Биология моря, 2021, T. 47, № 4, стр. 270-280

Характеристика образцов фукоидана

Образец фукоидана F₀ имел УФ-спектр поглощения с максимумом при 268 нм (рис. 1, спектр 1), что характерно для ароматических соединений. Максимум спектра возбуждения образца фукоидана F₀ располагался при 366 нм (рис. 1, спектр 2). Спектр флуоресценции этого образца имел широкий максимум в диапазоне 450–455 нм и плечо в диапазоне 530–550 нм (рис. 1, спектр 3). По данным метода Фолина–Чокальтеу (Kuda, Ikemori, 2009), этот образец содержал 33.3 мгPGEq/гDW полифенольных соединений (табл. 1). Степень очистки образца F₀m = 0 (табл. 2).

Рис. 1.

Спектры поглощения (1), возбуждения (2) и флуоресценции (3) фукоидана F₀; спектры флуоресценции фукоиданов разной степени очистки от полифенольных примесей: F₁ (4), F (5) и F₂ (6). Концентрация образцов 5 мг/мл, 0.1 М Na⁺-фосфатный буфер, рН 8.5; кювета 1 см, возбуждение светом с длиной волны 366 нм, ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения – 5 нм.

Фукоидан F₁, полученный после анионообменной хроматографии исходного полисахарида F₀, также имел спектр флуоресценции (рис. 1, спектр 4), но его интенсивность была меньше. Этот образец содержал 20 мгPGEq/гDW полифенольных соединений (табл. 1). Степень очистки образца F₁m = 0.60 (табл. 2).

Фукоидан F₀ был обработан 5%-ным водным раствором Н₂О₂, и была получена фракция полисахарида F, в которой еще сохранялась флуоресценция (рис. 1, спектр 5). В результате хроматографии фукоидана F на анионообменном носителе получен фукоидан F₂ с нулевой флуоресценцией (рис. 1, спектр 6). Согласно данным метода Фолина–Чокальтеу (Kuda, Ikemori, 2009), фукоидан F₂ не содержал полифенольные примеси (табл. 1). Степень очистки образца F₂m = 0.98 (табл. 2).

По данным ЯМР спектроскопии структуры фукоиданов F₁ и F₂ были подобны и представляли собой сульфатированный α-L-фукан, имеющий линейную цепь чередующихся (1 → 3)- и (1 → 4)-связанных остатков α-L-фукопиранозы, сульфатированных по С2 и С4 (1 → 3)-α-L-фукопиранозных остатков (спектры не приводятся) (Урванцева и др., 2004). Фукоидан F₂ был освобожден от примесей полифенольных соединений (m = 0.98), показатель оптического угла вращения $[\alpha ]_{{\text{D}}}^{{20^\circ }}$ (–173.0) соответствовал таковому ранее охарактеризованного фукоидана из F. evanescens (табл. 2) (Bilan et al., 2002).

Влияние образцов фукоидана F₀, F₁ и F₂ на эмбриогенез морского ежа

При низкой концентрации фукоидана F₀ (10–50 мкг/мл) выживаемость эмбрионов морского ежа по сравнению с таковой в контроле (рис. 2а; табл. 3) увеличивалась. При повышении концентрации этого фукоидана наблюдались асинхронное деление, аномалии и частичная гибель эмбрионов, что сопровождалось лизисом бластомеров. Через 0.5 сут инкубации фукоидан F₀ в концентрации 500 мкг/мл вызывал гибель и лизис 30% эмбрионов, а в концентрации 1000 мкг/мл – гибель 80% эмбрионов (табл. 3; рис. 2) на стадии одного бластомера (рис. 3Аа), часть которых была лизирована.

Рис. 2.

Влияние фукоиданов с разной степенью очистки от полифенолов на эмбриогенез морского ежа: а – F₀; б – F₁; в – F₂. Результаты представлены в виде графиков зависимости средних значений выживаемости эмбрионов от концентраций полисахаридов ± стандартная ошибка среднего (вертикальные линии) при доверительной вероятности p ≤ 0.05.

Рис. 3.

Эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedius на разных стадиях развития. А – нормальное развитие эмбрионов: а – оплодотворенная яйцеклетка (1 бластомер), б – бластула (10-я стадия), в – призма (21-я стадия), г и д – ранний и средний плутеус (23-я и 25-я стадии соответственно). Б – аномалии в развитии эмбрионов, отмеченные на стадиях: а, б – гаструлы (16–19-я стадии), в – призмы (21-я стадия) и г, д, е, ж, з – раннего и среднего плутеуса (22–26-я стадии); номер стадии по: Бузников, Подмарев (1975). Ув. ×40.

При действии фукоидана F₁ (степень очистки m = 0.60) в концентрации 500–1000 мкг/мл через 0.5 сут инкубации эмбрионы начинали делиться асинхронно, а через 1.5 сут появились эмбрионы с морфологическими аномалиями, отстававшие в развитии (табл. 3; рис. 2б и рис. 3Б: а, б).

Фукоидан F₂ через 0.5 сут инкубации во всех исследованных концентрациях оказывал положительное влияние на развивающиеся эмбрионы. При его действии в концентрации 100–250 мкг/мл наблюдалось как опережение в развитии, так и увеличение продолжительности жизни эмбрионов на 30–50% относительно контрольных зародышей (табл. 3; рис. 2в). Однако при концентрации фукоидана F₂ 500–1000 мкг/мл появлялись аномалии в развитии эмбрионов на стадии раннего плутеуса (рис. 3Б: г), что соответствует 22–23-й стадиям (по: Бузников, Подмарев, 1975) (табл. 3; рис. 3А: в, г).

Фукоиданы F₀ и F₁ с разной степенью загрязнения полифенолами, а также образец F₂, очищенный от полифенолов, в низких концентрациях (10–50 мкг/мл) повышали выживаемость эмбрионов. Различие наблюдалось при более высоком содержании этих полисахаридов. Так, при концентрации фукоидана F₀ 100–1000 мкг/мл отмечена частичная или полная гибель эмбрионов. Фукоиданы F₁ и F₂ в этой же концентрации не оказывали губительного действия на жизнеспособность эмбрионов (рис. 2). Однако в присутствии фукоидана F₁ увеличилось число аномальных эмбрионов на всех стадиях развития (табл. 3; рис. 3Б), что наглядно представлено на фотографиях эмбрионов через 3 сут инкубации (рис. 4). При концентрации фукоидана F₂ 100 мкг/мл эмбрионы развивались без морфологических нарушений (рис. 4). Действие фукоидана F₁ в этой же концентрации проявлялось как аномалии в развитии эмбрионов, а при концентрации 1000 мкг/мл через 3 сут инкубации отмечено отставание в развитии эмбрионов и увеличение числа аномалий. При этой же концентрации фукоидана F₂ аномалий в развитии эмбрионов не наблюдалось, но отмечено отставание в их развитии (табл. 3; рис. 4).

Рис. 4.

Влияние фукоиданов F₁ и F₂ в концентрациях 100 и 1000 мкг/мл на развивающиеся эмбрионы морского ежа через трое суток инкубации. Контроль – эмбрионы в морской воде. Ув. ×10.

Действие фукофлоретола и кукумариозида А₇ на эмбриогенез морского ежа

В концентрации ≥50 мкг/мл полифенол блокировал деление и вызывал лизис яйцеклеток на стадии 1 бластомера. В концентрации <50 мкг/мл (134 мкмоль/л) фукофлоретол ингибировал развитие эмбрионов частично, что проявлялось в течение всего инкубационного периода.

Кукумариозид А₇ оказывал цитотоксическое действие в концентрации ≥1.2 мкг/мл (0.79 мкмоль/л). Влияние гликозида в концентрации <1.2 мкг/мл приводило к задержке развития, частичной гибели и морфологическим нарушениям в развитии эмбрионов (рис. 3Б: в), тогда как в концентрации 0.2 мкг/мл это соединение оказывало слабое стимулирующее действие (рис. 5б, рис. 6). Значения ИК₅₀ для фукофлоретола и кукумариозида А₇ составили 96.9 ± 12.2 и 0.39 ± 0.01 мкмоль/л соответственно (рис. 5в, г).

Рис. 5.

Цитотоксическое действие фукофлоритола (а) и кукумариозида А₇ (б) на развивающиеся эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedius, а также сигмоидальная доз-зависимость выживаемости эмбрионов для определения ИК₅₀ фукофлоретола (в) и кукумариозида А₇ (г). В результате подгонки теоретических зависимостей к экспериментальным точкам по модели Хилла определены коэффициенты нелинейной регрессии k и n, соответствующие ИК₅₀ и коэффициенту кооперативности, который отражает число мест связывания лиганда. Вертикальные линии на рисунках (а) и (б) отражают стандартную ошибку среднего, тогда как на рисунках (в) и (г) – стандартную ошибку подгонки теоретической кривой к экспериментальным точкам.

Рис. 6.

Совместное действие фукоиданов и тритерпенового гликозида кукумариозид А₇. а – фукоидан F₁ (m = 0.60); б – фукоидан F₂ (m = 0.98). 1 – кукумариозид А₇; 2 – 10 мкг/мл фукоидана + кукумариозид А₇; 3 – 50 мкг/мл фукоидана + кукумариозид А₇; 4 – 100 мкг/мл фукоидана + кукумариозид А₇; 5 – 250 мкг/мл фукоидана + кукумариозид А₇. Результаты представлены в виде графиков зависимости средних значений выживаемости эмбрионов от концентраций кукумариозида ± стандартная ошибка среднего (вертикальные линии) при доверительной вероятности p ≤ 0.05.

Совместное действие фукоиданов F_1, F₂ и кукумариозида А₇ на эмбриогенез морского ежа

Фукоиданы F₁ и F₂ в исследованных концентрациях снимали токсическое действие кукумариозида А₇ на развивающиеся эмбрионы морского ежа (рис. 6), за исключением кукумариозида А₇ в концентрации 0.6 мкг/мл, при которой фукоидан F₁ практически не оказывал защитного действия. Наиболее эффективно эмбрионы морского ежа защищал фукоидан F₂ в концентрациях 100–250 мкг/мл (рис. 6а).

В данном исследовании мы привели результаты изучения биологических свойств образцов фукоидана F₀, F₁ и F₂ из бурой водоросли F. evanescens, которые имеют одинаковую структуру, но различаются по степени загрязнения полифенольными соединениями, образующими с полисахаридом прочный комплекс. Очистка полисахарида заключалась в разрушении данного комплекса под действием перекиси водорода и в последующей хроматографии на анионообменном носителе. Степень загрязнения образцов фукоидана полифенольными соединениями контролировали методом флуоресценции самих соединений (Урванцева и др., 2004) и колориметрическим методом Фолина–Чокальтеу (Kuda, Ikemori, 2009). Результаты, полученные с помощью этих методов, хорошо согласуются. Однако простой и высокочувствительный метод собственной флуоресценции позволяет без дополнительных реагентов и разрушения структуры полисахарида выявить присутствие полифенольных соединений. Этот метод очень удобен для контроля очистки полисахаридов от любых флуоресцирующих примесей.

Для изучения биологической активности полисахаридов нами давно и успешно применяется модель развивающихся эмбрионов морского ежа. В наших ранних исследованиях показано, что полисахариды бурых водорослей независимо от моносахаридного состава увеличивали продолжительность жизни эмбрионов (Киселева и др., 2005, 2015; Kiseleva et al., 2008). Степень очистки полисахаридов от полифенольных примесей в данных исследованиях не контролировали. В настоящей работе исследовали влияние на эмбриогенез морского ежа одного фукоидана, но с разным содержанием полифенольных примесей (образцы F₁ и F₂) (табл. 1). Сырой образец фукоидана F₀ был гетерогенным по моносахаридному составу и содержал наибольшее количество полифенолов (33.3 мгPGEq/гDW, степень очистки m = 0). В концентрациях ≥100 мкг/мл этот образец проявлял высокую эмбриотоксическую активность (рис. 2а). Цитотоксический эффект частично очищенного образца фукоидана F₁ (20.0 мгPGEq/гDW, m = 0.6) наблюдался лишь при концентрациях 500 и 1000 мкг/мл. Наиболее благоприятным для жизнедеятельности эмбрионов оказался образец фукоидана F₂, очищенный от полифенольных примесей. Этот образец, как и образец фукоидана F₁, поддерживал и удлинял жизнь эмбрионов, а также, что очень важно, предупреждал появление аномалий в их развитии. Фукофлоретол – полифенольное соединение, выделенное из этой же водоросли, оказывал цитотоксическое действие в концентрациях ≤50 мкг/мл; ИК₅₀ = 96.9 ± 12.2 мкмоль/л (рис. 5а, б).

Ранее на модели развивающихся эмбрионов морского ежа нами было показано, что фукоиданы снижают токсическое действие ингибиторов белковой природы из бурой водоросли Saccharina cichorioides (см.: Киселева и др., 2015), однако содержание полифенольных примесей в образцах белков и полисахаридов не определялось. В качестве токсина мы выбрали кукумариозид А₇ из голотурии C. frondosa, известный как соединение, ингибирующее и блокирующее деление яйцеклеток в наномолярных концентрациях (Agafonova et al., 2003). В нашем эксперименте кукумариозид А₇ также показал высокую цитотоксическую активность (ИК₅₀ = 0.39 ± 0.01 мкмоль/л). При предварительной обработке эмбрионов образцами фукоидана F₁ и F₂ токсическое действие этого соединения различалось. Особенно заметное различие защитных свойств фукоиданов F₁ и F₂ было отмечено при высоких концентрациях кукумариозида А₇ (0.6 мкг/мл) и полисахарида (100 и 250 мкг/мл). Наиболее эффективную защиту оказывал высокоочищенный образец фукоидана F₂ (степень очистки m = 0.98) (рис. 6б, линии 4 и 5): выживаемость эмбрионов в его присутствии увеличилась по сравнению с таковой в контроле и при действии фукоидана F₁ (рис. 6а, линии 4 и 5) более чем на 40%.

Таким образом, на модели развивающихся эмбрионов морского ежа было показано, что лишь полностью очищенный от полифенольных примесей образец фукоидана (F₂) из бурой водоросли F. distichus стимулировал эмбриогенез и эффективно защищал эмбрионы от токсического действия кукумариозида А₇. Полифенольные примеси негативно влияли на биологическую активность образцов фукоидана, вызывая появление большого количества эмбрионов с морфологическими нарушениями. Образец фукоидана (F₁), содержавший полифенолы, не снижал эмбриотоксическое действие высоких концентраций кукумариозида А₇. В связи с этим следует отметить, что при изучении биологических свойств фукоиданов необходимо контролировать количество примеси полифенольных соединений, которые можно легко обнаружить при измерении спектра флуоресценции образца полисахарида.