Ботанический журнал, 2020, T. 105, № 4, стр. 348-359

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор материала проводился в период 2007–2018 гг. в Красноярской лесостепи, в горах Западного и Восточного Саяна (рис. 1). Объектом исследования явились 10 ценопопуляций A. jenisseensis. На первом этапе исследования изучали фитоценотическую приуроченность ветреницы. В исследуемом районе описано свыше 50 местообитаний вида. Геоботанические описания проведены по общепринятым методикам (Voronov, 1973). При изучении состояния ценопопуляций ветреницы енисейской определяли проективное покрытие, плотность, оценивали изменчивость вегетативных и генеративных признаков, семенную продуктивность, изучали генетическую вариабельность на основе ISSR-PCR анализа. Характеристика местообитаний вида приведена в табл. 1.

Рис. 1.

Расположение ценопопуляций Anemone jenisseensis (нумерация в соответствии с табл. 1).

Fig. 1. Map of the location of Anemone jenisseensis coenopopulations (the numbers correespond to Table 1).

Измерения параметров вегетативных органов и показателей семенной продуктивности ветреницы для оценки фенотипической изменчивости проводили на 30 генеративных побегах. Большая часть оцениваемых нами морфометрических признаков приводится в качестве диагностических для определения видов во “Флоре СССР” (Yuzepchuk, 1937), “Флоре Средней Сибири” (Popov, 1957), “Флоре Сибири” (Timokhina, 1993). Кроме метрических, использовался и ряд аллометрических параметров, оценивающих соотношение в развитии разных частей растений. Показатели семенной продуктивности определяли по методике Г.П. Дюрягиной и М.М. Ивановой (Dyuryagina, Ivanova, 1985). У побегов ветреницы енисейской измерялись следующие параметры: длина стебля (×1), длина цветоноса (×2), длина черешка (×3), длина (×4) и ширина (×5) центрального сегмента листа, соотношение длины и ширины листа (×6), соотношение длины стебля и длины листа (×7), глубина выреза на центральном сегменте (×8), соотношение длины выреза и длины листа (×9), количество зубчиков (×10), длина (×11) и ширина (×12) бокового сегмента листа, количество зубчиков на боковом сегменте (×13), длина выреза на боковом сегменте (×14), соотношение длины выреза и длины листа (×15), длина (×16) и ширина (×17) лепестков, количество цветков (×18), реальная (с1) и потенциальная (с2) семенные продуктивности; коэффициент семенификации (с3).

При математической обработке данных рассчитывали пределы варьирования признака (min-max), среднее арифметическое (X) и его ошибку (m_x), среднее квадратичное отклонение (σ), коэффициент вариации (Cv). Характер распределения значений признаков ветреницы енисейской оценивали с помощью коэффициентов асимметрии и эксцесса. Выявлено, что для изучаемых нами параметров характерно распределение, близкое к нормальному. Внутрипопуляционную изменчивость признаков оценивали с помощью коэффициента вариации (Cv), поскольку данный параметр позволяет сравнивать признаки, имеющие различные размерности (Schmidt, 1984), кроме того, для коэффициента вариации С.А. Мамаевым (Mamaev, 1972) разработана шкала уровней изменчивости. Для установления достоверных различий между среднепопуляционными значениями одноименных признаков A. jenisseensis использовался однофакторный дисперсионный анализ. Различие считалось достоверным при уровне значимости p < 0.05. Анализ сходства ценопопуляций по исследуемым признакам проводили с помощью кластерного анализа. В обработке применялся метод Уорда (Ward, 1963). В качестве меры сходства использовали Евклидово расстояние.

Генетическую вариабельность ценопопуляций вида изучали с помощью ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat) метода, выявляющего полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК. Из каждой популяции было проанализировано 10 растений, не являющихся клонами. Геномную ДНК выделяли из 10 мг материала, высушенного в силикагеле, с использованием  набора DiamondDNA (ООО “АБТ”, Россия). Для ПЦР использовали смесь БиоМастерHS‑Taq ПЦР-Color 2x(ООО “Биолабмикс”, г. Новосибирск).

ISSR-PCR проводили в 20 мкл смеси (6 мкл Н₂О; 10 мкл смеси БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color 2x, 2 мкл ДНК; 2 мкл 10 мМ праймера) на амплификаторе C1000 Thermal Cycler BioRad с использованием реактивов производства OOO “БиолабМикс” (г. Новосибирск) и ЗАО “Евроген” (г. Москва). Амплификацию проводили по следующей программе: 95°С – 5 мин; 13 циклов: 95°С – 20 сек, 55°С – 45 сек с последующим понижением температуры на 0.7°С в каждом цикле, 72°С – 90 сек; 25 циклов: 95°С – 20 сек, 44°С – 30 сек, 72°С – 90 сек; завершающая стадия: 72°С – 10 мин, охлаждение при 4°С. Предварительно на 2 образцах ДНК из имеющегося набора праймеров (Mansour et al., 2009; Paterson et al., 2009) опытным путем были выявлены те, которые дают воспроизводимый полиморфный результат. Анализ продуктов амплификации осуществляли в проходящем ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документирования и анализа изображений Bio-Rad Gel Doc XR (Bio-Rad, USA).

Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня дивергенции между изучаемыми популяциями полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие ISSR-ПЦР фрагментов одинакового размера рассматривалось как состояние 1 или 0 соответственно. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты. Обработку результатов анализа проводили с помощью пакета программ TFPGA version 1.3 (Miller, 1997) (UPGMA-анализ, бутстреп-тест и расчет генетических дистанций Рейнольда) и Popgene version 1.32 (процент полиморфных локусов (P), генетическое разнообразие Нея (I), информационный индекс Шеннона (h), генетические дистанции Нея (D), показатель подразделенности популяций (G_st)).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При оценке фитоценотической приуроченности выявлено, что ветреница енисейская в Восточном, Западном Саяне и в окр. г. Красноярска распространена в березовых, осиновых, сосновых и смешанных лесах, а также в поймах рек и на вырубках. Проективное покрытие A. jenisseensis в растительных сообществах варьирует от 1 до 10%. Максимальное значение данный показатель имеет в западносаянском сосняке орляково-разнотравном (Aj1, 10%). Также относительно высокие показатели численности ветреницы были зафиксированы в березово-сосновом лесу хвощово-разнотравном (Aj3, 5%, Западный Саян). На вырубке сосняка со следами пожара (Aj4*) отмечено резкое снижение проективного покрытия особей вида до 1%. В растительных сообществах вид выполняет роль ассектатора.

Среднее количество побегов ветреницы енисейской на 1 м² варьирует от 15 до 31 шт. Максимальная плотность A. jenisseensis зафиксирована для ЦП, произрастающей в окр. г. Красноярска (Аj9) – 30.7 ± 5.7 шт./м². В осиново-березовом лесу (Аj8) отмечено 24.2 ± 5.8 побегов на 1 м². Минимальное число побегов было выявлено на вырубке под ЛЭП (Aj10*, 14.6 ± 4.1 шт./м²) и в березово-сосновом лесу орляково-разнотравно-злаковом в окр. с. Ермаковского, Западный Саян (Aj2, 15 ± 2.5 шт./м²).

В результате изучения внутрипопуляционной изменчивости установлено, что большинство вегетативных признаков вида характеризуются средним и высоким уровнями изменчивости, согласно шкале С.А. Мамаева (Mamaev, 1972). Наименее изменчивыми признаками для побегов ветреницы являются длина стебля, длина цветоноса, длина черешка, длина центрального и бокового сегментов листа, форма центрального сегмента листа (рис. 2). Высокой степенью варьирования характеризуются степень и характер рассеченности центрального и боковых сегментов листа – от почти цельных до раздельных (рис. 3). Причем растения с разными типами расчленения листьев могут встречаться в пределах одной ценопопуляции. Три западносаянские ЦП (Aj1, Aj4* и Aj6) характеризуются глубоко расчлененными боковыми сегментами листьев.

Рис. 2.

Внутрипопуляционная изменчивость морфологических признаков Anemone jenisseensis: ×2 – длина цветоноса, ×4 – длина центрального сегмента листа, ×6 – форма центрального сегмента листа, ×9 – степень расчленения центрального сегмента, ×15 – степень расчленения бокового сегмента.

Fig. 2. Intrapopulation variability of morphological characters of Anemone jenisseensis: ×2 – peduncle length, ×4 – central leaf segment length, ×6 – central leaf segment shape, ×9 – degree of incision of the central leaf segment, ×15 – degree of incision of the lateral leaf segment.

Рис. 3.

Особи ветреницы енисейской с разной степенью расчленения листовых пластинок (фото Н.В. Степанова).

Fig. 3. Plants of Anemone jenisseensis with different degree of leaf blade incision (photo by N.V. Stepanov).

Наибольшими размерами осевых органов (х1-х3) характеризуются особи, произрастающие в сосновых сообществах Западного Саяна (табл. 2): в сосняке орляково-разнотравном (Aj1), березово-сосновом лесу орляково-разнотравно-злаковом (Aj2) и березово-сосновом лесу хвощово-разнотравном (Aj3). Например, длина стебля у особей ЦП Aj2 составляет 23.38 см, а длина цветоноса – 5.49 см. Максимальные размеры листьев зафиксированы для западносаянских ЦП Aj3 и Aj5, а также для Aj9, находящейся в окр. г. Красноярска. Минимальные показатели всех вегетативных признаков характерны для растений ветреницы енисейской, произрастающих на вырубке под ЛЭП (Aj10*) (табл. 2).

Высокие показатели реальной семенной продуктивности A. jenisseensis отмечены для ЦП Aj5 (пойменный ивняк широкотравно-страусниковый, Западный Саян), где количество завязавшихся плодов составляет 27.4 шт., а коэффициент семенификации равен 74.6% (табл. 3). Для ЦП Aj10*, произрастающей на вырубке под ЛЭП, сравнительно низкие значения морфологических параметров сочетаются с относительно высокими показателями семенной продуктивности, численности и средним уровнем внутрипопуляционной изменчивости, что свидетельствует о длительно действующих однотипных стрессовых условиях (табл. 2, 3, рис. 2). Минимальные показатели семенной продуктивности (18.9 плодов на генеративный побег), отмечены для ЦП Aj6 (березово-сосновый лес папоротниково-широкотравный, Западный Саян).

На дендрограмме сходства, построенной с помощью кластерного анализа, наблюдается разделение совокупности ЦП на 2 кластера (рис. 4). В первый кластер объединились подтаежные западносаянские ЦП Aj7 и Aj2, а также примкнувшая к ним Aj10*, произрастающая на вырубке под ЛЭП. Для особей данных ЦП отмечаются небольшие размеры листьев и слабое расчленение боковых сегментов. Второй кластер формируют два подкластера. Первый объединяет красноярские ЦП Aj8 и Aj9 с относительно крупным центральным сегментом листа. Боковой сегмент средних размеров, слабо расчленен. Второй подкластер образуют западносаянские ЦП, особи которых характеризуются крупными размерами вегетативных органов. Внутри данного подкластера наблюдается разделение на две группы по размерам и степени расчленения бокового сегмента листа. Для особей группы ЦП Aj1, Aj4* и Aj6 отмечаются крупные и глубоко расчлененные боковые сегменты.

Рис. 4.

Дендрограмма сходства ценопопуляций Anemone jenisseensis по морфологическим признакам. Ось Y – Евклидово расстояние; ось X – ценопопуляции.

Fig. 4. Dendrogram of similarity of Anemone jenisseensis coenopopulations by morphological characters. Y-axis – Euclidean distance; X-axis – coenopopulations.

Генетический полиморфизм ветреницы енисейской изучен на примере ЦП, произрастающих в лесах Западного Саяна (Aj1, Aj3, Aj5-Aj7), Восточного Саяна (Aj8) и Красноярской лесостепи (Aj9). В ходе анализа выявлено 111 фрагментов ДНК. Суммарный процент полиморфизма составляет 100. Число амплифицированных фрагментов ДНК, в зависимости от праймера (табл. 4), варьировало от 13 (HB8) до 24 (НВ12).

Уровень выявляемого внутрипопуляционного генетического разнообразия средний (55.86–71.17%). Показатели генетического полиморфизма максимальны в западносаянской ЦП Aj3 (P = = 71.17%; I = 0.275; h = 0.404) и красноярской Aj9 (P = 70.27%; I = 0.249; h = 0.373). Средними показателями генетического разнообразия характеризуются западносаянские ЦП Aj1 (P = 63.93%; I = 0.209; h = 0.32) и Aj5 (P = 63.06%; I = 0.204; h = 0.313). Минимальные значения отмечены для Aj7 (P = 55.86%; I = 0.189, h = 0.287).

Коэффициент подразделенности ЦП (G_st) составляет 0.3316. Следовательно, на долю межпопуляционного разнообразия приходится 33.16%, а изученные ЦП ветреницы демонстрируют очень высокую степень дифференциации (Wright, 1978). Генетические дистанции М. Нея (Nei, 1972) минимальны между западносаянскими Aj7 и Aj3 (D = 0.0892). Максимальные расстояния зафиксированы между ЦП Aj6 и Aj7 (D = = 0.2788) (табл. 5).

На UPGMA-дендрограмме сходства ЦП с высокой степенью достоверности выделяются два кластера (рис. 5). Первый кластер делится на два подкластера. В первый входят подтаежные западносаянские ЦП Aj3 и Aj7, во второй – красноярские Aj8 и Aj9 и западносаянская Aj5. Второй кластер образуют популяции Aj1 и Aj6, произрастающие в сосняках Западного Саяна и характеризующиеся крупными рассеченными боковыми долями листа. Данные ЦП отличались от других и по морфологическим признакам (рис. 4).

Рис. 5.

Дендрограмма сходства ценопопуляций Anemone jenisseensis на основе данных ISSR-PCR анализа (цифрами указаны значения бутстрепа в %).

Fig. 5. Dendrogram of similarity of Anemone jenisseensis coenopopulations based on ISSR-PCR analysis data (the numbers indicate bootstrap values, %).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ состояния ЦП ветреницы енисейской показал, что изучаемый вид обладает относительно широким фитоценотическим ареалом и может встречаться в мелколиственных (березовые, осиновые леса), светлохвойных (сосняки), смешанных лесах, в пойменных ивняках, а также на вырубках.

Максимальные размеры вегетативных органов, показатели семенной продуктивности, генетического разнообразия зафиксированы для ЦП A. jenisseensis, произрастающих в лесах Западного Саяна (Aj3, Aj5) и Красноярской лесостепи (Aj9). На вырубке под ЛЭП (Aj10*) низкие значения морфологических параметров сочетаются с относительно высокими показателями семенной продуктивности, численности и средним уровнем изменчивости, что свидетельствует о длительно действующих стрессовых условиях.

ЦП A. jenisseensis демонстрируют очень высокую степень генетической дифференциации (G_st = 0.3316). Важным диагностическим признаком, позволяющим разделить ЦП ветреницы енисейской, является степень расчленения сегментов листа. ЦП Aj1 и Aj6, характеризующиеся крупными расчлененными боковыми долями листа, формируют морфологически и генетически обособленную группу. Четкого разделения ценопопуляций по географическому принципу не выявлено.