Биология внутренних вод, 2020, № 3, стр. 244-252

ВВЕДЕНИЕ

Городские озера – “экологические барометры здоровья города” (Ravikumar et al., 2013), а бактериопланктонные сообщества – их неотъемлемые компоненты. Загрязняющие вещества, среди которых полициклические ароматические углеводороды, поступающие из выхлопных газов автомобилей, гидрофобные хлорорганические соединения, как хлордан, дильдрин, полихлорированные бифенилы (Long et al., 2003), легко попадают в городские озера по водным стокам и накапливаются в виде донных отложений.

Наиболее дешевый способ биоремедиации – использование УОБ, активно участвующих в естественной биодеградации нефтяных и других углеводородных загрязнений (Brooijmans et al., 2009). В водной среде УОБ утилизируют 0.003–100% углеводородов (Das, Chandran, 2011), что приводит к ускорению очистки водных систем и позволяет обеспечить сбалансированность биотопа. Показано, что в лабораторных условиях микробному сообществу, состоящему из двух изолятов Pseudomonas aeruginosa (Schroeter, 1872; Migula, 1900) и Rodococcus sp. (EU259 892), удалось разложить до 90% углеводородов за 6 нед. в жидкой культуре (Cameotra, Singh, 2008).

Таксономический состав УОБ, обитающих в городских озерах России, в литературе фактически не описан, а видовой таксономический состав культивируемых УОБ, выделенных из московских озер, ранее не исследовали. Более полувека назад сообщалось лишь о том, что в водах оз. Белое обнаружены бактерии, способные окислять метан, гексан и нафталин (Кузнецов, 1952).

Известно, что на долю культивируемых УОБ приходится <1% общего числа бактерий в естественном бактериоценозе. В связи с этим идентификация новых культивируемых природных штаммов УОБ, безусловно, влияющих на состояние всей биоты городского оз. Белое, представляет особый интерес.

Цель работы – охарактеризовать выделенные впервые из городского оз. Белое культивируемые штаммы УОБ, провести филогенетический анализ и определить их таксономическое положение.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика вод оз. Белое. Озеро природного происхождения – наиболее глубокое из трех озер природно-исторического парка. Его глубина 4.2–13.5 м, площадь 0.2 км² (Россолимо, 1925). В 1930-х гг. озеро уже имело статус эвтрофного, а в его донных осадках отмечены процессы анаэробной деструкции органического вещества (Кузнецов, 1970). В 1986 г. оз. Белое вошло в черту г. Москвы.

За период наблюдений температура поверхностного слоя воды в озере варьировала от 0.1–0.5 до 27–30°С. Значения рН колебались от нейтральных 7.22 до слабощелочных 7.99, пики подщелачивания воды ‒ от 9.11 до 8.62. Концентрация ионов аммония изменялась в пределах 0.05–1.73 мг/л, нитратов – 0.22–4.73 мг/л, концентрация нитритов – 0.003–0.12 мг/л, фосфатов – 0.02–0.33 мг/л. Содержание легкоразлагаемого органического вещества, оцененное по параметрам величин перманганатной окисляемости, достигало 4.41–7.13 мг О₂/л.

Таким образом, по содержанию биогенных элементов степень сапробности оз. Белое в разные сезоны года варьировала от ксеносапробной до полисапробной. Постоянное присутствие в воде биогенных элементов выводит их из числа факторов, лимитирующих развитие гетеротрофных бактерий (Акулова и др., 2014).

Отбор проб. Пробы воды из оз. Белое для микробиологического анализа отбирали с глубины ~0.5 м в 5 м от берега, где глубина была ≥1.5 м.

Выделение чистых культур УОБ. Чистые культуры выращивали на 2%-ной агаризованной синтетической среде ММС (Mills et al., 1978) с добавлением летнего дизельного топлива, в состав которого входят 20–30% нафтеновых, 20–30% ароматических и до ≤~40% парафиновых углеводородов. Культуры бактерий хранили на среде ММС в холодильнике при температуре 4–6°С.

Морфологические признаки. Морфологию клеток бактериальных штаммов изучали с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse E 200F 200 и сканирующего электронного микроскопа Camscan S-2 Cambridge (Великобритания). Образцы для микроскопии отбирали через 1, 3, 7, 16 и 30 сут роста культур на минеральной среде ММС и среде Мюллера (Hansen, Møller, 1975).

Ферментативную активность определяли по методике Сэмбрука (Sambrook et al., 1989). Биодеградацию аминокислот и сахаров оценивали по росту штаммов на среде М9 с углеводородами (Sambrook et al., 1989). Жирные кислоты анализировали по методике MIDI (Microbial Identification System) (Sasser, 2001).

Штаммы УОБ идентифицировали по определителю Берги (Bergey et al., 1989), а также с применением молекулярных методов.

Экстракция геномной ДНК. Выделение геномной ДНК из бактерий проводили по методике Кокшаровой и др. (Koksharova et al., 1998), aмплификацию нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК – с помощью ПЦР. Для штамма 2012B использовали праймеры RodF (5′-CAGCAGCTCAACTGCTGGCT-3′) и RodR (5′-CATGCTCCGCCGCTTGTG-3′) (Fredriksson et al., 2013), для штамма 2012C – праймеры Ps-F (5′-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3′) и Ps-R (5′-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3′) (Widmer et al., 1998). Температурно-временной режим для ПЦР: 94°C – 10 мин; 25 циклов (94°C – 45 c, 54°C – 45 c, 68°C – 2 мин); хранение при 4 °C. Продукты ПЦР визуализировали в 1.5%-ном агарозном геле. Амплификацию последовательности гена alkВ проводили с использованием праймеров alk-FI (5′-CATAATAAAGGGCATCACCG-3′) и alk-RI (5′-GATTTCATTCT-CGAAACTCC-3′) (Kohno et al., 2002).

Клонирование и секвенирование ПЦР продуктов. Фрагменты ДНК клонировали с помощью набора CloneJet PCRтм Cloning Kit # K1231 (Fermentas, EC). Секвенирование полученных продуктов ПЦР выполняли на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer с использованием реагентов ABI PRISM ® BigDye™ Terminator v. 3.1 в Центре коллективного пользования “Геном” (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Филогенетическую реконструкцию последовательностей проводили методом ближайшего соседа (Neighbor-Joining) (Saitou, Nei, 1987) с помощью программы Blast Tree View (Fast minimum evolution ‒ tree method). Для первичного сравнительного анализа полученных последовательностей использовали GenBank (NCBI) и BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997). Последовательности проверяли на наличие химер с помощью сервиса Bellerophon (Huber et al., 2004). Индексы бутстрепа (1000 итераций) показаны рядом с ветвями (Felsenstein, 1985). Длины ветвей эквивалентны эволюционным расстояниям, используемым для построения филогенетического дерева. Для построения филогенетических деревьев применяли программу MEGA X (Kumar et al., 2018).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из выделенных культивируемых штаммов для определения таксономического положения выбрано два штамма УОБ, способных к использованию жидких углеводородов в качестве единственного источника углерода и энергии.

Характеристика штамма 2012В. Колонии клеток розового цвета, выпуклые, матовые, с ровным краем, сухие. Клетки грамположительные, аэробные, неподвижные, неспорообразующие (рис. 1).

Рис. 1.

Морфология клеток штамма 2012В (СЭМ).

На среде ММС с дизельным топливом размер клетки 1–2 мкм, на среде Мюллера – 3–5 мкм. Клетки каталазоположительны и кислотоустойчивы. Жирно-кислотный профиль штамма представлен жирными кислотами с длиной углеродной цепи C_14:0–C_19:0. Спектр наиболее представленных жирных кислот включал в себя C_15:0 (54%), C_16:0 (17%), C_17:0 (10%) и 10-метил С_18:0 (3.5%).

Штамм 2012В способен утилизировать сахара и ряд аминокислот: L-инозин, L-арабинозу, L-аспарагин, D-фруктозу, мальтозу, D-маннитол и D-сорбитол. Он не утилизирует лактозу, D-ксилозу, а из фунгицидов – беномил и карбендазим (табл. 1).

Недавно продемонстрировано уникальное свойство штамма 2012В, способного к биодеструкции наноалмазов (Сафронова, Кокшарова, 2018). Попадание наноматериалов в почву и воду приводит к негативным последствиям. В этой связи данный штамм может рассматриваться как потенциальный деструктор и этих углеродсодержащих материалов.

ПЦР и филогенетический анализ штамма 2012В. В результате ПЦР получен ДНК фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность (1479 пн) гена 16S рРНК малой субъединицы бактериальной рибосомы.

Филогенетический анализ позволил установить, что последовательность гена 16S рРНК попадает в отдельный кластер, сформированный бактериями Rhodococcus spр. и поддерживается тремя референтными штаммами – R. qingshengii sp. dj1-6^T (NR_043535.1), R. jialingiae sp. dj1-6-2^T (NR_115 708.1) и R. erythropolis sp. DSM 43 066^T (X79 289) с гомологией >99.9% и со штаммом R. qingshengii BLH-Y4 (KF704113) со степенью сходства (99.93%) (рис. 2). Все последовательности гена 16S рРНК, входящие в кластер с последовательностью штамма Rhodococcus sp. 2012B, принадлежат к представителям одной монофилетической группы.

Рис. 2.

Эволюционные отношения штамма Rhodococcus sp. 2012B (KP779 654.1) c представителями рода Rhodococcus по фрагменту гена 16S рРНК (1286 пн). Эволюционные расстояния рассчитаны методом, описанным в работе Wang et al. (2010), и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Изменение скорости замены оснований в исследованной последовательности моделировали с помощью гамма-распределения (параметр формы = 0.44). В качестве аутгруппы использовали вид Corynebacterium maris.

Также видовую идентификацию проводили с помощью сравнения морфологических и физиолого-биохимических признаков с референтными штаммами – R. qingshengii dj1-6^T, R. jialingiae dj1-6-2^T и R. erythropolis DSM 43066^T (Wang et al., 2010; Xu et al., 2007) (табл. 1).

Для уточнения результатов филогенетического анализа, проведенного с использованием рибосомального гена, в качестве дополнительного гена-маркера использовали белок-кодирующую последовательность alkB гена. Продукт этого гена – алканмонооксигеназа, обеспечивающая окисление n-алканов с длиной углеводородной цепи C₆–C₁₇ и катализирующая реакцию деградации углеводородов (Чернявская и др., 2012; van Beilen, Funhoff, 2007).

С помощью ПЦР для штамма 2012В получена нуклеотидная последовательность длиной 333 пн, соответствующая фрагменту гена alkB, которая позволила построить филогенетическое дерево (рис. 3). Видно, что ближайший родственник штамма Rhodococcus sp. 2012В – штамм R. qingshengii BLH-Y4 (KF696707) (идентичность 97.3%), выделенный из почвы Цинхай-Тибетского плато (Хu et al., 2007). Таким образом, уровень сходства последовательностей гена 16SрРНК и alkB показал, что по молекулярным таксономическим критериям (Stackebrandt, 2011) штамм 2012В можно отнести к виду Rhodococcus qingshengii sp. nov. (Xu et al., 2007).

Рис. 3.

Эволюционные отношения штамма Rhodococcus sp. 2012B (KR422 620.1) с представителями рода Rhodococcus по фрагменту гена аlkB (272 пн). Эволюционные расстояния рассчитаны с использованием трехпараметрического метода (van Beilen, Funhoff, 2007) и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Изменение скорости замены оснований в исследованной последовательности моделировали с помощью гамма-распределения (параметр формы = = 0.41). В качестве аутгруппы использовали штамм NJ49 рода Shewanella.

Характеристика штамма 2012С. Клетки грамотрицательные, аэробные, одиночные палочки (рис. 4). На среде ММС с дизельным топливом образуют выпуклые блестящие колонии бежевого цвета с ровным краем, размер клеток 2–3 мкм. На среде Мюллера клетки крупнее (3–5 мкм). Клетки флюоресцируют в проходящем свете. Бактерии давали положительный ответ на каталазу и отрицательный – на кислотоустойчивость.

Рис. 4.

Морфология клеток штамма 2012С (СЭМ).

Состав жирных кислот характеризуется преобладанием длинноцепочечных насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот с длиной углеродной цепи C_14:0–C_19:0, где наиболее представлено жирным кислотами C_15:0 (45%), C_16:0 (32%) и C_17:0 (9%).

Штамм 2012С способен утилизировать сахара и аминокислоты (L-аспарагин, L-инозин, D-мальтоза, D-сорбитол, L-арабиноза и D-арабитол); не утилизирует лактозу и фунгициды беномил и карбендозим.

ПЦР и филогенетический анализ штамма 2012С. В результате ПЦР получен фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность (936 пн) гена малой субъединицы бактериальной рибосомы 16S рРНК.

Установлено, что нуклеотидная последовательность гена 16SрРНК наиболее сходна с таковыми различных представителей сем. Pseudomonadaceae и позволяет отнести штамм 2012С к роду Pseudomonas (Proteobacteria, Pseudomonadaceae) (рис. 5). Филогенетический анализ показал, что штамм 2012С сформировал таксономически однородный кластер, в котором представлены штаммы рода Pseudomonas с гомологией 99.57%, при этом в кластере объединились бактерии из разных экосистем и разных географических зон. Так, P. mendocina (KF318 795) выделен из ризосферной почвы в Индии, P. psychrotolerans (MG778 875) – из бразильского цветка пассифлоры. P. oryzihabitans (MG571 765.1) из загрязненной почвы в Саудовской Аравии обладает способностью деградировать углеводороды.

Рис. 5.

Эволюционные отношения штамма Pseudomonas sp. 2012C (MG966 152) с представителями рода Pseudomonas по фрагменту гена 16S рРНК (917 пн). Эволюционные расстояния рассчитаны с использованием двух параметрического метода Кимуры (Long et al., 2003) и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Изменение скорости замены оснований в исследованной последовательности моделировали с помощью гамма-распределения (параметр формы = 0.44).

Культивирование штамма 2012С проводили на твердой синтетической среде ММС, содержащей в качестве единственного источника углерода летнее дизельное топливо, что свидетельствует о способности штамма 2012С деградировать алифатические углеводороды. С помощью ПЦР при использовании специфических праймеров (Kohno et al., 2002) получена нуклеотидная последовательность длиной ~220 пн, соответствующая фрагменту гена alkB. Полученные результаты дают возможность предположить, что в геноме Pseudomonas sp. 2012С присутствуют гены, кодирующие ферменты, отвечающие за окисление алканов с “короткой” углеродной цепью. Таким образом, филогенетический анализ позволил определить штамм Pseudomonas sp. 2012С как наиболее близкий к видам P. psychrotolerans и P. oryzihabitans.

Выводы. Из пресного водоема, находящегося в черте г. Москвы, выделены и охарактеризованы культивируемые углеводородокисляющие штаммы. Видовое таксономическое положение штамма Rhodococcus 2012В определено как Rh. qingshengii, штамм и Pseudomonas sp. 2012С наиболее сходны с видами P. psychrotolerans и P. oryzihabitans. Новые штаммы могут стать основой для создания биопрепаратов, стимулирующих процессы естественного очищения среды от нефтяных углеводородов, в том числе, от наиболее устойчивых полициклических ароматических соединений.