1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биология моря
  4. T. 47, № 4, 2021

Биология моря, 2021, T. 47, № 4, стр. 285-288

Поиск полиморфных микросателлитных локусов для морского окуня Sebastes taczanowskii Steindachner, 1880 (Sebastidae)

Н. М. Батищева 1, *, Вл. А. Брыков 1

1 Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН
690041 Владивосток, Россия

* E-mail: batishchevanata@gmail.com

Поступила в редакцию 09.12.2020
После доработки 17.01.2021
Принята к публикации 01.04.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Восточный морской окунь Sebastes taczanowskii Steindachner, 1880 − живородящая костистая рыба, которая играет существенную роль в функционировании сублиторальных сообществ рыб и является важным видом для любительского лова (Маркевич, Гнюбкина, 2015). Биология S. taczanowskii относительно хорошо изучена, однако сведения о его популяционной структуре отсутствуют. Проведены поиск и апробация имеющихся данных по микросателлитным локусам у близких видов рода Sebastes с целью оценки уровня внутривидового полиморфизма и выбора наиболее информативных локусов для дальнейших исследований. Апробированы праймеры для 19 микросателлитных локусов, из которых только пять могут быть использованы для анализа генетической изменчивости у S. taczanowskii.

Ключевые слова: микросателлиты, полиморфизм, окунеобразные

Восточный морской окунь Sebastes taczanowskii распространен от побережья Корейского полуострова до о-ва Сахалин (Японское море), встречается в прибрежных водах Японии, а также у южных Курильских островов (Takahashi et al., 1991; Колпаков, 2006; Nagasawa et al., 2008). К настоящему времени изучены экология S. taczanowskii (Haldorson, Love, 1991; Hayakawa, Munehara, 2003) и его филогенетические отношения (Asahida et al., 2004; Hyde, Vetter, 2007; Kartavtsev et al., 2009). Цель данного исследования − апробация 19 имеющихся микросателлитных локусов для использования в анализе отцовства и популяционной генетике S. taczanowskii.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Материалом для исследования послужили 48 особей S. taczanowskii, пойманных в зал. Восток (зал. Петра Великого Японского моря). Геномную ДНК выделяли из мышечных тканей с помощью стандартного фенол/хлороформного метода (Asahida et al., 1996).

Стандартная разработка микросателлитных локусов для разных видов включает создание геномной библиотеки, поиск микросателлитных последовательностей и фланкирующих их участков (Hayden, Sharp, 2001), используемых в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Другой подход заключается в использовании праймерных участков у близкородственных видов, для которых они известны (Asahida et al., 2004). Во многих случаях данный подход оказывается успешным.

В настоящей работе мы использовали 19 микросателлитных локусов, выявленных у видов рода Sebastes: KSs2A, KSs3, KSs7, KSs11B, KSs16, KSs26 – у S. schlegeli (см.: An et al., 2009); Ssc12, Ssc23, Ssc51, Ssc69 – у S. schlegeli (см.: Yoshida et al., 2005); Py3-29 – у S. schlegeli (см.: Bai et al., 2011); Sma3, Sma5, Sma7, Sma10, Sma11 − у S. maliger (см.: Wimberger et al., 1999); SR 7-2, SR 7-7, SR 7-25 − у S. rastrelliger (см.: Westerman et al., 2005). Пять из 19 микросателлитных локусов (табл. 1) были успешно амплифицированы для S. taczanowskii, и был проведен анализ размеров фрагментов. Условия амплификации были адаптированы индивидуально для каждого микросателлитного локуса. К 5'-концу каждого прямого праймера была пришита последовательность ДНК фага M13, который помечали одним из четырех флуоресцентных красителей: ROX, FAM, R6G или TAMRA. Предварительную оценку продукта ПЦР проводили с помощью гель-электрофореза в 1.5% агарозном геле. Электрофоретическое разделение продуктов осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI3130 (Applied Biosystems Inc., США) с применением размерного стандарта (S450) (COrDIS). Анализ длины фрагментов визуализировали с помощью программного пакета GeneMapper ver. 5.0 (Applied Biosystems).

Таблица 1.  

Информативность анализируемых полиморфных локусов для Sebastes taczanowskii

Локус Исходный вид/ аллельное разнообразие nA Ho He HWE FIS
SR 7-2 S. rastrelliger/4 9 1.0000 0.7061 0.0000 –0.4162
SR 7-7 S. rastrelliger/12 9 0.9787 0.8106 0.0180 –0.2074
SR 7-25 S. rastrelliger/11 15 0.9792 0.8834 0.0316 –0.1084
Sma3* S. maliger/5 14 0.6458 0.7890 0.0000 0.1815
Sma10 S. maliger/15 16 0.9583 0.8010 0.8796 –0.1965

Примечание. nA – число аллелей в локусе; Ho – наблюдаемая гетерозиготность; He – ожидаемая гетерозиготность; HWE – значимость нарушения равновесия Харди–Вайнберга, приведены только значимые значения (P < 0.05); FIS – коэффициент инбридинга. *Наличие нуль аллелей.

Для оценки информативности выбранных микросателлитных локусов использовали стандартные статистические процедуры. Наличие нулевых аллелей, больших вставок и делеций, а также подсчет пиков заикания были протестированы с помощью MICRO-CHECKER ver. 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004). Вариабельность в каждом локусе измеряли по количеству аллелей, ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, равновесию Харди−Вайнберга (HWE); нарушение равновесия по сцеплению было проверено с использованием GENEPOP 4.0 (Rousset, 2008). Достоверное значение для всех критериев значимости разнообразия корректировали последовательной процедурой Бонферрони (Rice, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все пять локусов у S. taczanowskii оказались полиморфными (табл. 1). Стабильная и качественная амплификация наблюдалась при использовании праймеров, разработанных для отдаленных видов рода Sebastes: S. maliger и S. rastrelliger. Достаточно интересно, что ни один из локусов, разработанных для близкородственного вида S. schlegeli, не амплифицировался у S. taczanowskii.

Количество аллелей в оцениваемых локусах варьировало от 9 до 16 (табл. 1). Нулевые аллели обнаружены только для локуса Sma3. Наличия в аллелях больших вставок и делеций, заикающихся пиков в каком-либо локусе не выявлено. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность варьировала от 0.6458 до 1000 и от 0.7061 до 0.8834 соответственно (табл. 1). Отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесного распределения Харди−Вайнберга наблюдались по двум локусам: SR 7-2 и Sma3. Отклонения от HWE могут указывать на инбридинг или свидетельствовать об ошибках генотипирования образцов (Wigginton et al., 2005; Morin et al., 2009). Коэффициент инбридинга варьировал от −0.4162 (SR 7-2) до 0.1815 (Sma 3). Обнаруженный недостаток гетерозигот в локусе Sma3, скорее всего, вызван наличием нулевых аллелей. Локус SR 7-2 показал избыток гетерозигот и неравновесие по сцеплению.

Некоторые авторы отмечают, что аллельное разнообразие у вида, для которого разрабатывался праймер, должно быть выше (Petit et al., 2005; Selkoe, Toonen, 2006). В нашем случае мы наблюдали эту закономерность лишь у одного локуса из пяти (табл. 1).

Таким образом, с использованием праймеров, разработанных для отдаленных видов (S. maliger, S. rastrelliger), у S. taczanowskii выявлено пять высокополиморфных микросателлитных маркеров. Эти локусы могут быть использованы для изучения популяционно-генетической структуры у данного вида, а также для анализа генетического родства особей.

Список литературы

  1. Колпаков Н.В. О биологии малого Sebastes minor и восточного S. taczanowskii (Sebastidae) морских окуней прибрежных вод северного Приморья // Вопр. ихтиологии. 2006. Т. 46. № 3. С. 334−344.

  2. Маркевич А.И., Гнюбкина В.П. Особенности позднего эмбрионального развития и предличинок восточного Sebastes taczanowskii и малого S. minor морских окуней (Sebastidae) в заливе Петра Великого Японского моря // Изв. ТИНРО. 2015. Т. 183. С. 112–119.

  3. An H.S., Park J.Y., Kim M.-J. et al. Isolation and characterization of microsatellite markers for the heavily exploited rockfish Sebastes schlegeli, and cross-species amplification in four related Sebastes spp. // Conserv. Genet. 2009. V. 10. № 6. P. 1969−1972. https://doi.org/10.1007/s10592-009-9870-8

  4. Asahida T., Gray A.K., Gharrett A.J. Use of microsatellite locus flanking regions for phylogenetic analysis? A preliminary study of Sebastes subgenera // Environ. Biol. Fishes. 2004. V. 69. P. 461−470.

  5. Asahida T., Kobayashi T., Saitoh K., Nakayama I. Tissue preservation and total DNA extraction form fish stored at ambient temperature using buffers containing high concentration of urea // Fish. Sci. 1996. V. 62. № 5. P. 727–730. https://doi.org/10.2331/fishsci.62.727

  6. Bai C.C., Liu S.F., Zhuang Z.M. et al. Isolation and characterization of microsatellite markers for the Korean rockfish, Sebastes schlegeli // Genet. Mol. Res. 2011. V. 10. № 3. P. 2065–2068. https://doi.org/10.4238/vol10-3gmr1522

  7. Haldorson L., Love M. Maturity and fecundity in the rockfishes, Sebastes spp. // Mar. Fish. Rev. 1991. V. 53. № 2. P. 25–31.

  8. Hayakawa Y., Munehara H. Comparison of ovarian functions for keeping embryos by measurement of dissolved oxygen concentrations in ovaries of copulatory and non-copulatory oviparous fishes and viviparous fishes // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. V. 295. № 2. P. 245–255.https://doi.org/10.1016/S0022-0981(03)00297-1

  9. Hayden M.J., Sharp P.J. Sequence-tagged microsatellite profiling (STMP): a rapid technique for developing SSR markers // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 8. Art. e43. https://doi.org/10.1093/nar/29.8.e43

  10. Hyde J.R., Vetter R.D. The origin, evolution, and diversification of rockfishes of the genus Sebastes (Cuvier) // Mol. Phylogenet. Evol. 2007. V. 44. № 2. P. 790–811. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2006.12.026

  11. Kartavtsev Y.P., Sharina S.N., Goto T. et al. Sequence diversity at cytochrome oxidase 1 (Co-1) gene among sculpins (Scorpaeniformes, Cottidae) and some other scorpionfish of Russia Far East with phylogenetic and taxonomic insights // Genes Genomics. 2009. V. 31. № 2. P. 183–197.

  12. Morin P.A., Leduc R.G., Archer F.I. et al. Significant deviations from Hardy–Weinberg equilibrium caused by low levels of microsatellite genotyping errors // Mol. Ecol. Resour. 2009. V. 9. № 2. P. 498–504. https://doi.org/10.1111/j.1755-0998.2008.02502.x

  13. Nagasawa T., Ishida R., Sasaki M. Development of Sebastes taczanowskii (Scorpaenidae) in the Sea of Japan off Hokkaido with a key to species of larvae // Ichthyol. Res. 2008. V. 55. № 2. P. 124–132.

  14. Petit R.J., Deguilloux M.F., Chat J. et al. Standardizing for microsatellite length in comparisons of genetic diversity // Mol. Ecol. 2005. V. 14. P. 885–890.

  15. Rice W.R. Analyzing tables of statistical tests // Evolution. 1989. V. 43. № 1. P. 223–225.

  16. Rousset F. Genepop’007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux // Mol. Ecol. Resour. 2008. V. 8. № 1. P. 103–106. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2007.01931.x

  17. Selkoe K.A., Toonen R.J. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers // Ecol. Lett. 2006. V. 9. № 5. P. 615–629. https://doi.org/10.1111/j.1461-0248.2006.00889.x

  18. Takahashi H., Takano K., Takemura A. Reproductive cycles of Sebastes taczanowskii, compared with those of other rockfishes of the genus Sebastes // Environ. Biol. Fishes. 1991. V. 30. № 1–2. P. 23–30.

  19. Van Oosterhout C., Hutchinson W.F., Wills D.P.M., Shipley P. MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data // Mol. Ecol. Notes. 2004. V. 4. № 3. P. 535–538. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2004.00684.x

  20. Westerman M.E., Buonaccorsi V.P., Stannard J.A. et al. Cloning and characterization of novel microsatellite DNA markers for the grass rockfish, Sebastes rastrelliger, and cross-species amplification in 10 related Sebastes spp. // Mol. Ecol. Notes. 2005. V. 5. № 1. P. 74–76. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2004.00837.x

  21. Wigginton J.E., Cutler D.J., Abecasis G.R. A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium // Am. J. Hum. Genet. 2005. V. 76. № 5. P. 887–893.https://doi.org/10.1086/429864

  22. Wimberger P., Burr J., Gray A. et al. Isolation and characterization of twelve microsatellite loci for rockfish (Sebastes) // Mar. Biotechnol. 1999. V. 1. № 3. P. 311–315.

  23. Yoshida K., Nakagawa M., Wada S. Multiplex PCR system applied for analysing microsatellite loci of Schlegel’s black rockfish, Sebastes schlegeli // Mol. Ecol. Notes. 2005. V. 5. № 2. P. 416–418. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2005.00945.x

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биология моря

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал