1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биотехнология
  4. T. 38, № 2, 2022

Биотехнология, 2022, T. 38, № 2, стр. 57-69

Сравнительный анализ состава и содержания гинзенозидов в каллусной культуре клеток и корне женьшеня обыкновенного, Panax ginseng

Д. Н. Балеев 1, *, В. И. Осипов 1, П. С. Савин 1, Ю. П. Байкова 1, Н. И. Сидельников 1

1 Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений
117216 Москва, Россия

* E-mail: dbaleev@gmail.com

Поступила в редакцию 20.10.2021
После доработки 20.01.2022
Принята к публикации 23.03.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Основной целью исследования было изучение состава и относительного содержания гинзенозидов в каллусной культуре клеток Panax ginseng C.A. Mey. (штамм Pa.g(B)05VILAR), полученной из почек зрелого растения. Для сравнения использовали экстракт из корня женьшеня, произрастающего в Ботаническом саду ВИЛАР. Состав и относительное содержание гинзенозидов изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения. В корне женьшеня и каллусной культуре клеток обнаружили 40 и 33 гинзенозида, соответственно. Основные гинзенозиды принадлежат к группам протопанаксатриола, протопанаксадиола и олеанана. Использованный метод анализа позволил обнаружить ряд минорных гинзенозидов: Rg5, 20(R)-Rg2, Rg3, F1, Rb2 и Rd, обладающих биологической активностью, однако суммарное их содержание в корне выше, чем в каллусной культуре клеток. Изучение факторов регуляции биосинтеза гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng, позволит повысить продуктивность культуры и увеличить выход биологически активных гинзенозидов.

Ключевые слова: Panax ginseng, гинзенозиды, малонил-гинзенозиды жидкостная хроматография, масс-спектрометрия высокого разрешения (МСВР)

Женьшень – многолетнее растение, которое принадлежит к роду Panax семейства Araliaceae. Известно 17 видов данного рода, распространенных в Корее, Китае, Японии, США, Канаде, восточных Гималаях и России [1]. Корни женьшеня тысячи лет применяются для получения биологически активных адаптогенных препаратов, которые широко используется в восточной медицине для повышения устойчивости организма к физическим и биологическим стрессам [2, 3]. Наиболее часто используются такие виды как женьшень обыкновенный (Panax ginseng C.A. Mey.), американский (Panax quinquefolius L.) и китайский (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen) [4].

Основными биологически активными соединениями корней женьшеня являются гинзенозиды или тритерпеновые гликозиды [5, 6]. В зависимости от типа агликона, гинзенозиды классифицируются на группы протопанаксадиолов, протопанаксатриолов и олеанановых сапонинов, которые также подразделяются на ряд подгрупп в соответствии с числом и положением углеводной части молекулы [1]. Неполярные свойства агликона и полярные свойства углеводных компонентов, обусловливают растворимость гинзенозидов как в воде, так и жирах, а поэтому обладают способностью достаточно легко проникать в клетку [7].

В женьшене обыкновенном идентифицировано около 200 гинзенозидов [8]. Около 90% общего содержания гинзенозидов в корнях женьшеня обыкновенного приходится на протопанаксадиолы Rb1, Rb2, Rc, Rd и протопанаксатриолы Re, Rf и Rg1 [9, 10]. Олеанановая группа представлена в основном гинзенозидом Ro [11] и реже гинзенозидами Rg2, Rg3, Rh1 и Rh2. [12]. Разработка и применение новых аналитических методов позволит открыть новые, еще не известные биологически активные соединения женьшеня.

В настоящее время основным источником гинзенозидов являются корни и корневища культурных растений женьшеня [11]. Однако длительный период развития растений и относительно низкое содержание гинзенозидов по сравнению с дикой формой растения, стимулировали использование культуры клеток in vitro в качестве альтернативного источника биологически активных соединений [13, 14]. Было показано, что клеточные культуры P. ginseng и P. japonicus способны синтезировать и накапливать многие биологически активные гинзенозиды, характерные для исходных растений [12, 15, 16].

Во Всероссийском Институте Лекарственных и Ароматических Растений (ВИЛАР, Москва) были получены и на протяжении многих лет поддерживаются каллусная и суспензионная культуры клеток женьшеня обыкновенного. Показано, что экстракты этих культур обладают адаптогенной активностью [17, 18], но состав синтезируемых метаболитов не был изучен. Поэтому основной целью данного исследования было определение состава и содержания биологически активных гинзенозидов в каллусной культуре клеток женьшеня обыкновенного с применением ВЭЖХ-МСВР. В качестве контроля использовали корень растения женьшеня, выращенного в Ботаническом саду ВИЛАР.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Реактивы

В экспериментах использовали ацетонитрил LiChrosolv® hypergrade для ЖХ-МС (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Муравьиная кислота, сахароза, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, кинетин, никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин и 1R-(-)-10-камфорсульфоновая кислота были получены от Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Этанол (99.5%, об./об.) фирмы Primalco (Rajamäki, Финляндия). Вода очищена системой Elgastat UHQ-PS (Elga, Карст, Германия).

Растительный материал

Объектом исследования была каллусная культура клеток женьшеня обыкновенного (P. ginseng, штамм Pa.g(B)05ВИЛАР), клеточная линия № 04868244-010-2011 из биоколлекции ВИЛАР, полученная в 2011 году из почки взрослого растения, растущего в Ботаническом саду ВИЛАР. Культура клеток стабильна и поддерживается в ВИЛАР методом пересева до настоящего времени. Анализ образцов проводили в 2014 году.

Каллусную культуру клеток выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга [19] с добавлением сахарозы (3%), а также витаминов и регуляторов роста (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 ДХФУ), кинетин, никотиновая кислота, тиамин и пиридоксин) в концентрации 0.5 мг/л каждого соединения [20] (табл. 1). Коэффициент заполнения твердой питательной средой пробирок объемом 50 мл составлял 40%, от общего объема. Культивирование проводили в темноте при температуре 26 ± 1°C. Цикл выращивания культуры составлял 30 сут.

Таблица 1.  

Состав среды для выращивания каллусной культуры клеток женьшеня Pa.g (В) 05ВИЛАР Table 1.  The composition of the medium for growing callus culture of ginseng cells Pa.g (B) 05VILAR

№ п\п      Компонент питательной среды      Концентрация, мг/л
1 NH 4NO3 1650
2 KNO3 1900
3 KH2PO4 170
4 CaCl2 плавл. 330
5 MgSO4⋅7H2O 370
6 FeSO4⋅7H2O 27.8
7 Трилон Б (Na-ЭДТА) 37.3
8 Н3ВО3 6.2
9 MnSO4⋅4H2O 22.3
10 ZnSO4⋅7H2O 8.6
11 KI 0.83
12 NaMoO4⋅2H2O 0.25
13 CuSO4⋅5 H2O 0.025
14 CoCl2⋅6 H2O 0.025
15 Сахароза 30 000
16 2,4-ДХФУ 0.5
17 Кинетин 0.5
18 Никотиновая кислота 0.5
19 Тиамин 0.5
20 Пиридоксин 0.5
21 Агар 8000

Для характеристики каллусной культуры клеток определяли такие параметры как, жизнеспособность культуры, ростовой индекс и морфогенность. Жизнеспособность определяли методом микроскопии, рассчитывая процент не окрашиваемых 0.025%-ной синькой Эванса клеточных агрегатов от их общего количества. Учитывали не менее 150 агрегатов в трех повторностях. Для определения сухой массы 30-дневную каллусную культуру клеток высушивали при температуре 30°С.

Ростовой индекс (I) определяли по формуле:

$I = ({{X}_{{{\text{max}}}}}--{{X}_{0}}){\text{/}}{{X}_{0}},$
где Xmax и X0 – максимальное и начальное значения содержания сухой биомассы.

Морфогенность культуры определяли методом микроскопии на 30 сутки роста. В результате установлено, что каллусная культура клеток была не морфогенна, ее ростовой индекс 8–10 и содержание живых клеток 80–90%.

Состав и содержание метаболитов в 30-дневной культуре клеток сравнивали с метаболитами корня P. ginseng, выращенного в Ботаническом саду ВИЛАР.

Подготовка образцов

Образец высушенной культуры клеток каллуса массой 7.5 г измельчали и экстрагировали 70%-ным водным этанолом (соотношение сырье–растворитель, 1 : 10). Полученный экстракт упаривали в роторном испарителе (Hei-VAP Value, Heidolph, Германия) до получения сухого остатка. Экстракцию метаболитов корня женьшеня проводили в тех же условиях. Для ВЭЖХ-МСВР анализа сухие образцы экстрактов каллуса и корня (10 мг) растворяли в 1 мл 70%-ного этанола, содержащего внутренний стандарт (1R)-(-)-10-камфорсульфоновую кислоту (24 мкг/мл), и фильтровали (фильтр PTFE Clean 2, 0.45 мкм, Thermo Fisher Scientific, США).

ВЭЖХ-МСВР анализ

ВЭЖХ система Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) включала micrOTOF-Q-MS (Bruker, США) спектрометр высокого разрешения и диодно-матричный детектор. Соединения разделяли на колонке XBridge C18 (100 × 2.1 mm i.d., 3.5 µm, Waters, Ирландия) в градиенте двух систем: (A) 0.2%-ный водный раствор муравьиной кислоты; (Б) 0.2%-ный раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Условия ВЭЖХ: 0–5 мин, 2% Б в A; 5–50 мин, 2–30% Б в A (линейный градиент); 50–70 мин, 30–70% Б в A (линейный градиент); 70–80 мин, 70% Б. Скорость потока – 0.3 мл/мин; объем вводимого образца – 5 µл. Масс-спектрометрические условия: электроионизация в распыленном состоянии (ESI), регистрация отрицательных и положительных ионов в области 50–2000 m/z, напряжение на игле 4000 V, температура азота 200°С, скорость потока газа 8.0 л/мин. Регистрацию масс-спектрометрических данных и их последующую обработку проводили с использованием программы DataAnalysis 4.0 (Bruker).

Идентификация гинзенозидов

На основании точного измерения m/z значений ионов масс-спектра метаболита, определяли его моноизотопную массу и химическую формулу. Ошибка определения экспериментальной моноизотопной массы, при сравнении с расчетной, была менее 3 ppm для основных метаболитов и менее 6 ppm для метаболитов, присутствующих в низких концентрациях. Данные масс-спектрометрии (m/z значения иона [M–H]− и его аддуктов) применяли для идентификации или предварительной характеристики соединений, используя доступные базы данных METLIN [21] и HMDB (Human Metabolome Database) [22], а также данные, опубликованные в литературе [23–30].

Количественный анализ гензенозидов

Для сравнения содержания гинзенозидов в корне и каллусной культуре клеток использовали их относительное содержание в экстрактах, которое определяли по площади пика наиболее характерного и интенсивного иона (m/z) масс-спектра, нормализованного по внутреннему стандарту в расчете на 100 мг сухого экстракта.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ R [31]. Достоверность различий в содержании гинзенозидов анализировали с помощью парных t-критериев Стьюдента. Различия в каждой паре сравниваемых значений считали статистически значимыми при р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для ВЭЖХ-МС анализа некоторых классов вторичных метаболитов растений, например, низкомолекулярных фенольных соединений, вполне достаточна регистрация только отрицательных ионов. Однако экстракт женьшеня характеризуется присутствием, большого числа разнообразных гликозидов тритерпеноидов, поэтому предварительно сравнивали ВЭЖХ-МСВР профили метаболитов женьшеня при отрицательной и положительной ионизации. В результате установлено, что отрицательная ионизация больше подходит для регистрации биологически активных гинзенозидов (рис. 1). Кроме того, масс-спектр метаболитов при отрицательной ионизации характеризуется более простым составом аддуктов и лучше подходит для идентификации. Это подтверждается и результатами других исследователей [27–29].

Рис. 1.

ВЭЖХ-МСВР профили метаболитов экстрактов корня женьшеня обыкновенного (a) и каллусной культуры клеток (b). Регистрация отрицательных ионов в режиме полного ионного тока (TIC). 1 – 20-O-Глюкогинзенозид-Rf, 2 – Нотогинзенозид R1, 3 – не идентифицирован, 4 – Гинзенозид Rg1, 5 – Гинзенозид Re, 6 – Нотогинзенозид A, 7 – Псевдогинзенозид Rc1, 8 – Гинзенозид La, 9 – Гинзенозид Rf, 10 – Нотогинзенозид R2, 11 – Нотогинзенозид R4, 12 – Тригидрокси-9-октадеценовая кислота, 13 – Нотогинзенозид Ra3, 14 – 20(R)-Гинзенозид Rg2 или Мединозид E, 15 – Квадрангулозид, 16 – Гинзенозид F1, 17 – Гинзенозид Ra2, 18 – Гинзенозид Rb1, 19 – Гинзенозид Rc, 20 – Гинзенозид Ra1, 21 – Гинзенозид Ro, 22 – Гинзенозид Rb2, 23 – Mалонил-гинзенозид Rb2, 24 – Хингенозид R1, 25 – Гинзенозид Rd, 26 – Maлонил-гинзенозид Rd, 27 – Гинзенозид Rs1, 28 – Tритерпен 1, 29 – Tритерпен 2, 30 – Нотогинзенозид R3, 31 – Псевдогинзенозид Rc1, 32 – Нотогинзенозид R6, N или M, 33 – Псевдогинзенозид Rc1, 34 – Нотогинзенозид T2, 35 – Нотогинзенозид T2, 36 –Tритерпен 3, 37 – 20(S)-Гинзенозид Rg3, 38 – 20(R)-Гинзенозид Rg3, 39 – Гинзенозид Rk1, 40 – Гинзенозид Rg5. Fig. 1. HPLC-HRMS profiles of P. ginseng metabolites of root (a) and callus cell culture (b). Total ion chromatogram (TIC) in negative ionization mode. 1 – 20-O-Glucoginsenoside-Rf, 2 – Notoginsenoside R1, 3 – Unknown, 4 – Ginsenoside Rg1, 5 – Ginsenoside Re, 6 – Notoginsenoside A, 7 – Pseudoginsenoside Rc1, 8 – Ginsenoside La, 9 – Ginsenoside Rf, 10 – Notoginsenoside R2, 11 – Notoginsenoside R4, 12 – Trihydroxy-9-octadecenoic acid, 13 – Notoginsenoside Ra3, 14 – 20(R)-Ginsenoside Rg2 or Medinoside E, 15 – Quadranguloside, 16 – Ginsenoside F1, 17 – Ginsenoside Ra2, 18 – Ginsenoside Rb1, 19 – Ginsenoside Rc, 20 – Ginsenoside Ra1, 21 – Ginsenoside Ro, 22 – Ginsenoside Rb2, 23 – Malonyl ginsenoside Rb2, 24 – Quinquenoside R1, 25 – Ginsenoside Rd, 26 – Malonyl-ginsenoside Rd, 27 – Ginsenoside Rs1, 28 – Triterpene 1, 29 ‒ Triterpene 2, 30 – Notoginsenoside R3, 31 – Pseudoginsenoside Rc1, 32 – Notoginsenoside R6, N or M, 33 – Pseudoginsenoside Rc1, 34 – Notoginsenoside T2, 35 – Notoginsenoside T2, 36 – Triterpene 3, 37 – 20(S)-Ginsenoside Rg3, 38‒ 20(R)-Ginsenoside Rg3, 39 – Ginsenoside Rk1, 40 – Ginsenoside Rg5.

Электро-распылительная ионизация (ESI) является универсальным и мягким методом при ВЭЖХ-МСВР анализе вторичных метаболитов растений. При регистрации отрицательных ионов этим методом, в масс-спектре гинзенозидов обычно присутствует ярко выраженный ион депротонированной молекулы [М–Н]−, а также его аддукты ([М–2Н]2–, [2М–Н]–, [M + HCOOH–2H]2– и [M + HCOOH–H]–) и фрагменты (рис. 2).

Рис. 2.

Масс-спектры гинзенозида Rf (а) и гинзенозида Ra2 (b) каллусной культуры клеток женьшеня обыкновенного. Fig. 2. Mass spectra of ginsenoside Rf (a) and ginsenoside Ra2 (b) identified in the P. ginseng callus cell culture.

При изучении масс-спектров гинзенозидов основное внимание было направлено на определение m/z иона [М–Н]−. С этой целью исследовали изотопный состав m/z значения каждого аддукта. В качестве примера, на рис. 3 показаны данные для гинзенозида Rf (a, b и c) и гинзенозида Ra2 (d). Одно- и двухзарядные ионы определяли по различию m/z значения изотопных ионов (рис. 3).

Рис. 3.

Определение одно- и двухзарядных аддуктов иона [М–Н]− в масс-спектре гинзенозида Rf (a, b и c) и гинзенозида Ra2 (d) на основе различий m/z изотопных ионов. Fig. 3. Determination of single- and double-charged adducts of the ion [М-Н]− in the mass spectrum of ginsenoside Rf (a, b, c) and ginsenoside Ra2 (d) based on the differences in the masses of isotopic ions.

У однозарядных ионов, измеряемый интервал составляет около “1”, а у двухзарядных – “0.5”. Далее, моноизотопный ион [М–Н]− определяли среди других однозарядных аддуктов масс-спектра и использовали для расчета моноизотопной массы гинзенозида. Точное значение моноизотопной массы позволяет надежно идентифицировать гинзенозид, используя существующие базы масс-спектрометрических данных [21, 22], а также данные, опубликованные в литературе [23–30].

Изучение состава экстрактов корня и каллусной культуры клеток женьшеня обыкновенного позволило обнаружить 40 соединений, 36 из которых были идентифицированы (табл. 2).

В результате идентификации обнаружено присутствие 32 гинзенозидов и 2 малонил-гинзенозида (соединения 23 и 26). Было показано, что из 40 соединений корня P. ginseng, в каллусной культуре клеток присутствуют только 33 соединения. Судя по величине пиков метаболитов, основными гинзенозидами экстракта корня были протопанаксатриолы (Rg1, Re, Rf), протопанаксадиолы (Rb1, Rb2, Rd и хингенозид R1) и гинзенозид Ro из группы олеанана (рис. 1). Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее [30, 32]. Наряду с гинзенозидами идентифицированы малонильные производные гинзенозидов Rg1 и Rd.

Таблица 2.  

Биологически активные соединения, обнаруженные и идентифицированные в экстрактах корня и каллусной культуры клеток женьшеня обыкновенного методом ВЭЖХ-МСВР Table 2.  Biologically active compounds detected and identified in the root and callus cell culture of Panax ginseng with application of HPLC-HRMS

№ Объект* Время (мин) Масс-спектр (m/z) Моноизотопная масса (Да) Формула Ошибка
(ppm) 		Наименование
[M–H]– аддукты экспериментальная рассчитанная
1 1, 2 39.96 961.5388 1007.5432 [M + HCOOH–H]– 962.5461 962.5450 C48H82O19 1.14 20-O-Глюкогинзенозид-Rf
20-O-Glucoginsenoside-Rf
2 1, 2 40.73 931.5283 977.531 [M + HCOOH–H]– 932.5356 932.5345 C47H80O18 1.22 Нотогинзенозид R1
Notoginsenoside R1
3 1, 2 41.54 1141.5942 1187.6055 [M + HCOOH–H]–;
570.2953 [M–2H]2–;
593.2987 [M + HCOOH–2H]2–;
447.2217 [C21H23O10]–		 1142.6015 1142.6025 C61H90O20 –0.88 Не идентифицировано
4 1, 2 42.49 799.4859 845.4906 [M + HCOOH–H]– 800.4932 800.4922 C42H72O14 1.25 Rg1
5 1, 2 42.88 945.5416 991.5470 [M + HCOOH–H]– 946.5489 946.5501 C48H82O18 –1.27 Re
6 1, 2 46.66 1123.5869 1169.5977 [M + HCOOH–H]–;
584.2927 [M + HCOOH–2H]2–;
561.2885 [M–2H]2–		 1124.5942 1124.5978 C54H92O24 –3.20 Нотогинзенозид A
Notoginsenoside A
7 1 47.10 987.5498 1031.5423 [M + HCOOH–H]– 988.5571 988.5607 C50H84O19 –3.62 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1
8 1, 2 47.13 841.4953 885.4858 [M + HCOOH–H]– 842.5026 842.5027 C44H74O15 –0.20 La
9 1, 2 52.64 799.4851 845.4899 [M + HCOOH–H]–;
1599.9714 [2M–H]–		 800.4924 800.4922 C42H72O14 0.25 Rf
10 1, 2 54.12 769.4730 815.4789 [M + HCOOH–H]–;
1539.9509 [2M–H]–		 770.4803 770.4816 C41H70O13 –1.69 Нотогинзенозид R2
Notoginsenoside R2
11 1, 2 54.84 1239.6372 1285.6402 [M + HCOOH–H]–;
619.3143 [M–2H]2–;
642.3173 [M + HCOOH–2H]2–		 1240.6445 1240.6452 C59H100O27 –0.56 Нотогинзенозид R4
Notoginsenoside R4
12 1, 2 55.22 329.2328 – 330.2401 330.2406 C18H34O5 –1.51 Тригидрокси-9-Октадеценовая кислота
Trihydroxy-9-octadecenoic acid
13 1 55.51 1239.6399 1285.6401 [M + HCOOH–H]–;
619.3158 [M–2H]2–;
642.3178 [M + HCOOH–2H]2–		 1240.6472 1240.6452 C59H100O27 1.61 Нотогинзенозид Ra3
Notoginsenoside Ra3
14 1, 2 55.86 783.4896 829.4831 [M + HCOOH–H]– 784.4969 784.4972 C42H72O13 –0.50 20(R)-Rg2
15 1, 2 56.03 1105.5780 1151.5842 [M + HCOOH–H]–;
552.2845 [M–2H]2–;
575.2885 [M + HCOOH–2H]2–		 1106.5853 1106.5872 C54H90O23 –1.79 Квадрангулозид
Quadranguloside
16 1 56.23 637.4312 683.4379 [M + HCOOH–H]– 638.4385 638.4394 C36H62O9 –1.38 F1
17 1 56.41 1209.6237 1255.6291 [M + HCOOH–H]–;
604.3097 [M–2H]2–;
627.3117 [M + HCOOH–2H]2–		 1210.6310 1210.6288 C65H94O21 1.82 Ra2
18 1, 2 56.58 1107.5946 1153.5984 [M + HCOOH–H]–;
553.2940 [M–2H]2–;
576.2967 [M + HCOOH–2H]2–		 1108.6019 1108.6029 C58H98O26 –0.90 Rb1
19 1, 2 57.18 1077.5844 1123.5913 [M + HCOOH–H]–;
538.2889 [M–2H]2–;
561.2918 [M + HCOOH–H]2–		 1078.5917 1078.5924 C53H90O22 –0.65 Rc
20 1, 2 57.33 1209.6239 604.3104 [M–2H]2–;
627.3119 [M + HCOOH–2H]2–		 1210.6312 1210.6288 C65H94O21 1.98 Ra1
21 1, 2 57.49 955.4894 1912.9809 [2M–H]– 956.4967 956.4981 C48H76O19 –1.46 Ro
22 1, 2 57.79 1077.5844 1123.5869 [M + HCOOH–H]–;
538.2884 [M–2H]2–;
561.2915 [M + HCOOH–2H]2–		 1078.5917 1078.5924 C53H90O22 –0.65 Rb2
23 1, 2 58.14 1163.5808 – 1164.5881 1164.5928 C56H92O25 –4.04 Малонил-гинзенозид Rb2
Malonyl ginsenoside Rb2
24 1, 2 58.37 1149.6030 1195.6091 [M + HCOOH–H]–;
574.2988 [M–2H]2–;
597.3014 [M + HCOOH–2H]2–		 1150.6103 1150.6135 C56H94O24 –2.78 Хингенозид R1
Quinquenoside R1
25 1, 2 58.89 945.5410 991.5456 [M + HCOOH–H]– 946.5483 946.5501 C48H82O18 –1.90 Rd
26 1, 2 59.18 1031.5433 – 1032.5506 1032.5505 C51H84O21 0.10 Малонил-гинзенозид Rd
Malonyl ginsenoside Rd
27 1 59.41 1119.5914 1165.5939 [M + HCOOH–H]–;
559.2022 [M–2H]2–;
582.2943 [M + HCOOH–2H]2–		 1120.5987 1120.6029 C62H88O18 –3.75 Rs1
28 1, 2 59.76 1175.6163 1221.6227 [M + HCOOH–H]–;
587.3058 [M–2H]2–;
610.3095 [M + HCOOH–2H]2–		 1176.6236 1176.6232 C65H92O19 0.27 Тритерпен 1
Triterpene 1
29 1, 2 59.96 1175.6186 1221.6232 [M + HCOOH–H]–;
587.3067 [M–2H]2–;
610.310 [M + HCOOH–2H]2–		 1176.6259 1176.6232 C65H92O19 2.23 Тритерпен 2
Triterpene 2
30 1, 2 60.42 961.5341 – 962.5414 962.5450 C48H82O19 –3.74 Нотогинзенозид R3
Notoginsenoside R3
31 1, 2 60.63 987.5510 1033.5528 [M + HCOOH–H]– 988.5583 988.5607 C50H84O19 –2.43 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1
32 1, 2 60.89 961.5321 – 962.5394 962.5450 C48H82O19 –5.82 Нотогинзенозид R6, N или M
Notoginsenoside R6, N or M
33 1, 2 61.51 987.5490 1033.5537 [M + HCOOH–H]– 988.5563 988.5607 C50H84O19 –4.45 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1
34 1, 2 62.36 665.4246 – 666.4319 666.4343 C37H62O10 –3.60 Нотогинзенозид T2
Notoginsenoside T2
35 1, 2 62.86 665.4241 – 666.4314 666.4343 C37H62O10 –4.35 Нотогинзенозид T2
Notoginsenoside T2
36 1, 2 63.28 793.4353 1587.8794 [2M–H]– 794.4426 794.4453 C42H66O14 –3.40 Тритерпен 3
Triterpene 3
37 1 64.09 783.4858 829.4914 [M + HCOOH–H]– 784.4931 784.4973 C42H72O13 –5.35 20(S)-Rg3
38 1 64.45 783.4858 829.4931 [M + HCOOH–H]– 784.4931 784.4973 C42H72O13 –5.35 20(R)-Rg3
39 1, 2 68.02 765.4767 811.4806 [M + HCOOH–H]– 766.4840 766.4867 C42H70O12 –3.52 Rk1
40 1, 2 68.40 765.4783 811.4806 [M + HCOOH–H]– 766.4856 766.4867 C42H70O12 –1.44 Rg5

Примечание. * Объект: 1 – корень, 2 – каллусная культура клеток. Note. *Object: 1 – root, 2 – callus.В результате идентификации обнаружено присутствие 32 гинзенозидов и 2 малонил-гинзенозида (соединения 23 и 26). Было показано, что из 40 соединений корня P. ginseng, в каллусной культуре клеток присутствуют только 33 соединения. Судя по величине пиков метаболитов, основными гинзенозидами экстракта корня были протопанаксатриолы (Rg1, Re, Rf), протопанаксадиолы (Rb1, Rb2, Rd и хингенозид R1) и гинзенозид Ro из группы олеанана (рис. 1). Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее [30, 32]. Наряду с гинзенозидами идентифицированы малонильные производные гинзенозидов Rg1 и Rd.

Сравнение профилей ВЭЖХ-МСВР экстрактов каллусной культуры клеток и корня показало различие в относительном содержании большинства метаболитов. По сравнению с корнем, каллусная культура клеток отличалась меньшим содержанием большинства гинзенозидов (рис. 1, табл. 3).

Таблица 3.  

Относительное содержание гинзенозидов в экстракте корня и каллусной культуры клеток женьшеня обыкновенного. Содержание, площадь пика характерного m/z иона на 100 мг сухого экстракта Table 3.  Relative content of ginsenosides in the root and callus cell culture of Panax ginseng, peak area of characteristic m/z ion per 100 mg of dry extract

№ Время, мин Название Ион
(m/z) 		Среднее содержаниеa Разница (fold) p-value
корень каллус
1 39.96 20-O-Глюкогинзенозид-Rf
20-O-Glucoginsenoside-Rf 		1007.5 11.2 0.5 21.9 ***
2 40.73 Нотогинзенозид R1
Notoginsenoside R1 		977.5 7.7 0.3 26.1 ***
3 41.54 Не идентифицировано 593.3 21.6 3.6 6.0 ***
4 42.49 Rg1 845.5 75.6 61.8 1.2 *
5 42.88 Re 991.5 44.0 32.6 1.4 *
6 46.66 Нотогинзенозид A
Notoginsenoside A 		584.3 19.3 47.2 –2.5 **
7 47.10 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1 		1031.5 5.8 0.0 – –
8 47.13 La 885.5 7.4 0.7 10.3 ***
9 52.64 Rf 845.5 29.2 11.1 2.6 **
10 54.12 Нотогинзенозид R2
Notoginsenoside R2 		815.5 10.2 1.6 6.5 ***
11 54.84 Нотогинзенозид R4
Notoginsenoside R4 		642.3 5.8 0.1 83.5 ***
12 55.22 Тригидрокси-9-Октадеценовая кислота
Trihydroxy-9-octadecenoic acid 		329.2 85.7 214.2 –2.5 **
13 55.51 Нотогинзенозид Ra3
Notoginsenoside Ra3 		642.3 2.0 0.0 – –
14 55.86 20(R)-Rg2 829.5 91.4 107.3 –1.1 n.s
15 56.03 Квадрангулозид, Quadranguloside 575.3 1.0 5.9 –5.0 **
16 56.23 F1 683.4 15.1 0.0 – –
17 56.41 Ra2 627.3 6.9 0.0 – –
18 56.58 Rb1 576.3 37.1 29.1 1.3 *
19 57.18 Rc 561.3 15.3 6.9 2.2 **
20 57.33 Ra1 627.3 21.0 7.2 2.9 **
21 57.49 Ro 955.5 14.3 7.6 1.9 *
22 57.79 Rb2 1077.6 17.6 3.5 5.0 ***
23 58.14 Малонил-гинзенозид Rb2
Malonyl ginsenoside Rb2 		1163.6 56.5 2.6 22.1 ***
24 58.37 Хингенозид R1
Quinquenoside R1 		597.3 92.4 9.4 9.8 ***
25 58.89 Rd 991.5 14.2 5.2 2.7 **
26 59.18 Малонил-гинзенозид Rd
Malonyl ginsenoside Rd 		1031.5 30.9 7.5 4.1 ***
27 59.41 Rs1 582.3 4.2 0.0 – –
28 59.76 Тритерпен 1
Triterpene 1 		610.3 13.2 58.0 –5.0 ***
29 59.96 Тритерпен 2
Triterpene 2 		610.3 1.4 58.9 –50.0 ***
30 60.42 Нотогинзенозид R3
Notoginsenoside R3 		961.5 7.5 3.0 2.5 **
31 60.63 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1 		1033.6 16.2 0.7 22.7 ***
32 60.89 Нотогинзенозид R6, N или M
Notoginsenoside R6, N or M 		961.5 13.0 7.8 1.7 **
33 61.51 Псевдогинзенозид Rc1
Pseudoginsenoside Rc1 		1033.6 4.0 0.5 8.6 ***
34 62.36 Нотогинзенозид T2
Notoginsenoside T2 		665.4 19.7 3.3 5.9 ***
35 62.86 Нотогинзенозид T2
Notoginsenoside T2 		665.4 38.5 6.5 5.9 ***
36 63.28 Тритерпен 3
Triterpene 3 		793.4 58.0 23.5 2.5 **
37 64.09 20(S)-Rg3 829.5 31.2 0.0 – –
38 64.45 20(R)-Rg3 829.5 9.5 0.0 – –
39 68.02 Rk1 811.5 9.7 2.5 3.9 ***
40 68.40 Rg5 811.5 14.1 2.4 5.9 ***

Примечание. a Среднее значение для трех образцов; t-тест, * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; n.s. – не значимое. Note. a Mean value for three samples; t-test, * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; n.s. – not significant.

Как показывают некоторые исследования, отношение групп протопанаксадиолы/протопанаксатриолы зависит от условий культивирования женьшеня: в корне преобладают диолы, тогда как в культуре in vitro – триолы [16]. Аналогичные результаты получены и в нашем исследовании. В корне содержание гинзенозидов из группы диолов было в 1.3 раза выше по сравнению с триолами, а в каллусной культуре клеток, наоборот, в 1.9 раза ниже. Отношение гинзенозидов Rb1/Rg1 часто используется для идентификации различных видов женьшеня. Например, у P. quinquefolius соотношение Rb1/Rg1 меньше 0.4, а у P. ginseng больше 1 [33]. В нашем исследовании соотношение Rb1/Rg1 в корне женьшеня было около 2, что типично для P. ginseng. Аналогичное соотношение было обнаружено и в каллусной культуре клеток, хотя есть данные о зависимости этого параметра от способа культивирования женьшеня [34].

В настоящее время большое внимание уделяется изучению минорных гинзенозидов, таких как Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, F1, F2 и C-K [35, 36]. В корне женьшеня эти соединения обычно присутствуют в следовых количествах, или вообще отсутствуют [36, 37]. ВЭЖХ-МСВР анализ позволил обнаружить четыре минорных соединения (Rg2, Rg3, F1 и Rg5) в корне и два соединения (Rg2 и Rg5) в каллусной культуре клеток P. ginseng (табл. 2). Гинзенозиды 20(S)-Rg3 и 20(R)-Rg3 – эпимеры, показавшие высокую фармакологическую активность [38]. Они проявляют нейропротекторный эффект при нейротоксичности, вызванной глутаматом, благодаря механизмам, связанным с антиоксидантным действием и антиапоптозом, и могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера [39]. Rg3, Rg5 и F1 обладают антиканцерогенной, иммуностимулирующей и противовоспалительной активностью [3, 9, 38, 40]. Предполагается, что Rg2 может быть использован при лечении диабета 2 типа, поскольку он подавляет выработку глюкозы в печени за счет фосфорилирования GSK3β [41]. Гинзенозиды Rh2 и Rg3 запускают апоптоз опухолевых клеток, ингибируют их пролиферацию, инвазию опухоли и метастазирование [36].

Таким образом, при исследовании состава и содержания гинзенозидов в корне и в каллусной культуре клеток женьшеня обыкновенного (P. ginseng) из биоколлекции ВИЛАР методом ВЭЖХ-МСВР установлено, что в корне женьшеня присутствуют 40 соединений, среди которых основными были гинзенозиды Rg1, Re, Rf, Rd, Rb1, Ra1 и Rb2. Идентифицированы также минорные гинзенозиды Rg5, 20(R)-Rg2, эпимеры Rg3 и малонил-гинзенозиды Rb2 и Rd. В отличие от корня, каллусная культура клеток содержала всего 33 гинзенозида. Общее содержание биологически активных гинзенозидов в каллусной культуре клеток было ниже, чем в корне, а также отсутствовали важные гинзенозиды, такие как Rg3 и F1. Кроме того, было показано, что в каллусной культуре клеток преобладали гинзенозиды группы протопанаксатриола (Rg1 и Re), а в корне – группы протопанаксадиола (Rb1/Rb2 и Ra1). В настоящее время, изучаются факторы регуляции биосинтеза гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng, которые позволят повысить продуктивность культуры и увеличить выход биологически активных гинзенозидов.

Список литературы

  1. Sharma S.K., Pandit M.K. A new species of Panax L. (Araliaceae) from Sikkim Himalaya, India. Syst. Bot., 2009, 34, 434–438. https://doi.org/10.1600/036364409788606235

  2. Christensen L.P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Adv. Food Nutr. 2009, 55, 1–99. https://doi.org/10.1016/S1043-4526(08)00401-4

  3. Kim J.H., Yi Y.-S., Kim M.Y., Cho J.Y. Role of ginsenosides, the main active components of Panax ginseng, in inflammatory responses and diseases. J. of Ginseng Res., 2017, 41, 435–443. https://doi.org/10.1016/j.jgr.2016.08.004

  4. Yang W.-Z., Hu Y., Wu W.-Y., Ye M., Guo D.-A. Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity. Phytochemistry, 2014, 106, 7–24. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2014.07.012

  5. Ru W., Wang D., Xu Y., He X., Sun Y.-E., Qian L., Zhou X., Qin Y. Chemical constituents and bioactivities of Panax ginseng (C.A. Mey.). Drug Discov. Ther., 2015, 9, 23–32. https://doi.org/10.5582/ddt.2015.01004

  6. Lee D.G., Lee J.S., Kim K.-T., Kim H.Y., Lee S. Analysis of major ginsenosides in various ginseng samples. J. Appl. Biol. Chem., 2019, 62, 87–91. https://doi.org/10.3839/jabc.2019.013

  7. Attele A.S., Wu J.A., Yuan C.S. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem. Pharmacol., 1999, 58, 1685–1693. https://doi.org/10.1016/s0006-2952(99)00212-9

  8. Chen W., Balan P., Popovich D.G. Comparison of ginsenoside components of various tissues of New Zealand forest-grown Asian ginseng (Panax ginseng) and American ginseng (Panax quinquefolium L.). Biomolecules, 2020, 10, 372. https://doi.org/10.3390/biom10030372

  9. Kim J.H., Kwon S.K., Sung N.Y., Jung P.M., Choi J.I., Kim J.K. Effect of gamma irradiation on the conversion of ginsenoside Rb1 to Rg3. Radiat. Phys. Chem., 2012, 81, 1128–1131. https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2011.11.059

  10. Park S.E., Na C.S., Yoo S.A., Seo S.H., Son H.S. Biotransformation of major ginsenosides in ginsenoside model culture by lactic acid bacteria. J. of Ginseng Res., 2017, 41, 36–42. https://doi.org/10.1016/j.jgr.2015.12.008

  11. Kim Y., Zhang D., Yang D. Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosides. Biotechnol. Adv., 2015, 33, 717–735. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.03.001

  12. Biswas T., Kalra A., Mathur A.K. Elicitors’ influenced differential ginsenoside production and exudation into medium with concurrent Rg3/Rh2 panaxadiol induction in Panax quinquefolius cell suspensions. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2016, 100, 4909–4922. https://doi.org/10.1007/s00253-015-7264-z

  13. Kim M., Shim C., Kim Y., Hong S., Park J., Han E., Kim S. Enhancement of seed dehiscence by seed treatment with Talaromyces flavus GG01 and GG04 in Ginseng (Panax ginseng). Plant Pathol., 2017, 33, 1–8. https://doi.org/10.5423/PPJ.OA.06.2016.0146

  14. Lee J., Jo I., Kim J., Hong C., Kim Y., Kim D., Park Y. Improvement of seed dehiscence and germination in ginseng by stratification, gibberellin, and/or kinetin treatments. Hortic. Environ. Biotechnol., 2018, 59, 293–301. https://doi.org/10.1007/s13580-018-0039-6

  15. Kochkin D.V., Kachala V.V., Shashkov A., Chizhov A.O., Chirva V.Y., Nosov A.M. Malonyl-ginsenoside content of a cell-suspension culture of Panax japonicus var. repens. Phytochemistry, 2013, 93, 18–26. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.03.021

  16. Kochkin D.V., Galishev B.A., Glagoleva E.S., Titova M.V., Nosov A.M. Rare triterpene glycoside of ginseng (ginsenoside malonyl-Rg1) detected in plant cell suspension culture of Panax japonicus var. repens. Russ. J. Plant Physiol., 2017, 64(5), 649–656. https://doi.org/10.1134/s102144371705003x

  17. Бушуева Г.Р., Леонидова Ю.А., Савина Т.А., Ферубко Е.В. Адаптогенная активность 30%-ной настойки из клеточной культуры женьшеня обыкновенного (Panax ginseng C.A. Mey). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2014, 12, 35–36

  18. Лупанова И.А., Цыбулько Н.С., Савина Т.А., Ферубко Е.В. Исследование биологической активности экстракта из биомассы женьшеня обыкновенного (Panax ginseng C.A. Mey) с применением специфических ферментных биотест-систем in vitro. Разработка и регистрация лекарственных средств, 2017, 3, 104–106

  19. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant., 1962, 15, 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

  20. Савина Т.А., Цыбулько Н.С. Паспорт каллусной культуры клеток женьшеня Pa.g (В) 05ВИЛАР № 04868244-010-2011, 2011, 5

  21. Guijas C., Montenegro-Burke J.R., Domingo-Almenara X., Palermo A., Warth B., Hermann G., Koellensperger G., Huan T., Uritboonthai W., Aisporna A.E., Wolan D.W., Spilker M.E., Benton H.P., Siuzdak G. METLIN: A technology platform for identifying knowns and unknowns. Anal. Chem., 2018, 90, 3156–3164. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04424

  22. Wishart D.S., Feunang Y.D., Marcu A. HMDB 4.0: the human metabolome database. Nucleic Acids Research, 2018, 46(D1), 608–617. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1089

  23. Wang X., Sakuma T., Asafu-Adjaye E., Shiu G.K. Determination of ginsenosides in plant extracts from Panax ginseng and Panax quinquefolius L. by LC/MS/MS. Anal. Chem., 1999, 71, 1579–1584. https://doi.org/10.1021/ac980890p

  24. Chan T.W.D., But P.P.H., Cheng S.W., Kwok I.M.Y., Lau F.W., Xu H.X. Differentiation and authentication of Panax ginseng, Panax quinquefolius, and ginseng products by using HPLC/MS. Anal. Chem., 2000, 72, 1281–1287. https://doi.org/10.1021/ac990819z

  25. Kite G., Howes M.-J., Leon C., Simmonds M. Liquid chromatography/mass spectrometry of malonyl-ginsenosides in the authentication of ginseng. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17: 238–244. https://doi.org/10.1002/rcm.899

  26. Fuzzati N. Analysis methods of ginsenosides. J. Chromatogr. B., 2004, 812, 119–133. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2004.07.039

  27. Wei Y.-J., Li P., Shu B., Li H.J., Peng Y.-R., Song Y., Chen J., Yi L. Analysis of chemical and metabolic components in traditional Chinese medicinal combined prescription containing Radix Salvia miltiorrhiza and Radix Panax notoginseng by LC-ESI-MS methods. Biomed. Chromatogr., 2007, 21, 797–809. https://doi.org/10.1002/bmc.775

  28. Angelova N., Kong H.W., Van der Heijden R., Yang S.Y., Choi Y.H., Kim H.K., Wang M., Hankemeier T., Van der Greef J., Xu G., Verpoorte R. Recent methodology in the phytochemical analysis of Ginseng. Phytochemical Analysis, 2008, 19, 2–16. https://doi.org/10.1002/pca.1049

  29. Yi J.-H., Kim V.-Y., Kim Y.-C., Jeong W.-S., Bae D.-W., Hur J.-M., Jun M. Change of ginsenoside composition in Red ginseng processed with citric acid. Food Sci. Technol., 2010, 19, 647–653. https://doi.org/10.1016/j.jgr.2015.05.005

  30. Wang H.-P., Zhang Y.-B., Yang X.-W., Yang X.-B., Xu W., Xu F., Cai S.-Q., Wang Y.-P., Xu Y.-H., Zhang L.-X. High-performance liquid chromatography with diode array detector and electrospray ionization ion trap time-of-flight tandem mass spectrometry to evaluate ginseng roots and rhizomes from different regions. Molecules, 2016, 21, 603. https://doi.org/10.3390/molecules21050603

  31. R. Team. R: A language and environment for statistical computing. Vienna, Austria, R Foundation for Statistical Computing, 2011. (ISBN 3-900051-07-0).

  32. Yang W., Qiao X., Li K., Fan J., Bo T., Guo D., Ye M. Identification and differentiation of Panax ginseng, Panax quinquefolium, and Panax notoginseng by monitoring multiple diagnostic chemical markers. Acta Pharm. Sin. B., 2016, 6, 568–575. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.05.005

  33. Kim D.H. Chemical diversity of Panax ginseng, Panax quinquifolium, and Panax notoginseng. J. of Ginseng Res., 2012, 36, 1–15. https://doi.org/10.5142/jgr.2012.36.1.1

  34. Yu K.W., Murthy H.N., Hahn E.J., Paek K.Y. Ginsenoside production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality. Biochem. Eng. J., 2005, 23, 53–56. https://doi.org/10.1016/j.bej.2004.07.001

  35. Gwak Y.S., Han J.Y., Adhikari P.B. Heterologous production of a ginsenoside saponin (compound K) and its precursors in transgenic tobacco impairs the vegetative and reproductive growth. Planta, 2017, 245, 1105–1119. https://doi.org/10.1007/s00425-017-2668-x

  36. Yan H., Jin H., Fu Y., Yin Z., Yin C. Production of rare ginsenosides Rg3 and Rh2 by endophytic bacteria from Panax ginseng. J. Agric. Food Chem., 2019, 67, 8493–8499. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b03159

  37. In G., Ahn N.G., Bae B.S., Han S.T., Noh K.B., Kim C.S. New method for simultaneous quantification of 12 ginsenosides in red ginseng powder and extract: in-house method validation. J. of Ginseng Res., 2012, 36, 205–210. https://doi.org/10.5142/jgr.2012.36.2.205

  38. Choi P., Park J.Y., Kim T., Park S.-H., Kim H., Kang K.S., Ham J. Improved anticancer effect of ginseng extract by microwave-assisted processing through the generation of ginsenosides Rg3, Rg5 and Rk1. J. Funct. Foods., 2015, 14, 613–622. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.02.038

  39. Li N., Liu B., Dluzen D.E., Jin Y. Protective effects of ginsenoside Rg2 against glutamate-induced neurotoxicity in PC12 cells. J. Ethnopharmacol., 2007, 111, 458–463. https://doi.org/10.1016/j.jep.2006.12.015

  40. Kwon H.-J., Lee H., Choi G.-E. Ginsenoside F1 promotes cytotoxic activity of NK cells via insulin-like growth Factor-1-Dependent mechanism. Front. Immunol., 2018, 9, 2785. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02785

  41. Wang M., Li H., Liu W., Cao H., Hu X., Gao X., Xu F., Li Z., Hua H., Li D. Dammarane-type leads panaxadiol and protopanaxadiol for drug discovery: Biological activity and structural modification. Eur. J. Med. Chem., 2020, 189, 112087. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2020.112087

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биотехнология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал