1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биология моря
  4. T. 46, № 4, 2020

Биология моря, 2020, T. 46, № 4, стр. 285-288

Гидролитические ферменты из морских организмов как ингибиторы образования биопленок

Н. А. Терентьева 1, *, Н. С. Буйновская 1, Ю. А. Носкова 1, Л. В. Слепченко 1, 2, О. И. Недашковская 1, Л. А. Текутьева 2, Л. А. Балабанова 1, 2

1 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
690022 Владивосток, Россия

2 Дальневосточный федеральный университет, Школа биомедицины
690091 Владивосток, Россия

* E-mail: nattere@mail.ru

Поступила в редакцию 29.11.2019
После доработки 28.01.2020
Принята к публикации 30.01.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучено влияние гидролитических ферментов из морских источников на образование и разрушение бактериальных биопленок. Установлено, что рост биопленок разных видов морских бактерий стимулировался в присутствии α-D-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701, тогда как формирование биопленок бактерий Bacillus subtilis и Yersinia pseudotuberculosis ингибировалось этим ферментом. Обработка зрелых биопленок α-галактозидазой приводила к разрушению от 5 до 35% биопленки у разных видов бактерий. Фосфодиэстераза и щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia amphilecti КММ 296 оказывали ингибирующее действие на биопленки морских штаммов Bacillus licheniformis, B. aegricola и B. berkelogi, а также диспергировали уже сформированные биопленки этих бацилл и иерсинии. ДНКаза гепатопанкреаса краба ингибировала образование биопленки у Y. pseudotuberculosis и B. subtilis, частично разрушая зрелую биопленку.

Ключевые слова: биопленка, ингибиторы, морские микроорганизмы, ферменты

Большинство видов бактерий существует в природе в виде специфически организованных биопленок (biofilms). Бактериальная биопленка – это сообщество одного или нескольких видов бактерий, прикрепленных к поверхности или друг к другу и заключенных в матрикс из синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ (Costerton et al., 1999; Романова, Гинцбург, 2011). В состав внеклеточного матрикса биопленки входят экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества (Flemming, Wingender, 2010). Биопленка защищает бактерии от неблагоприятных абиотических факторов внешней среды, а также от факторов специфической и неспецифической защиты иммунной системы хозяина. Бактерии в биопленке могут “общаться” между собой посредством секреторных интермедиаторов, которые служат основой их “социального” поведения, или “quorum sensing“ (Lazar, 2011). Исследование биопленок вызывает огромный интерес, поскольку микроорганизмы способны образовывать биопленки на любых биотических и абиотических поверхностях. В медицине проблема связана с образованием биопленок на протезах, катетерах, шунтах и контактных линзах (Романова, Гинцбург, 2011). Особое внимание уделяется изучению образования биопленки патогенными бактериями, поскольку причиной многих хронических инфекций являются микроорганизмы, растущие в виде биопленок (Römling, Balsalobre, 2012). Устойчивость к антибиотикам у бактерий в биопленке в 1000 раз больше, чем у планктонных форм (Costerton et al., 1999; Романова, Гинцбург, 2011).

Для ингибирования образования бактериальной биопленки и ее разрушения могут быть использованы низкомолекулярные вещества, или ферменты (Fleming, Rumbaugh, 2017). В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение действия некоторых гидролитических ферментов из морских источников на формирование и разрушение биопленки, образованной разными видами микроорганизмов, в том числе обитателями моря.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

В работе использовали штаммы Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. aegricola и B. berkelogi из коллекции ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН и клинический штамм Yersinia pseudotuberculosis 512pYV+ из коллекции ФГБУ НИИЭМ. Применяли метод, основанный на способности бактерий формировать биопленки на полистероловых 96-луночных планшетах и на окрашивании биопленок кристалл виолетом (O’Toole, 2011), что позволяет быстро определять количество образованных микроорганизмами биопленок в разных условиях культивирования, а также исследовать влияние на этот процесс различных агентов (Nijland et al., 2010).

Изучали действие на биопленки разных концентраций ДНКазы (КФ 3.1.21.1) из гепатопанкреаса краба (Мензорова и др., 1994), α-галактозидазы (КФ 3.2.1.22) морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 (Патент РФ № 2012142209/10), фосфодиэстеразы (КФ 3.1.4.1) морской бактерии Cobetia amphilecti КММ 296 (Noskova et al., 2018) и щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) морской бактерии C. amphilecti КММ 296 (ранее Cobetia marina КММ 296) (Голотин и др., 2015). Все эксперименты проводили в 4–8 повторностях. Контролем служила среда c микроорганизмами без добавления ферментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что основную часть внеклеточного матрикса биопленки составляют полисахариды, состав которых у разных бактерий различается (Flemming, Wingender, 2010). Экзополисахариды помогают бактериям выживать в морской среде, а также являются факторами, способствующими их проникновению в организм человека в период сезонных эпидемий. В связи с этим весьма актуальным является изучение влияния гликозидаз на формирование биопленок морских бактерий, участвующих в трансформации углеводов и углеводсодержащих биополимеров.

Мы изучали влияние рекомбинантного белка α-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. штамма КММ 701 на формирование биопленки разными штаммами микроорганизмов. Этот фермент катализирует гидролиз α-галактозидной связи в олигосахаридах (раффиноза, мелибиоза, стахиоза), в полисахаридах (галактоманнаны), а также в гликоконьюгатах, включая гликопротеины и гликолипиды (Патент РФ № 201214222012).

Исследование роста биопленок морских видов из рода Bacillus показало, что в течение трех суток при комнатной температуре α-галактозидаза (0.5 ед./мл) вызывала небольшое увеличение количества биопленок морских бактерий, тогда как формирование биопленки B. subtilis ингибировалось на ~20% (табл. 1). Ингибирование наблюдалось и при образовании биопленки Y. pseudotuberculosis. Микроорганизмы рода Yersinia относятся к возбудителям сапрозоонозов, обладающих сапрофитной и паразитической природой. Они способны существовать как в организме человека и животных, вызывая инфекционный процесс, так и в объектах окружающей среды (Сомов, 2004). Бактерии рода Yersinia обнаружены также в морской воде и гидробионтах (морские ежи, голотурии, трепанг) (Кузнецов и др., 2006).

Таблица 1.  

Влияние ферментов на формирование (1) и разрушение (2) биопленки (в %)

Штамм микроорганизма Фермент
фосфодиэстераза
(0.1 ед./мл) 		щелочная фосфатаза
(1.75 ед./мл) 		α-галактозидаза
(0.5 ед./мл)
  1 2 1 2 1 2
Bacillus subtilis 100 ± 6 0 100 ± 5 0 78 ± 4 28 ± 1
B. licheniformis 74 ± 4 15 ± 2 57 ± 3 35 ± 2 125 ± 7 35 ± 2
B. aegricola 68 ± 4 14 ± 2 49 ± 3 7 ± 1 128 ± 6 10 ± 1
B. berkelogi 82 ± 5 8 ± 1 66 ± 4 3 ± 1 130 ± 7 5 ± 1
Yersinia pseudotuberculosis 85 ± 5 23 ± 3 80 ± 4 27 ± 2 69 ± 4 27 ± 2
Контроль 100 ± 5 0 100 ± 5 0 100 ± 6 0

Примечание. Приведена средняя величина ± стандартное отклонение; 0 – разрушение сформированной биопленки отсутствовало.

Можно предположить, что α-галактозидаза в природном штамме Pseudoalteromonas sp. КММ 701 наряду с другими механизмами может участвовать в процессе формирования биопленки, поскольку данные бактерии часто оказываются в экстремальных условиях выживания. Кроме этого, морские бактерии занимают определенную нишу в симбиотическом сообществе и помогают выживать другим участникам сообщества – бактериям, водорослям и животным. Не исключено, что в определенной мере воздействие фермента на формирование структуры биопленки связано со способностью α-галактозидазы к трансгликозилированию – переносу галактозной группы на другие субстраты (олиго- и полисахариды) (Слепченко и др., 2017; Bakunina et al., 2018).

α-Галактозидаза может также разрушать зрелую биопленку. Обработка биопленки ферментом приводила к разрушению от 5 до 35% биопленки у разных видов бактерий. Ранее было установлено, что α-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701 способна редуцировать такой важнейший фактор пленкообразования, как адгезия, у патогенного микроорганизма Corinebacterium diphtheriae, колонизирующего слизистый эпителий человека (Balabanova et al., 2010), и значительно изменять морфологию внеклеточного матрикса биопленки Pseudomonas aeruginosa (см.: Слепченко и др., 2017).

Бифункциональная щелочная фосфодиэстераза морской бактерии C. amphilecti КММ 296 (0.1 ед./мл) с активностью щелочной фосфатазы, принадлежащая к структурному семейству фосфатаз/фосфодиэстераз, оказывала небольшое ингибирующее действие на биопленки морских бацилл B. licheniformis, B. aegricola и B. berkelogi (18–32%). Она также диспергировала на 8–15% сформированные биопленки данных бацилл и Y. pseudotuberculosis (табл. 1).

Высокоактивная щелочная фосфатаза из этого же штамма морской бактерии C. amphilecti КММ 296 в концентрации 1–2 ед./мл ингибировала образование биопленок у исследуемых видов при инкубировании в течение трех суток при температуре 20–22°С на 20–50%. Разрушение зрелых биопленок составило 5–35% (табл. 1). Это согласуется с данными, полученными для штаммов условно-патогенных бактерий P. aeruginosa, B. subtilis и Salmonella enteitidis, выделенных из замороженных пищевых полуфабрикатов (Balabanova et al., 2017). Преимущество фермента из морского источника заключается в его способности с высокой эффективностью катализировать реакции при пониженных температурах. Это актуально для пищевой промышленности и медицины. Дозозависимый эффект ингибирования и разрушения биопленок щелочными фосфатазами морских бактерий может быть результатом их влияния на механизмы межклеточных коммуникаций бактерий.

Одним из важнейших компонентов матрикса является ДНК. Она играет важную роль в развитии биопленки, обеспечивая ее структурную стабильность и защиту от антимикробных агентов (Gilan, Sivan, 2013). Опубликованы сведения о влиянии нуклеаз на формирование и разрушение биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий (Nijland et al., 2010). Нами показано, что во внеклеточном матриксе биопленки Y. pseudotuberculosis присутствует ДНК и ее разрушение ДНКазой I приводит к уменьшению количества образующейся биопленки (Терентьева и др., 2015). Об этом же свидетельствовуют результаты экспериментов по разрушению уже образовавшейся биопленки Y. pseudotuberculosis данным ферментом.

ДНКаза гепатопанкреаса краба оказывала аналогичное действие на биопленки Y. pseudotuberculosis. При концентрации ДНКазы 20 мкг/мл ингибирование составило 50%. Расщепление внеклеточной ДНК приводит к изменению структуры матрикса биопленки, что позволяет проникать антибиотикам. Таким образом, ДНКазы могут усиливать действие антибиотиков, что приводит к снижению биомассы биопленки и количества КОЕ (Nijland et al., 2010).

Современное представление о биопленках позволяет говорить об изменении подходов к диагностике и лечению инфекций в разных областях медицины и ветеринарии. К настоящему времени разработан ряд перспективных стратегий для борьбы с биопленками. Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии бактерий к поверхности, на нарушение или усиление межклеточного обмена информацией, а также на блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса. Антибиопленочные агенты могут ингибировать формирование биопленок или разрушать зрелые биопленки, действовать отдельно или в сочетании с традиционными антибиотиками. Благодаря способности ферментов морских организмов функционировать с высокой скоростью при пониженных температурах, изученные гидролитические ферменты могут найти применение в борьбе с биопленками в том числе и в медицине. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия.

Список литературы

  1. Голотин В.А., Балабанова Л.А., Буйновская Н.С. и др. Щелочная фосфатаза морской бактерии Cobecia marina как инструмент в исследовании свойств рекомбинантных белков // Вестн. ДВО РАН. 2015. № 6(184). С. 125–131.

  2. Кузнецов В.Г., Лаженцева Л.Ю., Елисейкина М.Г. и др. Распространение бактерий рода Yersinia в морской воде и гидробионтах // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 2006. № 53. С. 117–120.

  3. Мензорова Н.И., Маркова А.В., Рассказов В.А. Высокостабильная Ca, Mg-зависимая ДНКаза из гепатопанкреаса камчатского краба // Биохимия. 1994. Т. 59. С. 449–456.

  4. Патент РФ № 2012142209/10, 03.10.2012. Плазмида 40Gal, определяющая синтез α-галактозидазы α-PsGal, штамм E. coli rosetta (DE3)/40Gal − продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность α-PsGal, и способ ее получения // Патент России № 2504583. 2014. Бюлл. № 2 / Балабанова Л.А., Голотин В.А., Бакунина И.Ю., Рассказов В.А.

  5. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина // Журн. микробиол. 2011. № 33. С. 99–109.

  6. Слепченко Л.В., Балабанова Л.А., Бакунина И.Ю. и др. Свойства и возможная биологическая роль α-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 // Вестн. ДВО РАН. 2017. № 2. С. 51–58.

  7. Сомов Г.П. Современные представления о сапронозах и сапрозоонозах // Ветеринар. патология. 2004. № 3. С. 31–35.

  8. Терентьева Н.А., Тимченко Н.Ф., Балабанова Л.А. и др. Характеристика образования, ингибирования и разрушения биопленок Yersinia pseudotuberculosis, формирующихся на абиотических поверхностях // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 2015. № 3. С. 72–78.

  9. Bakunina I., Slepchenko L., Anastyuk S. et al. Characterization of properties and transglycosylation abilities of recombinant α-galactosidase from cold-adapted marine bacterium Pseudoalteromonas KMM 701 and its C494N and D451A mutants // Mar. Drugs. 2018. V. 16. № 10. P. 349.

  10. Balabanova L.A., Bakunina I.Yu., Nedashkovskaya O.I. et al. Molecular characterization and therapeutic potential of a marine bacterium Pseudoalteromonas spp. KMM 701 α-galactosidase // Mar. Biotechnol. 2010. V. 12. P. 111–120.

  11. Balabanova L., Podvolotskaya A., Slepchenko L. et al. Nucleolytic enzymes from the marine bacterium Cobetia amphilecti KMM 296 with antibiofilm activity and biopreservative effect on meat products // Food Control. 2017. V. 78. P. 270−278. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.02.029

  12. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. 1999. V. 284. P. 1318–1322.

  13. Fleming D., Rumbaugh K.P. Approaches to dispersing medical biofilms // Microorganisms. 2017. V. 5. Art. ID 15. https://doi.org/10.3390/microorganisms5020015

  14. Flemming H.C., Wingender J. The biofilm matrix // Nat. Rev. Microbiol. 2010. V. 8. P. 623–633.

  15. Gilan I., Sivan A. Extracellular DNA plays an important structural role in the biofilm of the plastic degrading actinomycete Rhodococcus rubber // Adv. Microbiol. 2013. V. 3. P. 543–551.

  16. Lazar V. Quorum sensing in biofilms – How to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? // Anaerobe. 2011. V. 17. № 6. P. 280–285.

  17. Nijland R., Hall M.J., Burgess J.G. Dispersal of biofilms by secreted, matrix degrading, bacterial DNase // PLoS One. 2010. V. 5. № 12; Art. ID e15668. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015668

  18. Noskova Y.A., Balabanova L.A., Terentieva N.A. Alkaline phosphatase/phosphodiesterase from marine bacterium Cobetia amphilecti KMM 296 // Vestn. Dal’nevost. Otd. Ross. Akad. Nauk. 2018. № 6. Supplement. P. 94–95.

  19. O ’Toole G.A. Microtiter dish biofilm formation assay // J. Visualized Exp. 2011. V. 47. Art. ID e2437. https://doi.org/10.3791/2437

  20. Römling U., Balsalobre C. Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies // J. Intern. Med. 2012. V. 272. P. 541–561.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биология моря

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал