1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биология моря
  4. T. 47, № 1, 2021

Биология моря, 2021, T. 47, № 1, стр. 40-44

Токсичные метаболиты микромицетов в бурых водорослях семейств Fucaceae и Laminariaceae из Белого моря

А. А. Буркин 1, Г. П. Кононенко 1, *, А. А. Георгиев 2, М. Л. Георгиева 2, 3

1 Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко
123022 Москва, Россия

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
119234 Москва, Россия

3 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе
119021 Москва, Россия

* E-mail: kononenkogp@mail.ru

Поступила в редакцию 08.11.2019
После доработки 05.02.2020
Принята к публикации 24.09.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В бурых водорослях Ascophyllum nodosum, Pelvetia canaliculata, Fucus vesiculosus, Laminaria digitata и Saccharina latissima из Кандалакшского залива Белого моря с помощью иммуноферментного анализа проведен поиск низкомолекулярных метаболитов, известных как микотоксины микромицетов родов Fusarium, Alternaria, Penicillium, Aspergillus и др. В талломах A. nodosum, и F. vesiculosus выявлены Т-2 токсин, диацетоксисцирпенол, дезоксиниваленол, зеараленон, фумонизины группы В, альтернариол, охратоксин А, цитринин, PR-токсин, микофеноловая кислота, афлатоксин В1, стеригматоцистин, циклопиазоновая кислота, эмодин, роридин А и эргоалкалоиды. Показано, что в F. vesiculosus присутствуют почти все перечисленные токсины в значительном количестве. P. canaliculata уступает A. nodosum по содержанию PR-токсина, микофеноловой кислоты, эмодина и роридина А, содержание остальных веществ существенно не различается. У L. digitata и S. latissima анализируемые микотоксины не обнаружены, за исключением следовых количеств эргоалкалоидов.

Ключевые слова: макроводоросли, Fucus, Ascophyllum, Pelvetia, Laminaria, Saccharina, микотоксины, иммуноферментный анализ

Грибы способны продуцировать многообразие вторичных метаболитов, представляющих собой вещества с низкой молекулярной массой, среди которых особый интерес представляет группа микотоксинов. Природная роль этих веществ, распространение, факторы и условия окружающей среды, влияющие на их синтез, – активно развивающаяся область исследований. Значительный прогресс в изучении ассоциативных связей микромицетов с другими организмами во многом достигнут благодаря уникальным возможностям скринингового анализа вторичных метаболитов. В лишайниках и травянистых растениях с помощью унифицированного подхода на основе иммуноферментного анализа (ИФА) обнаружены микотоксины, свойственные грибам из родов Fusarium Link, Alternaria Nees, Penicillium Link, Aspergillus P. Micheli ex Haller и др., и выявлен так называемый метаболический профиль – соотношение их качественного состава и количественного содержания (Буркин, Кононенко, 2013; Кононенко, Буркин, 2019). Грибы данной таксономической принадлежности, обычные для морских биотопов (Höller et al., 2000; Park et al., 2014; Киричук, Пивкин, 2015; Raghukumar, 2017), обладают способностью к биосинтезу разных структурных типов токсичных веществ, в том числе биосинтетических предшественников и аналогов известных микотоксинов (Jiang et al., 2002; Nicoletti, Trincone, 2016; Zhang et al., 2016). Отечественные исследователи подтвердили присутствие потенциально токсигенных видов Alternaria, Penicillium и Aspergillus в микобиоте массовых видов бурых водорослей семейств Fucaceae и Laminariaceae из прибрежной зоны Белого моря (Бубнова, Киреев, 2009; Коновалова, Бубнова, 2011), однако поиск микотоксинов в этих макрофитах не проводился. Цель настоящей работы − изучение встречаемости токсичных метаболитов, синтезируемых микромицетами родов Fusarium, Alternaria, Penicillium, Aspergillus и др., в бурых водорослях из семейств Fucaceae и Laminariaceae.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектами исследования были бурые водоросли Fucus vesiculosus Linnaeus, Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis и Pelvetia canaliculata (Linnaeus) Decaisne & Thuret (семейство Fucaceae), а также Laminaria digitata (Hudson) J.V. Lamouroux и Saccharina latissima (Linnaeus) C.E. Lane, C. Mayes, Druehl & G.W. Saunders (семейство Laminariaceae). Талломы водорослей отбирали 8–9 мая 2019 г. в Кандалакшском заливе Белого моря на северном берегу о-ва Кривой (66°30′ N, 33°08′ E) в типичных местообитаниях данных видов. A. nodosum (6 талломов) и F. vesiculosus (9 талломов) отбирали в средней и нижней литорали, P. canaliculata (5 талломов) – в верхней зоне литорали и супралиторали. В сублиторали отбирали L. digitata (5 талломов) и S. latissima (5 талломов), у которых отделяли стволик (многолетнюю часть) и три фрагмента пластины: основание (зону роста), середину и дистальную часть. У трех талломов S. latissima дистальную часть прошлогодней и сильно обросшей пластины делили на старый и отмирающий фрагменты.

В течение 1–2 ч после сбора образцы водорослей сушили в токе воздуха при температуре 60°С и транспортировали, сохраняя в суховоздушном состоянии; затем их измельчали в лабораторной мельнице. Для экстракции применяли смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 84 : 16 при расходе 10 мл на 1 г навески. Экстракты после 10-кратного разбавления буферным раствором использовали в непрямом конкурентном ИФА. Микотоксины – Т-2 токсин (Т-2), диацетоксисцирпенол (ДАС), дезоксиниваленол (ДОН), зеараленон (ЗЕН), фумонизины (ФУМ), альтернариол (АОЛ), охратоксин А (ОА), цитринин (ЦИТ), афлатоксин В1 (АВ1), стеригматоцистин (СТЕ), циклопиазоновую кислоту (ЦПК), микофеноловую кислоту (МФК), PR-токсин (PR), эмодин (ЭМО), роридин А (РОА) и эргоалкалоиды (ЭА) анализировали с помощью аттестованных иммуноферментных тест-систем (Кононенко, Буркин, 2018, 2019). Нижний предел количественных измерений соответствовал 85% уровню связывания антител.

Данные обсчитывали в программе Microsoft Office Excel и представляли в виде среднего арифметического значения M и ошибки выборочной средней ± SEM; для статистической обработки использовали непараметрический суммарный непарный критерий Вилкоксона в программе R version 3.4.3 (McDonald, 2014).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В талломах двух видов семейства Laminariaceae L. digitata и S. latissima микотоксины не обнаружены, за исключением следовых количеств ЭА (от 2 до 8 нг/г), которые были найдены в зонах роста и в средних частях пластин. В то же время во всех трех видах семейства Fucaceae – A. nodosum, P. canaliculata и F. vesiculosus – присутствовал полный набор искомых метаболитов (табл. 1). По интенсивности накопления четко прослеживались ряды: для фузариотоксинов − ДАС > ДОН > > ФУМ > ЗЕН > Т-2, для токсинов грибов Aspergillus и Penicillium – PR, МФК, ЦПК > ЦИТ, ОА, СТЕ > АВ1. Отдельные виды водорослей не различались по содержанию Т-2, ЦИТ и СТЕ, а в отношении остальных метаболитов этой группы наблюдались признаки как сходства, так и различия. У F. vesiculosus содержание метаболитов было достоверно выше, чем у двух других видов семейства. A. nodosum отличался от P. canaliculata лишь более выраженным накоплением PR и МФК при сходстве или незначимых колебаниях содержания остальных компонентов. Содержание ЭМО и РОА у всех трех видов макрофитов существенно различалось. Сверхвысокие уровни накопления − более 10 тыс. нг/г − определены для ДАС (у всех трех видов), PR (у A. nodosum и F. vesiculosus) и ЭА (у F. vesiculosus).

Таблица 1.  

Содержание микотоксинов в талломах бурых водорослей Pelvetia canaliculata, Ascophyllum nodosum и Fucus vesiculosus

Метаболит Содержание микотоксина, нг/г, М ± SEM
P. canaliculata (n= 5) A. nodosum (n= 6) F. vesiculosus (n= 9)
Т-2 34 ± 2a 29 ± 2a 37 ± 6a
ДАС 13520 ± 717ab 12 200 ± 821a 22 860 ± 3135b
ДОН 1740 ± 54a 1660 ± 195a 4490 ± 859b
ЗЕН 165 ± 15a 175 ± 13a 510 ± 98b
ФУМ 790 ± 79a 765 ± 67a 1700 ± 225b
АОЛ 255 ± 13a 265 ± 16a 1040 ± 245b
ОА 130 ± 9a 115 ± 18a 505 ± 82b
ЦИТ 450 ± 27a 750 ± 118a 630 ± 73a
АВ1 71 ± 8a 125 ± 17ab 160 ± 35b
СТЕ 355 ± 12a 390 ± 19a 510 ± 60a
ЦПК 1080 ± 52a 2165 ± 354b 1910 ± 279ab
PR 4660 ± 521a 13 540 ± 1486b 21 700 ± 1676c
МФК 2460 ± 170a 4460 ± 454b 2945 ± 390a
ЭМО 91 ± 8a 240 ± 40b 1075 ± 357c
PОA 52 ± 4a 180 ± 29b 540 ± 54c
ЭА 255 ± 50a 930 ± 293a 16 560 ± 2944b

Примечание. Надстрочные латинские буквы указывают на значимость различий при p < 0.05. Значения считаются достоверно различными при отсутствии совпадающих букв. Расшифровка сокращенных названий метаболитов приведена в главе “Материал и методика”.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полный набор анализируемых микотоксинов у водорослей семейства Fucaceae указывает на существование в этих макрофитах комплекса биосинтетических путей, известных для отдельных видов микроскопических грибов. F. vesiculosus практически по всем компонентам отличался большей интенсивностью метаболического профиля, чем A. nodosum и P. canaliculata, которые облигатно ассоциированы с эндофитным аскомицетом Stigmidium ascophylli (Cotton) Aptroot (см.: Коновалова и др., 2012). Учитывая возможность влияния микобионта на биохимическую систему организма-хозяина, снижение интенсивности накопления метаболитов без изменения компонентного состава можно объяснить некоторым эффектом сдерживания метаболических процессов без блокирования или стимулирования отдельных реакций.

Различия в накоплении двух фузариогенных трихотец-9-енов (ДАС и Т-2) у водорослей оказались весьма значительными. Возможно, в этих организмах условия обитания продуцирующего гриба или группы грибов в большей мере способствуют реализации биосинтеза ДАС. Бóльшее количество ДАС, чем Т-2, отмечено ранее у травянистых растений, что рассматривалось как редкая аномалия (Kononenko et al., 2015). При изучении макрофитов Белого моря из внутренней части талломов A. nodosum и P. canaliculata получены единичные изоляты рода Fusarium неустановленной видовой принадлежности (Коновалова, Бубнова, 2011), однако у F. vesiculosus, в котором содержание всех анализированных фузариотоксинов было значительно выше, представители этого рода не найдены (Бубнова, Киреев, 2009).

Содержание АОЛ в талломах фукуса было выше, чем в талломах аскофиллума и пельвеции (табл. 1), а один из потенциальных продуцентов этого микотоксина − Alternaria alternata (Fr.) Keissler, был отмечен в составе микобиоты на талломах первых двух видов водорослей (Бубнова, Киреев, 2009; Коновалова, Бубнова, 2011).

По данным микологического анализа, грибы из родов Penicillium и Aspergillus были достаточно широко представлены в живых талломах исследованных макрофитов как по распространенности, так и по видовому разнообразию, среди них P. brevicompactum Dierckx, P. chrysogenum Thom и A. versicolor (Vuill.) Tirab. (см.: Бубнова, Киреев, 2009; Коновалова, Бубнова, 2011) − известные продуценты МФК, PR (Frisvad et al., 2004) и СТЕ (Cole, Cox, 1981). В перечень обнаруженных нами токсинов этих грибов входили также ОА, ЦИТ, АВ1 и ЦПК.

Наблюдаемая стабильность содержания ЦИТ и СТЕ, биосинтетических предшественников ОА и АВ1, с одной стороны, и межвидовое варьирование количеств конечных продуктов биосинтеза − с другой, свидетельствуют о том, что продуцентами каждого метаболита могут быть разные микромицеты. Известное для отдельных видов Penicillium и Aspergillus совмещение биосинтеза МФК и PR, а также АВ1 и ЦПК представляется маловероятным из-за несовпадающей направленности изменения их содержания от одного макрофита к другому.

Крайне высокое содержание ДАС (более 10 тыс. нг/г) выявлено у всех трех видов фукусовых водорослей, обнаружены также высокие значения PR у аскофиллума и фукуса. У обитающих на суше лишайников и высших сосудистых растений содержание этих токсинов было гораздо ниже. Так, верхние пределы концентраций ДАС и PR в лишайнике гипогимния вздутая были на порядок ниже (Буркин, Кононенко, 2013), как и в луговых травах (клевере луговом, чине луговой), содержание ДАС в которых достигало лишь тысяч нг/г (Кононенко, Буркин, 2018, 2019).

Содержание антрахинона ЭМО и макроциклического трихотецена РОА у водорослей разных видов достоверно различалось, но в целом было умеренным и варьировало от десятков до сотен и тысяч нг/г. Для сравнения, у лишайников рода ксантория содержание ЭМО достигало 100 тыс. нг/г, а РОА обнаружен только в следовых количествах в единичных образцах гипогимнии вздутой (Буркин, Кононенко, 2013). Причины столь значительных различий содержания ЭМО и РОА в биообъектах остаются неясными из-за дискуссии о путях их биогенеза (Izhaki, 2002).

Сверхвысокую концентрацию ЭА у F. vesiculosus, на порядок превышающую таковую у P. canaliculata и A. nodosum, можно считать неожиданным научным фактом. Сравнимые уровни контаминации известны для культурных и дикорастущих злаков, пораженных агрессивной G3 линией эпифитного гриба Claviceps purpurea (Fries) Tulasne, а также для луговых и сеянных трав, заселенных высоко токсигенными специфическими эндофитами (Gerhards et al., 2014). Наличие специфической эндофитной микобиоты подтверждено как для ламинариевых, так и для некоторых фукусовых водорослей (Flewelling et al., 2013). Эндофитный гриб S. ascophylli был выявлен во всех частях талломов беломорских макрофитов P. canaliculata и A. nodosum (см.: Коновалова, Бубнова, 2011; Коновалова и др., 2012), поэтому его способность продуцировать ЭА представляет несомненный интерес.

В последние годы серьезную обеспокоенность исследователей вызывает появление новых природных зон с высокой контаминацией биообъектов эргоалкалоидами. Обширное распространение в Ваттовом море солероса Spartina anglica C.E. Hubbard, интенсивно пораженного Claviceps purpurea var. spartinae, и возможность длительной миграции его склероциев линии G3 в морской воде несут реальную угрозу для пастбищных животных на прибрежных территориях европейских стран (Boestfleisch et al., 2015). Следует отметить, что в склероциях спорыньи, интенсивно заселяющей низкорослые злаковые травы на побережье Белого моря, содержание ЭА достигает таких же критических значений (наши неопубликованные данные).

У видов L. digitata и S. latissima из семейства Laminariaceae микотоксины не обнаружены. Полученная информация представляет особую ценность, так как эти водоросли являются объектами промысла и марикультуры и широко используются в пищевых целях. Возможно, ламинариевые наделены уникальными механизмами, позволяющими ограничивать рост микромицетов, блокировать их метаболическую активность или вызывать глубокую трансформацию биосинтетических путей, завершающихся продуктами с измененной структурой.

Таким образом, нами впервые показано, что в бурых морских водорослях семейства Fucaceae, как и у обитающих на суше лишайников и травянистых растений, формируется свойственный микроскопическим грибам многокомпонентный профиль микотоксинов, который отсутствует у видов семейства Laminariaceae. Обнаружение настолько контрастной альтернативной ситуации у близких по систематическому положению и местообитанию водорослей служит убедительным доводом в пользу продолжения разносторонних и углубленных исследований роли грибов, генетически детерминированных на биосинтез токсичных вторичных метаболитов, в процессах жизнедеятельности морских организмов.

Список литературы

  1. Бубнова Е.Н., Киреев Я.В. Сообщества грибов на талломах бурых водорослей рода Fucus в Кандалакшском заливе Белого моря // Микология и фитопатология. 2009. Т. 43. Вып. 5. С. 388–397.

  2. Буркин А.А., Кононенко Г.П. Особенности накопления микотоксинов в лишайниках // Прикл. биохимия и микробиол. 2013. Т. 49. № 5. С. 522–530.

  3. Киричук Н.Н., Пивкин М.В. Мицелиальные грибы морской травы Zostera marina Linnaeus, 1753 бухты Рифовой (залив Петра Великого, Японское море) // Биол. моря. 2015. Т. 41. № 5. С. 319–323.

  4. Коновалова О.П., Бубнова Е.Н. Грибы на бурых водорослях Ascophyllum nodosum и Pelvetia canaliculata в Кандалакшском заливе Белого моря // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45. Вып. 3. С. 240–248.

  5. Коновалова О.П., Бубнова Е.Н., Сидорова И.И. Биология Stigmidium ascophylli – гриба-симбионта фукусовых водорослей в Кандалакшском заливе Белого моря // Микология и фитопатология. 2012. Т. 46. Вып. 6. С. 353–360.

  6. Кононенко Г.П., Буркин А.А. Вторичные метаболиты микромицетов в растениях семейства Fabaceae рода Trifolium // Изв. РАН. Сер. биол. 2018. № 2. С. 150–157.

  7. Кононенко Г.П., Буркин А.А. Вторичные метаболиты микромицетов в растениях семейства Fabaceae родов Lathyrus, Vicia // Изв. РАН. Сер. биол. 2019. № 3. С. 229–235.

  8. Boestfleisch C., Drotleff A.M., Ternes W. et al. The invasive ergot Claviceps purpurea var. spartinae recently established in the European Wadden Sea on common cord grass is genetically homogenous and the sclerotia contain high amounts of ergot alkaloids // Eur. J. Plant Pathol. 2015. V. 141. P. 445–461.

  9. Cole R.J., Cox R.H. Handbook of toxic fungal metabolites. New York: Academic Press. 1981.

  10. Flewelling A.J., Ellsworth K.T., Sanford J. et al. Macroalgal endophytes from the Atlantic coast of Canada: a potential source of antibiotic natural products? // Microorganisms. 2013. V. 1. P. 175–187.

  11. Frisvad J.C., Smedsgaard J., Larsen T.O., Samson R.A. Mycotoxins, drugs and other extrolites produced by species in Penicillium subgenus Penicillium // Stud. Mycol. 2004. V. 49. P. 201–241.

  12. Gerhards N., Neubauer L., Tudzynski P., Li S.-M. Biosynthetic pathways of ergot alkaloids // Toxins. 2014. V. 6. P. 3281–3295.

  13. Izhaki I. Emodin – a secondary metabolite with multiple ecological functions in higher plants // New Phytoligist. 2002. V. 155. P. 205–217.

  14. Jiang Z., Barret M.-O., Boyd K.G. et al. JM47, a cyclic tetrapeptide HC-toxin analogue from a marine Fusarium species // Phytochemistry. 2002. V. 60. № 1. P. 33–38.

  15. Höller U., Wright A.D., Matthee G.F. et al. Fungi from marine sponges: diversity, biological activity and secondary metabolites // Mycol. Res. 2000. V. 104. № 11. P. 1354–1365.

  16. Kononenko G.P., Burkin A.A., Gavrilova O.P., Gagkaeva T. Yu. Fungal species and multiple mycotoxin contamination of cultivated grasses and legumes crops // Agric. Food Sci. 2015. V. 24. P. 323–330.

  17. McDonald J.H. Handbook of Biological Statistics. (3rd ed.). Sparky House Publishing. Baltimore, Maryland. 2014.

  18. Nicoletti R., Trincone A. Bioactive compounds produced by strains of Penicillium and Talaromyces of marine origin // Mar. Drugs. 2016. V. 14. art. ID 37. https://doi.org/10.3390/md14020037

  19. Park M.S., Fong J.J., Oh S.-Y. et al. Marine-derived Penicillium in Korea: diversity, enzyme activity, and antifungal properties // Antonie Van Leeuwenhoek. 2014. V. 106. P. 331–345.

  20. Raghukumar S. Fungi in coastal and oceanic marine ecosystems: Marine fungi. New York: Springer-Verlag. 2017. 383 p.

  21. Zhang P., Li X., Wang B.-G. Secondary metabolites from the marine algal-derived endophytic fungi: Chemical diversity and biological activity // Planta Med. 2016. V. 82. P. 832–842.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биология моря

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал