Биология внутренних вод, 2019, № 1, стр. 86-95

ВВЕДЕНИЕ

Проблема влияния наночастиц металлов на живые системы стала актуальной в последние десятилетия в связи с их широким применением в промышленности [33]. Особый комплекс физико-химических свойств и характеристик биологического действия наночастиц и наноматериалов, радикально отличающихся от свойств этого же вещества или материала в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий, характеризует их как новый вид материалов и продукции с обязательной оценкой потенциального риска для окружающей среды и здоровья человека [6]. Размер таких частиц обеспечивает многократное возрастание их суммарной поверхности и проникающей способности и дает значительные возможности для коррекции различных патологических процессов, в то же время представляя опасность для сохранности структуры и функции нормальных клеток и тканей. Поскольку многие металлы оказывают влияние на функциональное состояние организма, в том числе антиоксидантной системы, вызывает обеспокоенность тот факт, что наночастицы в технологическом цикле производства неизбежно попадают в почву и, вымываясь, могут переноситься в водоемы [27]. Поэтому изучение влияния наночастиц на жизнедеятельность водных организмов, показателей их физиологического статуса и возможности использования для биоиндикации и биоремедиации антропогенно загрязненных водоемов имеет научную и практическую значимость. Широкий спектр живых организмов позволяет с учетом всех токсикологических особенностей соединений исследовать их биологическую активность [1]. Имеются данные об исследовании ряда наночастиц in vitro [32]. Однако для никеля их недостаточно [40], несмотря на признание его приоритетным загрязнителем биосферы [10].

Цель работы – определение эколого-токсических эффектов наночастиц никеля и оксида никеля в водной среде с использованием рыб Danio rerio в качестве тест-объекта.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы наночастицы никеля (Ni-НЧ) и оксида никеля (NiO-НЧ), полученные методом электрического взрыва проводника в атмосфере (“Передовые порошковые технологии”, Россия): Ni-НЧ размером 70 нм, с удельной поверхностью (S_уд) 4.6–6.0 м²/г, Ζ-потенциалом 25 ± 0.5 мВ, дозой 1.0 мг/дм³; NiO-НЧ – 94 нм, (S_уд) 12 м²/г, 29 ± 0.5 мВ, 1.3 мг/дм³.

Для выполнения эксперимента из 330 особей использовали 105 особей Danio rerio (вид пресноводных лучеперых рыб семейства карповых) возрастом 1 мес. В течение 21 сут (предварительный этап эксперимента) их содержали в условиях аквариума объемом 300 л. Затем методом пар-аналогов формировали семь групп по 15 экз., помещая каждую в отдельный аквариум объемом 10 л, в воду которого 1 раз в 7 сут добавляли исследуемые наночастицы в форме лиозолей с кормом для рыб (личинки комаров сем. Chironomidae) [30]: для I группы дозировкой – 0.01 мг/дм³ (n) Ni-НЧ, для II – 0.1 мг/дм³ (10 n) Ni-НЧ, III – 1 мг/дм³ (100 n) Ni-НЧ, IV – 0.013 мг/дм³ (n) NiO-НЧ, V – 0.13 мг/дм³ (10 n) NiO-НЧ, VI – 1.3 мг/дм³ (100 n) NiO-НЧ; VII группа – контроль (без добавления наночастиц). Для подготовки лиозолей наночастицы подвергали диспергированию (УЗДН-2Т, “НПП Академприбор”, Россия) при f – 35 кГц, 300 Вт, A – 10 мкА, 30 мин. Основной учетный период эксперимента длился 84 сут.

Во время эксперимента средние значения тестируемых свойств воды были следующие: температура – 22 ± 2°С, рН 7.3 ± 0.07, растворенный кислород 5 ± 0.2 мг/л. Режим содержания обеспечивал 12 ч света/12 ч темноты. Рыб кормили 1 раз в 2 сут. Условия выращивания и содержания объектов исследования соответствовали правилам OECD [29].

Использование животных и экспериментальные исследования выполняли в соответствии с Российским регламентом, 1987 (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977) и The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

Определение активности ферментов антиоксидантной системы и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) проводили через 7, 14 и 84 сут после гомогенизирования Danio rerio (“TissueLyser LT”, “Qiagen N.V.”, Германия) и приготовления вытяжки. Для этого к 1 объему гомогената добавляли 9 объемов трис-буферного раствора, ммоль/л: (трис-HCl – 50, дитиотреитол DTT – 1.0, EDTA – 1.0, сахароза – 250, рН 7.5). После центрифугирования (10 мин при 15000 об./мин) отбирали супернатант, в котором измеряли содержание малонового диальдегида (МДА, нмоль/мл) [12], и активность ключевых ферментов антиоксидантной системы – каталазы (КТ, КФ 1.11.1.6, мкМ Н₂О₂/мин) и супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1, % ингибирования адреналина), используя автоматический биохимический анализатор СS-T240 (“Dirui Industrial Co., Ltd.”, Китай) и коммерческие биохимические наборы для ветеринарии (“Randox Laboratories, Ltd.”, Великобритания).

Исследования проводили в лаборатории “Агроэкология техногенных наноматериалов” и Испытательном центре Всероссийского научно-исследовательского института мясного скотоводства (аттестат аккредитации RA. RU.21ПФ59 от 02.12.2015).

Метагеномный анализ содержимого кишечника рыб проводили в Центре коллективного пользования “Персистенции микроорганизмов” Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. Оценка микробного биоразнообразия включала: отбор проб, выделение, очистку и измерение концентраций ДНК, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), валидацию и нормализацию библиотек с последующим секвенированием на платформе высокопроизводительного секвенатора второго поколения “MiSeq Illumina”, США.

После вскрытия рыб, кишечники помещали в стерильные микропробирки типа “эппендорф” (Nuova Aptaca S.R.L., Италия), замораживали и хранили при –70°C, затем использовали для выделения очищенных препаратов ДНК [2].

После выделения и очистки измеряли концентрацию ДНК в растворе двумя методами – на приборах Nanodrop (“Thermo Scientific”, USA) для построения кривых оптической плотности ДНК и оценки показателя ОП (260)/ОП (280) и Qubit 2.0 (“Invitrogen/Life Technologies”, USA) для определения концентрации в нг/мкл. Концентрацию ДНК измеряли три раза: первый – после выделения ДНК, второй – после проведения первой ПЦР со специфичными 16S прокариотическими праймерами и третий раз – после второй ПЦР с адаптерами и индексами протоколов Nextera XT. Дальнейший анализ микрофлоры осуществляли методом метагеномного секвенирования.

Объединение ридов (R1 и R2) проводили с использованием программы PEAR (Pair-End AssembeR, PEAR v0.9.8, April 9, 2015) при следующих параметрах: минимальное перекрытие – 40 пн (Minimum overlap – 40 bp), p-value – 0.001, качество Q = 30 (http://www.exelixis-lab.org/web/software/pear) [41]. Фильтрацию, дерепликацию, удаление химерных последовательностей, кластеризацию, сортировку (отсечки singletons), удаление контаминации проводили с использованием программы USEARCH v8.0. Для фильтрации применяли алгоритм fastq_filter, с минимальной длиной сиквенса 415 пн; минимальное качество прочтения Q = 15), для репликации – алгоритм derep prefix, для кластеризации и удаления химерных последовательностей – алгоритм cluster otus (http://drive5.com/usearch) [18]. Для визуализации использовали ресурс VAMPS (Visualization and Analysis of Microbial Population Structures https://vamps.mbl.edu/) [23].

Концентрацию никеля в тканях тела Danio rerio определяли в лаборатории АНО “Центр биотической медицины”, Москва (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦАО.311, регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU. 0001.513118) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (МС-ИСП) на квадрупольном масс-спектрометре Elan 9000 (Perkin Elmer, США).

Статистический анализ проводили путем сравнения опытных групп с контрольной, используя SPSS 19.0 программного обеспечения (IBM Corporation) и Statistica 10. Статистически значимыми считали значения с p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выживаемость и показатели антиоксидантного статуса Danio rerio. В ходе эксперимента (84 сут) Ni-НЧ и NiO-НЧ оказали влияние на выживаемость тест-объекта (табл. 1). Увеличение концентраций NiО-НЧ сопровождалось снижением выживаемости Danio rerio на 56-е сут эксперимента при максимальной дозировке (100 n), с последующим прогрессивным снижением численности (рис. 1). Эквивалентные концентрации Ni-НЧ не вызвали подобного токсического эффекта. В контроле выживаемость была 100%.

Рис. 1.

Динамика численности Danio rerio при внесении в среду NiО-НЧ в дозах: 1 – 0.013 мг/дм³, 2 – 0.13 мг/дм³, 3 – 1.3 мг/дм³. Выживаемость в контроле 100%. По оси ординат – численность, по оси абсцисс – время экспозиции.

Анализ активности МДА в организме Danio rerio не показал его критического увеличения, лишь к концу эксперимента с Ni-НЧ (табл. 2) значение МДА превышало контрольное.

Семисуточная экспозиция Danio rerio в среде с возрастающими концентрациями наночастиц привела к подавлению выработки ферментов антиоксидантной защиты. Так, активность СОД в опыте была ниже контрольной для NiO-НЧ на 49%, Ni-НЧ – на 67% (табл. 3).

Увеличение экспозиции до 14 сут вызвало возрастание активности СОД при минимальной (n) и средней (10 n) дозовых нагрузках, причем максимальная разница (103%, p < 0.05) отмечена для NiО-НЧ при дозировке n. Высокие концентрации NiО-НЧ (100 n) привели к ингибированию активности СОД, следовательно, отсутствию антиоксидантной защиты организма.

Активность КТ в вытяжках Danio rerio в эксперименте значительно превышала показатели в контроле. Низкий (n) и средний (10 n) уровень дозировки индуцировал активность КТ на первом этапе эксперимента (7 сут), стимулируя работу антиоксидантной системы. Увеличение экспозиции до 84 сут угнетало работу систем, приводя к снижению активности КТ. Высокий дозовый уровень (100 n) вызывал ингибирование активности фермента уже на первом этапе эксперимента (7 сут), усугубляя процесс, по мере приближения эксперимента к завершению, с разовым повышением на этапе 14 сут.

Таким образом, низкая дозовая нагрузка и кратковременный контакт тест-объекта с наноформами никеля приводят к активизации системы антиоксидантной защиты организма в ответ на образование свободных радикалов. Хронические условия и высокие дозы истощают антиоксидантную систему организма на фоне гиперпродукции свободных радикалов при ОС.

Анализ концентрации никеля в теле Danio rerio показал достоверно значимое ее отличие от аналогичного показателя у контрольных особей (рис. 2). Так, уровень естественной концентрации Ni в течение эксперимента имел незначительные колебания (0.696–1.17 мкг/г). Резкое увеличение уровня Ni (разница с контролем 849%, p < 0.05) в теле рыб на седьмые сутки эксперимента зафиксировано в ответ на присутствие в среде только NiО-НЧ, с последующим уменьшением показателей ниже уровня контроля к 14-м сут. Система гомеостатического регулирования микроэлементов обеспечила постоянство уровня металла в организме и снизила его количество до уровня контроля к 14-м сут.

Рис. 2.

Динамика концентрации никеля в теле Danio rerio (мкг/г) при внесении в среду НЧ: 1 – контроль; 2 – Ni-НЧ 100 n (1.0 мг/дм³); 3 – NiO-НЧ 100 n (1.3 мг/дм³).

Дальнейшее увеличение экспозиции эксперимента (21, 28-м сут) не привело к пиковым отличиям концентрации никеля в опытных и контрольных образцах, величина которой на 21-е сут превысила контроль на 95.1% (p < 0.05), к 28 – снизилась на 44.3% (p < 0.05). Контакт тест-объекта с Ni-НЧ характеризовался волнообразным изменением значений концентрации никеля. За первые 3 нед эксперимента отмечено накопление никеля в теле Danio rerio при разнице с контролем на 7-е сут 95.7% (p < 0.05), на 14-е – 52.9%, на 21-е сут – 92.2% (p < 0.05). Хронические условия эксперимента увеличили разницу с контролем до 160.7% (p < 0.01), что привело к отложению в Danio rerio 17.25% никеля, поступившего в форме Ni-НЧ. Таким образом, по скорости и реакционности развития эффектов доминируют NiО-НЧ, поэтому их можно характеризовать как остротоксичные. Ni-НЧ обладают способностью к кумуляции, проявляя хронический токсический эффект.

Микробиоценоз кишечника Danio rerio. Таксономический анализ показал, что у контрольных рыб микробиоценоз кишечника Danio rerio в основном состоял из представителей филума Proteobacteria при относительно небольшой численности Firmicutes и Actinobacteria. Использование в питании рыб наночастиц значительно изменило состав микробиоценоза (табл. 4). В кишечнике рыб, получавших NiО-НЧ, на фоне снижения численности представителей Proteobacteria до 21% численность Firmicutes, Actinobacteria (грамположительные бактерии) повысилась в 2.18 и 6.79 раза, соответственно. Отмечено появление Fusobacteria (менее 2%), не обнаруженного в контроле. В кишечнике рыб, получавших Ni-НЧ, численность представителей Proteobacteria снизилась в 1.5 раза.

В кишечниках контрольных рыб основная численность бактерий приходилась на классы Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria (филум Proteobacteria), доля других классов была 5.8% общей численности (по убыванию – Clostridia, Actinobacteria, Planctomycetia и Bacilli). В опытной группе с NiО-НЧ уменьшалось число представителей класса Alphaproteobacteria (в 1.27 раза меньше, чем в контроле), численность бактерий класса Gammaproteobacteria заметно снизилась (в 6.16 раза) по сравнению с контрольной группой, на фоне повышения численности представителей классов Actinobacteria и Bacilli (в 6.66 и 6.37 раза соответственно). Отмечено появление бактерий классов Fusobacteria и Verrucomicrobia.

По сравнению с контролем, в группе с Ni-НЧ в десятикратно снизилась численность доминирующего класса Gammaproteobacteria. Далее по убыванию численности расположились классы Alphaproteobacteria и Actinobacteria и незафиксированные в контроле классы Verrucomicrobia и Fusobacteria. Следует отметить возрастание количества актинобактерий и бацилл, а также бактерий класса Fusobacteria (грамотрицательной анаэробной палочки) в обеих опытных группах по сравнению с контролем (не отмечены в таблице ввиду ≤2% численности).

Среди выявленных семейств доминирующее положение в кишечниках контрольных рыб занимало сем. Enterobacteriaceae, в меньшем количестве были представлены Aeromonadaceae, Pseudomonadaceae, причем аэромонады и псевдомонады традиционно считаются условно-патогенными микроорганизмами, а энтеробактерии составляют большую часть кишечной микрофлоры в норме [14]. Другие семейства были малочисленными (21.6% общего числа бактерий), по убыванию – Comamonadaceae (3.32%), Rhodobacteraceae (2.23%) и Rhizobiaceae. Наличие в рационе рыб NiО-НЧ сопровождалось 18-кратным, по сравнению с контролем, ростом численности сем. Rhodobacteraceae класса Alphaproteobacteria. Зафиксированы новые сем. Moraxellaceae и Bacillaceae, не обнаруженные в контроле.

В группе с Ni-НЧ численность сем. Rhodobacteraceae возросла в 5.7 раза. Зафиксировано также появление семейств, не обнаруженных в контрольном образце (Bacillaceae, Staphylococcaceae, Ectothiorhodospiraceae) и описанных в литературе как патогенные микроорганизмы для рыб [37].

В контроле состав кишечной микробиоты был представлен преимущественно родами Citrobacter (C. freundii, C. werkmanii) и Enterobacter (E. soli). В опыте с NiО-НЧ (см. табл. 4) доминировали роды Acinetobacter (A. baumannii и A. gerneri) и Bacillus на фоне скудного качественного состава микроорганизмов.

В опыте с Ni-НЧ преобладали роды Rhodobacter (R. gluconicum и R. ovatus), Methylobacterium (M. marchantiae) и Mycobacterium (см. табл. 4).

Cледует отметить, что в хроническом эксперименте (84 сут) изменения качественного состава микробиоценоза кишечника рыб, возможно, играют существенную роль в выживаемости тест-объектов, т. к. их контакт с NiO-НЧ привел к гибели всех животных, а с Ni-НЧ – 50 ± 9%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Развитие окислительных процессов под воздействием наночастиц может демонстрировать уровень ПОЛ, оцениваемый по накоплению МДА [7]. В эксперименте не установлено критическое его увеличение в организме Danio rerio и лишь хроническое действие Ni-НЧ привело к повышению уровня МДА. Подобная картина отмечена при изучении наночастиц Ag [17]. По-видимому, только хроническая экспозиция Danio rerio с Ni-НЧ приводит к развитию окислительных повреждений.

Причиной накопления МДА в тканях рыб может служить как усиление образования перекисей, так и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты в ответ на хроническое воздействие наночастиц металлов [13]. Однако не только накопление МДА служит маркером развития ОС (оксидативный стресс), определенная роль в этом процессе отводится диеновым конъюгатам и другим активным продуктам, реагирующим с тиобарбитуровой кислотой [9]. Возможно, накопление именно этих продуктов стало причиной развития ОС и гибели тест-организмов при внесении в среду NiО-НЧ, как одного из металлов переменной валентности и индукторов ОС [39].

Одну из первых линий защиты клеток от агрессивного действия свободных радикалов, в том числе и перекисных, обеспечивают ферменты СОД, КТ и др. [4]. Динамика активности ферментов антиоксидантной защиты имела дозозависимый характер. Высокие концентрации NiО-НЧ (100 n) привели к ингибированию активности СОД, и, следовательно, к нарушению антиоксидантной защиты организма. При введении наночастиц оксида алюминия в культуру клеток CHSE-214 эмбрионов чавычи отмечено снижение активности СОД, КТ с последующей деформацией клеток, их распадом и гибелью [36]. Усиление активности КТ при низком и среднем дозовом уровне на фоне острого воздействия может рассматриваться как адаптационно-приспособительная реакция организма на развитие ОС, что подтверждает токсический эффект наночастиц. Одна из возможных причин снижения активности КТ – гиперпродукция свободных радикалов при ОС и истощение антиоксидантной системы организма [20].

Причинно-следственная связь в развитии подобного эффекта в организме гидробионтов выявлена для наночастиц Cu, Mo, MoO₃, Ni, Ag и SiO₂ и обусловлена механизмом непрямого генотоксического воздействия через образование эндогенных мутагенов, активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов. Генотоксическая активность этих продуктов хорошо известна, как и причины, вызывающие их гиперпродукцию: индукция “прооксидантных” ферментов ксантиноксидазы, НАДФ-Н-оксидазы, альдегидоксидазы, дигидрооротатдегидрогеназы, микросомальных монооксигеназ, повреждение электрон-транспортной цепи митохондрий, ингибирование и истощение ферментативных и неферментативных звеньев антиоксидантной защиты, избыток металлов переменной валентности или недостаток хелаторов металлов, воспаление и некоторые другие [21, 22].

Мнение об опосредованности генотоксичности наночастиц через окислительный стресс имеет прямые подтверждения. Так, в наноформе вещества, особенно металлы, истощают антиоксидантную защиту организма, вызывают увеличение выхода маркеров ОС, в том числе окислительных повреждений ДНК [34, 38].

В эксперименте зафиксировано резкое повышение уровня Ni в теле Danio rerio на седьмые сутки экспозиции при наличии в среде только NiО-НЧ. Данное обстоятельство, возможно, обусловлено хорошей растворимостью NiО, быстрым переходом ионов никеля с поверхности наночастиц в водную среду и поступлением их в организм рыб. Последующее снижение показателей – результат работы системы гомеостатического регулирования микроэлементов, обеспечивающего постоянство уровня металла в организме. Кроме того, существуют данные, что D. rerio способен адаптироваться к действию наночастиц [29, 42].

Кишечная микрофлора рыб играет важную защитную роль в организме [24], участвуя в пищеварении и в метаболическом регулировании процессов в целом [14]. Качественный анализ микробиоценоза рыб имеет большое значение, поскольку доминирование условно-патогенной и патогенной микрофлоры на фоне ослабления защитных сил макроорганизма может привести к началу эпизоотии [37].

Проведенные метагеномные исследования позволили уточнить полученные классическими методами микробиологии данные по составу микробиоценоза желудочно-кишечного тракта рыб. По различным оценкам классические подходы позволяют культивировать от 3% [31] до 4.8% [19] общей бактериальной популяции кишечника рыб, что не позволяет традиционными методами достаточно полно исследовать разнообразие реально существующей в кишечнике микрофлоры [35].

Нормальная микрофлора кишечника рыб представлена преимущественно грамотрицательными бактериями, в то время как преобладание грамположительной микрофлоры в опыте с наночастицами может указывать на замещение автохтонной микрофлоры аллохтонной, чаще всего обнаруживаемой в воде [3]. Данное наблюдение может свидетельствовать о нарушении равновесия в микробиоценозе кишечника рыб и угнетении защитных механизмов, в норме препятствующих колонизации чужеродной микрофлорой.

В эксперименте выявлено появление класса Fusobacteria – грамотрицательной анаэробной палочки, вызывающей тканевый некроз [11]. Требуется более детальное изучение роли этих микроорганизмов, так как, по данным работы [15], она может быть представителем кишечной микрофлоры рыб в норме. В таком же подходе нуждаются представители бактериопланктона класса Verrucomicrobia [25].

В пищеварительном тракте рыб в норме преобладают роды Escherihia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Alcaligines, Eikenella, Bacteroides, Citrobacter freundii, Hafnia alvei и др. [16]. В то же время в эпилимнионе ≤50% видового разнообразия составляют актинобактерии [28], а в гиполимнионе зарегистрирована Verrucomicrobia [26].

Установлено, что внесение наночастиц никеля и оксида никеля влияет на микрофлору кишечника рыб и приводит к замещению собственной микрофлоры транзиторной, в том числе условно-патогенной и патогенной. По-видимому, в стрессовых условиях бактерии слабее закрепляются в кишечнике рыб, что может сопровождаться их элиминацией. Возможно, это происходит из-за сползания слизи, вместе с которой удаляется существующая микрофлора и оставшиеся в кишечном содержимом бактерии (в том числе и патогенные) колонизируют поверхность энтероцитов. Комплексное взаимодействие между хозяином и кишечной микрофлорой позволяет одним штаммам бактерий колонизировать кишечник, в то время как другие перевариваются или вызывают инфекцию. Наночастицы металлов обладают олигодинамическим действием, т.е. даже в малых концентрациях способны оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие. Например, наночастицы никеля в концентрации 1 мг/мл за 30 и 60 мин воздействия вызывали почти полную гибель бактерий [8].

Исследование кишечной микрофлоры рыб актуально, т.к. изменения в микробиоценозе кишечника под воздействием нанoчастиц носят негативный характер, приводя к ослаблению роста, высокой подверженности рыб заболеваниям и повышенной смертности. Стрессы различного происхождения, неизбежные при интенсивном культивировании, еще более усугубляют ситуацию [5].

Выводы. Токсический эффект наночастиц у Danio rerio развивается по пути индукции окислительного стресса и качественной реорганизации микробиоценоза кишечника. Низкая дозовая нагрузка и кратковременный контакт тест-объекта с наноформами никеля приводят к активизации системы антиоксидантной защиты организма в ответ на образование свободных радикалов. Хронические условия и высокие дозы истощают антиоксидантную систему организма на фоне гиперпродукции свободных радикалов при ОС. Установлено изменение качественного состава микроорганизмов, в частности замена Citrobacter и Enterobacter на Bacillus и Acinetobacter (при внесении NiО-НЧ) и на Rhodobacter, Mycobacterium и Methylobacterium (при внесении Ni-НЧ), т.е. замещение нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта транзиторной. Повышение в среде обитания количества никеля в форме наночастиц неизбежно приводит к его кумуляции в теле гидробионтов с выраженностью эффекта при хронических условиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 14-36-00023.