение клетки; LF – лакунарность, рассчитанная на основе различий числа пикселей в каждом квадрате изображения при всех ориентациях квадратной решетки с учетом пикселей изображения и без учета пикселей фона (F – foreground mass, пиксели изображения), LF = (Σ[FΛ])/GRIDS; outMeanLFD – средняя локальная фрактальная размерность контурных изображений клеток, подсчитанная этим же способом; outMeanLCFD – средняя локальная связанная фрактальная размерность контурных изображений клеток; outLCFD PreLac – мера гетерогенности или трансляционной инвариантности контурного изображения клеток; MeanΛ – средняя лакунарность, подсчитанная при разных ориентациях решетки; LCFD – связанная локальная размерность, которая подсчитывается непосредственно вокруг пикселя, соединенного с соседними пикселями изображения (пиксель считается связанным, если в квадрате 8 на 8 пикселей вокруг него имеются другие пиксели); MMFD – средняя массовая размерность силуэтных изображений: фрактальная размерность, подсчитанная с учетом числа пикселей в квадратах пробирующей функции DBmass = lim ε → 0[ln με/ln  ε], lim ε → 0, определяется как наклон линии регрессии для με и ε, где με – среднее число пикселей в квадрате со стороной ε; Circ – округлость клетки, равна 4π × площадь/периметр² клетки; Hull’sCirc – округлость выпуклой оболочки, равна 4π × площадь/периметр² выпуклой оболочки. Параметры были нормализованы для выравнивания их вклада в классификацию в качестве кластерных переменных.

Одна из главных проблем кластерного анализа, так называемое “проклятие размерности”, заключается в том, что качество кластеризации быстро ухудшается с увеличением размерности модели – числа параметров (Gordon, 1999; Xu, Wunsch, 2008).

Корреляцию между параметрами измеряли с помощью метода линейного корреляционного анализа Пирсона. Для сокращения числа переменных из анализа исключали параметры, имеющие высокое значение линейной корреляции Пирсона, предположительно описывающие близкие морфологические свойства. При выборе из двух высоко коррелированных параметров предпочтение отдавали параметру с более высоким индексом мультимодальности, определяющим, является ли распределение значений признака моно-, би- или мультимодальным (Schweitzer, Renehan, 1997). Среди параметров, нагружающих каждый фактор, отбирали параметры с максимальным индексом мультимодальности (Karetin, Pushchin, 2015).

При выделении факторов в факторном анализе использовали ортогональное вращение основных факторных осей методом Варимакс (Varimax). Метод Варимакс максимизирует разброс квадратов нагрузок для каждого фактора, что приводит к увеличению больших и к уменьшению малых значений факторных нагрузок.

Для классификации клеток использовали иерархический кластерный анализ с правилом объединения кластеров по методу Варда и с евклидовым расстоянием в качестве меры близости. Снижение размерности параметрического пространства осуществляли с помощью факторного анализа. Для проверки кластерной структуры использовали дисперсионный анализ.

Статистическую достоверность кластерных решений определяли, оценивая значимость различий между кластерами с использованием однонаправленных ANOVA тестов Крускала–Уоллиса с ретроспективными тестами Манна–Уитни U (Sheskin, 2000). Оценивали также величину эффекта между кластерными различиями. Эта статистика обеспечивает лучшее понимание факторов, лежащих в основе межкластерных различий, позволяя сравнивать результаты, полученные в разных условиях, для разных видов и т.д., а также, что более важно, выявляет небольшие и тривиальные эффекты, формальное значение которых может быть обусловлено чрезмерным размером выборки (Fritz et al., 2012). В настоящем исследовании в качестве величины эффекта для сравнения парных различий между кластерами использован коэффициент Коэна r (Cohen, 1988), который рассчитывали следующим образом: r = Z/SQRT(N), где Z – Z-оценка для соответствующего сравнения, а N – объединенный размер выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате проведенного анализа установлено, что 31–34 параметра клеток каждого вида показали достоверно высокую (p < 0.05000) корреляцию с одним параметром или более. Для анализа морфологии гемоцитов и целомоцитов отбирали 9–11 слабо коррелированных (менее 0.6) или некоррелированных параметров с наибольшим индексом мультимодальности (табл. 1).

Для дальнейшего уменьшения числа переменных применяли два подхода: отбор некоррелированных переменных с индексом мультимодальности выше заданного порога и факторный анализ. При этом для классификации использовали как сами факторы, так и нагружающие их параметры.

У исследованных видов (кроме C. brevisiphonata) параметры нагружали 4 фактора. При этом первый фактор у всех четырех видов был нагружен фрактальными размерностями и лакунарностями разных типов; в целом он отражал квазифрактальные характеристики морфологии клеток. Второй фактор был нагружен параметрами, отражающими такие размерные характеристики клетки, как площадь, периметр, размеры описывающей клетку окружности и выпуклой оболочки. Третий фактор (у A. japonica – четвертый) был нагружен параметрами, описывающими округлость и вытянутость клетки, а также ее выпуклой оболочки (Round, AR, Hull’sCirc); четвертый фактор (у A. japonica – третий) был нагружен параметрами, связанными с локальной фрактальной размерностью и массовой размерностью контурных изображений клеток: outMeanLCFD, outMeanLFD, outLCFD PreLac и outMMFD. Таким образом, у всех исследованных видов нагрузки большинства параметров оказались распределены сходным образом по четырем факторам, определяющим основные характеристики клеточной морфологии. Пятый фактор у C. brevisiphonata оказался нагружен квазифрактальными параметрами контурных изображений, которые у остальных видов объединялись с квазифрактальными параметрами силуэтных изображений в первом факторе. Однако объясненная нагрузка четвертого фактора у C. brevisiphonata упала ниже 3, тогда как у остальных видов ниже 3 она была только у факторов, не имеющих ни одного достоверно нагружающего их параметра. Чтобы формально и единообразно ограничить число использованных в кластеризации параметров, в качестве переменных использовали факторы лишь с объясненной нагрузкой выше 3 и достоверно нагружаемые хотя бы одним параметром. Данным условиям у каждого вида соответствовали 4 фактора, взятые в качестве четырех параметров для кластеризации. Кроме этого для кластерного анализа использовали параметры с максимальным индексом мультимодальности, нагружающие каждый фактор (табл. 2).

Самая низкая величина эффекта (0.26–0.38), подсчитанная для использованных параметров всех пар кластеров, получена для кластерных решений на основе четырех параметров, отобранных только по величине индекса мультимодальности, без факторного анализа. Более высокой величиной эффекта (0.39–0.46) характеризовались кластерные структуры с факторами, использованными в качестве параметров кластеризации. Однако у всех изученных видов наибольшие значения величины эффекта (0.41–0.47) имели кластерные структуры, построенные на основе нагружающих выбранные факторы четырех параметров с наивысшим индексом мультимодальности (табл. 2). Самую высокую величину эффекта для A. japonica и C. brevisiphonata показало четырехкластерное решение (0.4782 и 0.46957 соответственно), а для A. amurensis и S. sachalinensis оптимальным было трехкластерное решение (0.46884 и 0.46506 соответственно) (рис. 1).

Рис. 1.

Кластерные решения с самой высокой величиной эффекта для иммунных клеток Aphelasterias japonica, Callista brevisiphonata, Asterias amurensis и Spisula sachalinensis.

Кластерная модель классификации целомоцитов A. japonica выделила четыре морфологических типа клеток (рис. 2). Тип I – крупные наименее отростчатые клетки с самым низким значением фрактальной размерности контурных изображений (outMeanD), что характерно для клеток с простой топологией клеточных границ. Тип II – самые мелкие клетки с простой микроскульптурой границ, не имеющей филоподиальных отростков. Тип III объединил самые крупные симметричные (практически округлые) клетки со сложной микроскульптурой границ, покрытой мелкими многочисленными отростками. Тип IV – это клетки наиболее неправильной асимметричной формы с самыми низкими значениями параметров округлости (Circularity) и закругленности (Roundness), а также с наиболее высокими значениями лакунарности (LF) и параметра 1/2half, отражающего асимметричность клетки внутри описывающей клетку окружности.

Рис. 2.

Силуэтные изображения разных типов целомоцитов морской звезды Aphelasterias japonica.

Оптимальная кластерная структура C. brevisiphonata включала четыре морфологических типа клеток (рис. 3). Тип I – клетки с наиболее простой микроскульптурой границ, с низкими лакунарностью и фрактальной размерностью контурных изображений, а также с самыми высокими значениями округлости и плотности, что характеризует морфологически простые симметричные клетки. Тип II – это вытянутые клетки; значение закругленности у клеток данного типа было значительно ниже, чем у клеток других морфотипов. Морфологически тип III объединил несколько более отростчатые, чем в типе I, клетки; по многим параметрам они ближе к клеткам типа II, но значительно отличаются от них большим значением лакунарности (LF) и параметром закругленности, который ближе к таковому у клеток типа I. Тип IV – это крупные клетки самой сложной морфологии с длинными ветвящимися отростками. Клетки типа IV больше клеток других типов по фрактальной размерности контурных изображений (outMeanD), площади и лакунарности. Они характеризуются минимальными значениями параметров округлости и плотности как асимметричные клетки с большой площадью стратификации отростков.

Рис. 3.

Силуэтные изображения разных типов гемоцитов двустворчатого моллюска Callista brevisiphonata.

Классификация иммунных клеток A. amurensis с лучшим значением величины эффекта включала три типа клеток (рис. 4). Тип I – самые крупные клетки с большими отростками неправильной формы, а также с наибольшими значениями площади, лакунарности, фрактальной размерности контурных изображений и с минимальным значением параметра плотности. Тип II – округлые клетки почти без отростков с наименьшими значениями LF и outMeanD и с максимальным значением округлости. Клетки типа III – это вытянутые клетки средней сложности наименьшего размера с максимальным значением AR; в данный тип входят клетки с оптически перфорированной в процессе распластывания мембраной, характерные для распластанных целомоцитов A. amurensis.

Рис. 4.

Силуэтные изображения разных типов целомоцитов морской звезды Asterias amurensis.

Оптимальная кластерная модель S. sachalinensis, как и A. amurensis, выделила три типа клеток. Тип I – клетки с самыми высокими среди выделенных типов клеток значениями параметров outMeanD, LF и Per, что характеризует клетки сложной морфологии с большим числом крупных и мелких отростков. Клетки типа II, как и клетки этого типа у C. brevisiphonata, имеют самое высокое значение параметра LCFD PreLac и среднее, но достоверно отличное, значение фрактальной размерности контурных изображений. Визуально у таких клеток более простая “усредненная” форма с меньшим числом небольших отростков. К типу III отнесены клетки c меньшей, чем у других типов, площадью распластывания, с самым высоким значением параметра AR и низким показателем outMeanD. Визуально они имеют наиболее простую микроскульптуру границ с минимальным числом отростков, однако общая форма клеток типа III разнообразна и асимметрична. Как правило, клетки этого типа вытянутые, а иногда слегка закругленные, что характерно для движущихся клеток (рис. 5).

Рис. 5.

Силуэтные изображения разных типов гемоцитов двустворчатого моллюска Spisula sachalinensis.

В соответствии с тестом множественного сравнения Tukey–Kramer на различие средних значений, выделенные клеточные типы достоверно различались по большинству классифицирующих параметров и по ряду иных параметров линейной и квазифрактальной морфологии. Исходя из значений частной лямбды Уилкса, кластерная структура A. japonica опиралась прежде всего на квазифрактальные параметры. Вклад параметров в классификацию клеток A. amurensis и S. sachalinensis был близок к равномерному; вклад всех четырех использованных параметров в классификацию клеток C. brevisiphonata также оказался высоким, причем наибольшим он был для параметра AR (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на то, что лучшая классификация клеток каждого исследованного вида включает разные параметры и выделяет видоспецифичные типы, которые различаются аспектами морфологии, оптимальная классификационная структура иммунных клеток всех изученных видов основана на сходном алгоритме, который включает иерархическую классификацию методом Варда, а в качестве межкластерного различия используется евклидово расстояние. Данный метод кластеризации показал наилучшие результаты при классификации нейронов (Pushchin, Karetin, 2009, 2014) и иммунных клеток беспозвоночных (Karetin, Pushchin, 2015). Количество тестируемых кластеров не превышало число клеточных типов, обычно выделяемое в иммунной системе беспозвоночных (3–6) (Dyrynda et al., 1997; Chang et al., 2005); тестировались также наборы кластеров с расстоянием межкластерной связи, визуально значительно превосходящим расстояния между следующими бифуркациями деления кластеров.

Для классификации отбираются параметры с самым высоким индексом мультимодальности, нагружающие факторы факторного анализа. Классификационная модель с наилучшей кластерной структурой сочетает как линейные, так и квазифрактальные параметры, отражая разные аспекты клеточной морфологии. В одни и те же факторы, полученные в результате факторного анализа, распределяются параметры, описывающие схожие аспекты морфологии. Благодаря этому в классификации клеток исследованных видов представлены параметры, отражающие асимметрию клеток (AR) и размерные характеристики (Per), а также квазифрактальные параметры, описывающие сложность структуры силуэтных (MMFD) и контурных изображений клеток (outMeanD). При этом из всех параметров, представляющих каждый аспект морфологии, выбран один, распределение которого в выборке наиболее мультимодально, следовательно, выборка по данному параметру гетерогенна и этот параметр наиболее четко раскрывает ее составную структуру, включающую клетки разных морфологических типов.

Согласно традиционной цитологической классификации, адгезированные in vitro клетки исследованных беспозвоночных можно отнести к одному типу, который характеризуется агранулярной базофильной цитоплазмой. Однако в широкой морфологической вариабельности адгезированных клеток четко выделяются видоспецифичные морфотипы, различающиеся некоторыми линейными и нелинейными морфологическими параметрами.

Традиционные цитологические параметры классификации иммунных клеток беспозвоночных включают такие признаки, как гранулярность цитоплазмы, ядерно-цитоплазматические отношения и способность к фагоцитозу. Агранулоциты характеризуются меньшими размерами, чем гранулоциты, более высоким отношением ядра к цитоплазме и отсутствием гранул (Donaghy et al., 2009; Matozzo, Bailo, 2015). Гиалиноциты, как и гранулоциты, делят на маленькие и большие (Preziosi, Bowden, 2016). Многие из этих признаков обладают вариабельностью (Fisher, 1986), например, гранулоциты могут иметь агранулярных предшественников; по опубликованным данным (Martin, Hose, 1992), гранулы могут появляться или теряться при изменении условий или присутствовать в клетках, которые по другим морфологическим признакам определяются как гиалиноциты.

Характеристика внешней морфологии в естественной классификации иммунных клеток беспозвоночных занимает не последнее место, поскольку внешняя морфология клеток определяется множеством факторов: функциональной динамикой, в частности, реакциями на особенности внешней среды (Paine et al., 1994); внеклеточным матриксом (Ingber, 1990); генетическими (Qiu et al., 2002) и биохимическими (Fairbanks et al., 2009) особенностями, в частности, структурой цитоскелета (Suzuki, Ohno, 2006), а также набором молекул клеточной адгезии (Racusen, 1994). Анализ морфологии клеток принципиален для понимания их функционального состояния и закономерностей онтогенеза (Kilian et al., 2010).

Главный с биологической точки зрения вопрос при рассмотрении морфологии клеток разных видов животных: чем определяется различие морфологии распластанных гемоцитов у разных видов беспозвоночных? Независимо от того, лежат ли в основе различий форм гемоцитов и целомоцитов у разных видов экологические причины и подвержены ли особенности их морфологии естественному отбору, кажется несомненным, что различие клеточных форм определяется генетически. Оно связано с такими различиями клеточной физиологии, как общая структура и динамика цитоскелета, видоспецифические особенности клеточного поведения, функционирование рецепторов клеточной адгезии, взаимодействие клетка–клетка и клетка–субстрат. Поэтому логичен переход к рассмотрению клеточных форм на основе биологического анализа параметров, описывающих формы клеток. Возможно, это даст ответ на вопрос: какие именно генетические и цитофизиологические видоспецифичные особенности клетки определяют значение того или иного рассматриваемого параметра, а также позволит прогнозировать особенности клеточной физиологии, исходя из детального морфологического анализа. Разработка численного формального алгоритма описания внешней морфологии клеток in vitro имеет практическое значение для статистически достоверного описания морфологии культивируемых клеток как в норме, так и в эксперименте, где до сих пор используется неформализованный, неточный язык описания клеточных форм.

Предложенная методология классификации клеток по морфологическим критериям позволила выделить обладающий наибольшей дискриминирующей силой набор морфологических параметров для каждого исследованного вида беспозвоночных. При этом общий алгоритм оптимальной классификации остается неизменным, несмотря на различие отобранных параметров и индивидуальные морфологические особенности типов клеток, выделенных из разных животных. Примененный нами подход классификации иммунных клеток по морфологическим критериям с использованием квазифрактальных параметров может стать альтернативой или дополнением к классическим подходам описания и классификации полиморфных клеток, в частности элементов иммунной системы беспозвоночных, позволяя выделить присутствующие в популяции морфотипы клеток и благодаря этому повышая дискриминирующую способность существующих моделей классификации клеток in vitro.