Биология моря, 2020, T. 46, № 2, стр. 135-141

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Вегетативные талломы Palmaria palmata, приблизительно равные по размеру и массе, отбирали на побережье губы Зеленецкая Баренцева моря (69°07′09″ с.ш., 36°05′35″ в.д.), очищали от обрастателей и помещали в стеклянные емкости с морской водой объемом 1.3 л.

Морскую воду соленостью 33‰ предварительно фильтровали через ватно-марлевый фильтр и добавляли в нее летнее ДТ в количестве 1 мг/л, что составляет 20 ПДК для воды по валовому содержанию НП. Морскую воду и ДТ не стерилизовали.

Опыт проводили в термостатируемом боксе при температуре 7–8°C, освещении 16–18 Вт/м² и постоянной аэрации воды. Общая продолжительность эксперимента составила 21 сут. Каждые 7 сут образцы воды и водоросли отбирали и анализировали. У водоросли исследовали изменение морфологии и фотосинтеза; в воде и в талломах определяли содержание 17 индивидуальных алканов ДТ (включая изопреноиды пристан и фитан) и валовое содержание НП. В течение опыта изменение состояния и морфологии таллома пальмарии контролировали визуально и с помощью светооптических методов с использованием микроскопа МИКМЕД-6.

Интенсивность видимого фотосинтеза (ИФ) пальмарии определяли по изменению содержания кислорода в воде до и после инкубации талломов с помощью оксиметра HANNA HI 9141 (Германия) и йодометрическим методом Винклера. Интенсивность фотосинтеза рассчитывали в микрограммах О₂ на 1 г сырой массы таллома в час (Вознесенский и др., 1965). Активность фермента каталазы (АК) анализировали с помощью спектрофотометрического метода (Королюк, 1988). Измерения проводили на спектрофотометре JENWAY 6305 UV/VIS.

Фотосинтетические пигменты экстрагировали по общепринятым методикам (Ли, 1978). Спектры поглощения экстрактов регистрировали спектрофотометрически; концентрации пигментов рассчитывали по формулам (Seely et al., 1972; Rosenberg, 1981).

Валовое содержание НП и концентрации алканов в воде и в талломах определяли методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС).

Пробоподготовку и инструментальный анализ выполняли на основе методики ЕРА 8270 (Semivolatile Organic Compounds by GC/MS). Для подготовки проб воды применяли жидкостно-жидкостную экстракцию при нейтральном значении показателя кислотности среды. Образцы водоросли экстрагировали в ультразвуковой установке. Раствор внутреннего стандарта (2-фторнафталин) вводили в пробы воды и водоросли непосредственно перед экстракцией. Экстракты анализировали с использованием хроматомасс-спектрометра единичного разрешения DSQII фирмы “Thermo Finnigan” (Германия). Массовую долю содержания компонентов ДТ рассчитывали c помощью метода внутреннего стандарта. Результаты представлены в микрограммах на литр (мкг/л) для воды и в микрограммах на грамм (мкг/г) сухой массы для водорослей. При расчете концентрации учитывали коэффициент чувствительности масс-спектрометрического детектора в пáрах 2-фторнафталин/дейтерированный пентадекан (D₃₂) и 2-фторнафталин/дейтерированный эйкозан (D₄₂).

Для оценки фонового уровня НП анализировали пробы воды и P. palmata из губы Зеленецкая.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В течение эксперимента морфологических различий у контрольных и опытных растений не наблюдали. Интенсивность фотосинтеза (ИФ) у контрольных растений в течение всего эксперимента сохранялась приблизительно на одном уровне и составляла 0.09−0.13 мкг О₂/г сыр. массы/ч. У опытных растений после 7 сут воздействия ДТ зарегистрировано значительное повышение ИФ, которая снижалась к 21 сут эксперимента (рис. 1). За время исследования концентрация хлорофилла a и каротиноидов у Palmaria palmata снизилась с 0.15 до 0.04 и с 0.05 до 0.01 мкг/г сыр. массы соответственно.

Рис. 1.

Изменение интенсивности фотосинтеза у Palmaria palmata в течение эксперимента. Вертикальные линии − границы стандартного отклонения.

Активность каталазы у контрольных образцов пальмарии в течение опыта изменялась незначительно: отмечено ее постепенное повышение до 14 сут эксперимента, но на 21-е сут она снизилась до начального уровня. У опытных образцов активность каталазы не изменялась и была выше начального уровня (рис. 2).

Рис. 2.

Изменение активности каталазы в клетках Palmaria palmata в течение эксперимента.

Валовое содержание НП в природной воде губы Зеленецкая составляло 192 мкг/л (около 4 ПДК), т.е. анализируемые нами водоросли обитали в слабо загрязненной НП среде. Качественный состав НП был представлен в основном н-алканами С₁₁–С₂₅, концентрация которых составляла 0.1−5.3 мкг/л. Углеводородная “гребенка” на хроматограммах при этом характеризовалась монотонным распределением гомологов. Дополнительно для выявления их генезиса использовали следующие соотношения: С₁₇/С₁₈, пристан/фитан (Pr/Ph), СРI (отношение нечетных к четным гомологам) в области C₁₃–C₂₂, а также показатель биогенности (С₁₅ + С₁₇)/2С₁₆ (Немировская, 2013). Расчетные данные показали низкие значения (<1) соотношений С₁₇/С₁₈, Pr/Ph и СРI (C₁₃–C₂₂). После внесения в морскую воду 1 мг/л ДТ (0 сут, начало эксперимента) валовое содержание НП составило 1049 мкг/л, а сумма 17 алканов достигла 386 мкг/л. В присутствии пальмарии валовое содержание НП и сумма алканов в воде на 21-е сут эксперимента снизились в несколько раз по сравнению с таковыми в начале опыта и составили соответственно 226 и 35 мкг/л, что практически соответствует показателям контрольного образца до внесения ДТ (рис. 3).

Рис. 3.

Изменение валового содержания нефтепродуктов (НП) в воде и в Palmaria palmata в течение эксперимента. Длительность эксперимента, сут: 0/0 − образцы до внесения дизельного топлива (ДТ); 0/1 − начало эксперимента, внесение ДТ в воду; 7, 14 и 21 cут − время от начала эксперимента.

Результаты исследования индивидуальных соединений в образцах воды демонстрировали активный процесс трансформации алканов при увеличении времени. На хроматограммах наблюдалось постепенное смещение максимума углеводородного “горба” в сторону более “легких” соединений, а также увеличение относительного содержания разветвленных алканов (рис. 4). Результаты анализа также показали отсутствие в воде и в талломах окисленных структур (альдегидов, кетонов); это позволяет предположить, что деструкция внесенных НП происходила преимущественно за счет уменьшения длины алкильной цепочки.

Рис. 4.

Масс-хроматограммы проб воды на начальной 0 сут (а) и конечной 21 сут (б) стадиях эксперимента в режиме регистрации характеристичного для алканов иона.

В контрольном образце водоросли (без внесения ДТ) валовое содержание НП составляло 124 мкг/г, а сумма 17 алканов не превышала 30 мкг/г. В эксперименте максимальные значения валового содержания НП и суммы алканов в водоросли отмечены на 14-е сут – 1586 и 249 мкг/г соответственно. На 21-е сут концентрации анализируемых показателей в P. palmata значительно снизились (рис. 3−5). Исключение составлял н-гептадекан, который, будучи эндогенным соединением, накапливался в тканях водоросли. В ходе эксперимента наряду с изменением концентрации н-алканов изменялся профиль их распределения (рис. 5; для сравнения отдельно приведен характерный профиль распределения алканов ДТ). Это может свидетельствовать не только о накоплении НП талломом водоросли, но и об их деструкции.

Рис. 5.

(а) – содержание индивидуальных алканов в Palmaria palmata на разных стадиях эксперимента: 0, 7, 14, 21 сут (исключены изопреноиды пристан и фитан), а также н-гептадекан С₁₇ как эндогенный компонент. (б) – профиль распределения н-алканов в образце дизельного топлива (ДТ).

ОБСУЖДЕНИЕ

Обитание Palmaria palmata в природной среде (губа Зеленецкая) с незначительным загрязнением (4 ПДК), по-видимому, способствовало выработке у водоросли определенного диапазона толерантности к НП. Именно этим можно объяснить сохранение функциональной активности у пальмарии в течение всего эксперимента при концентрации НП 20 ПДК. При длительном пребывании (21 сут) водоросли под влиянием НП отмечено незначительное снижение фотосинтеза. У “контрольных” растений, которые росли в воде без добавления НП, интенсивность фотосинтеза к концу опыта повысилась, что свидетельствует о влиянии на их функциональное состояние именно НП. Аналогичный эффект наблюдался в опытах на ульварии (Воскобойников и др., 2018). Полученные результаты согласуются с опубликованными данными (Степаньян, 2008) о возможном стимулирующем действии низких концентраций ДТ на фотосинтез морских макрофитов. Повышение содержания кислорода в воде, отмеченное на 7-е сут опыта (рис. 1), по-видимому, обеспечивали и цианобактерии. Увеличение выделяемого ими кислорода в ответ на повышение в воде содержания НП наблюдали и ранее (Гусев и др., 1981).

В исследованиях, посвященных определению активности каталазы у водорослей-макрофитов, отмечено, что этот фермент реагирует на комплексное загрязнение, в том числе органикой (Мильчакова, Шахматова, 2007). Его активность выше в условиях загрязнения. В экспериментах на микроводорослях было показано, что каталаза реагирует на более высокие концентрации дизельного топлива в среде по сравнению с другими ферментами антиоксидантной системы, например, с супероксиддисмутазой (Ramadass et al., 2017).

Можно предположить, что используемая в эксперименте добавка ДТ вызывала окислительный стресс в клетках водорослей, что подтверждено повышением активности каталазы. Однако значительного усиления/подавления активности фермента не происходило, что также свидетельствует о толерантности пальмарии к содержанию НП в воде на уровне 20 ПДК. Синтез антиоксидантных ферментов находится в обратной зависимости от концентрации хлорофиллов. Такие данные получены для микроводорослей (Ramadass et al., 2017). В нашей работе под действием ДТ концентрации хлорофилла a и каротиноидов снизились в 3−4 раза по сравнению с контролем. Это может свидетельствовать о более активной выработке антиоксидантных ферментов, в частности супероксиддисмутазы, у растений в опыте.

Установлено, что у пальмарии, так же как у фукуса и ульварии (Воскобойников и др., 2017, 2018), накопление НП происходило одновременно с уменьшением их содержания в воде (рис. 3). Проведенный качественный анализ выявленных НП в морской воде показал преимущественно нефтяной источник поступления алканов. Можно предположить, что превышение ПДК по содержанию НП в воде в губе Зеленецкая связано с работой в июле−августе маломерного флота, используемого дайвинг-клубом, расположенным на побережье губы. Однако было показано, что часть алканов имеет биогенную природу. Анализ углеводородов, содержавшихся в пальмарии, указал на нефтяное происхождение алканов, сорбированных водорослью из водной среды. Выявленный н-гептадекан (С17), по-видимому, продуцируется самой водорослью (Миронов, 1985; Немировская, 2013). Повышенное содержание н-С17 типично для природных сред с автохтонным (морским) биогенным составом углеводородов (Немировская, 2013).

Таким образом, в эксперименте P. palmata продемонстрировала выраженную способность к постепенной очистке воды от внесенных НП. В условиях умеренного загрязнения нефтепродуктами пальмария сохраняла физиологическую активность, проявляла выраженную способность к сорбции и деструкции НП. При этом уменьшение содержания компонентов ДТ в воде происходило одновременно с их накоплением в талломах водоросли. В деструкции ДТ у пальмарии, как и у исследованных ранее водорослей (ульварии и фукуса), по-видимому, задействован весь таллом. Она начинается на поверхности водоросли с помощью эпифитных УОБ, что обеспечивает поглощение и нейтрализацию НП клетками растения. Об этом свидетельствовала стабильная метаболическая активность клеток Р. palmata под влиянием ДТ в течение всего эксперимента (21 сут). Данное предположение подтверждено увеличением численности эпифитных УОБ на поверхности нескольких видов водорослей в условиях загрязнения НП среды обитания (Пуговкин и др., 2016; Воскобойников и др., 2017). Результаты проведенного исследования и полученные ранее данные позволяют говорить о способности большой группы макроводорослей к очистке морской среды от НП независимо от строения и систематической принадлежности водорослей. Предполагается, что основным фактором участия макроводорослей в биоремедиации является возможность образовывать симбиотические ассоциации с углеводородокисляющими микроорганизмами.