Ботанический журнал, 2021, T. 106, № 4, стр. 353-362

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Материалами для исследования послужили естественные популяции и искусственные лесонасаждения P. sylvestris в пределах Волгоградской области, Республики Тыва и Республики Хакасия.

Волгоградская область. Сбор семенного материала проводился в 2019 г. в искусственных насаждениях P. sylvestris, созданных в 1960–70-х гг. на территории Калачевского и Суровикинского районов. К настоящему времени эти лесные массивы достигли предельного для условий степной зоны возраста – 50–60 лет. Их естественное старение и сокращение площади усугубляются недостаточностью ухода и воздействием ряда негативных факторов, связанных с нарастающей засушливостью климата и ухудшением лесопожарной обстановки. Климатические условия исследованных районов отличаются континентальностью, сухим жарким летом, дефицитом осадков, периодическими сильными юго-восточными ветрами. Почвенный покров со светло-каштановыми почвами в комплексе с солонцами имеет низкие показатели содержания гумуса, активной влаги и общей пористости (Latkina, Latkin, 2018; Semenyutina, Noyanova, 2019).

Было сформировано 4 выборки семян (каждая – с 30 деревьев), собранных в окрестностях г. Калач-на-Дону в “зеленом кольце” вокруг города (48°42'17" с.ш. 43°30'33" в.д.), х. Рюмино-Красноярский в 2 км от ландшафтного памятника природы “Голубинский песчаный массив” (48°48'03" с.ш. 43°35'43" в.д.), пос. Пятиморск (48°39'25" с.ш. 43°36'32" в.д.) и г. Суровикино (48°37'53" с.ш. 42°52'45" в.д.) вдоль федеральной автотрассы А-260. В последних двух точках семенной материал собирался с деревьев, растущих в глубине лесных массивов, в 100–200 м от проезжей части.

Исследованные насаждения представляют собой сухие боры (состав – 10С, класс бонитета – III, возраст деревьев – 40–50 лет, высота – 17–21 м, диаметр – 18–22 см). Деревья характеризуются многовершинностью, их семенная продуктивность очень низкая (выход жизнеспособных семян на одну шишку составляет 0.1–3.2 шт.).

Республика Тыва. Сбор семян проводился в 2019 г. на территории Тандинского района в естественных популяциях в Балгазынском бору в зоне Государственного природного заказника “Балгазынский” (51°02'43" с.ш. 95°07'20" в.д.). Климат района полузасушливый резко-континентальный, характеризующийся недостатком влаги, низкими зимними температурами воздуха и почв, глубоко промерзающих зимой. Балгазынский бор расположен на древних эоловых песках возвышенности Саргалык-тайга и занимает периферийные участки песчаного массива на границе с полынно-дерновинно-злаковой степью (Sosna…, 1988; Milyutin et al., 2013). Была сформирована одна общепопуляционная выборка семян (с 40 деревьев) в сосновых насаждениях, представляющих собой остепненный разнотравно-злаковый тип леса, характеризующихся разновозрастностью и низко опущенными кронами деревьев. Состав насаждений – 10С, классы бонитета – III–V. Возраст деревьев – 50–170 лет, высота – 18–22 м, диаметр – 26–44 см.

Республика Хакасия. Сбор семян проводился в 2013 г. в естественных популяциях и искусственных насаждениях P. sylvestris на территории Ширинского (“Ширинская степь”) и Бейского (“Койбальская степь”) районов. Климат исследованных районов резко континентальный, засушливый, с большими температурными контрастами, жарким летом и продолжительной малоснежной зимой. “Койбальская” и “Ширинская” степи представляют собой сухие территории с южными черноземами, местами темно-каштановыми почвами с солонцами и солончаками, в предгорьях и низкогорьях распространены каменистые почвы с неразвитым профилем (Rastitel’nyy…, 1976).

В “Ширинской степи” нами исследованы два местонахождения P. sylvestris. 1. “Карыш” – в естественной популяции на склоне горного обрамления долины р. Карыш (54°24'33" с.ш. 89°59'11'' в.д.), тип леса – сосняк низкотравно-мшистый пятнисто-мертвопокровный V класса бонитета, средние возраст, высота и диаметр деревьев соответственно – 109 лет, 15.0 м и 21.2 см. 2. “Шира” – в искусственном насаждении на прибрежных склонах вокруг озера Шира (54°30'53" с.ш. 90°08'35" в.д.), тип леса – сосняк вейниково-полынно-разнотравный IV класса бонитета, средние возраст, высота и диаметр деревьев соответственно – 52 года, 10.8 м и 21.9 см. В “Койбальской степи” изучено искусственное насаждение P. sylvestris, расположенное в зоне охраняемой территории регионального значения “Смирновский бор” (53°22'08" с.ш. 91°22'20" в.д.), тип леса – сосняк зеленомошно-разнотравно-кустарниковый мозаично-остепненный III класса бонитета, средние возраст, высота и диаметр деревьев соответственно – 68 лет, 17.6 м и 28.8 см. Популяция P. sylvestris “Карыш”, произрастающая в каменистной степи, представляет собой петрофитное редкостойное разновозрастное насаждение с преобладанием световых форм деревьев с низкой кроной. Насаждения P. sylvestris в “Ширинской” и “Койбальской” степях заложены в 50–60-е гг. XX в. (в “Ширинской степи” они сильно пострадали от пожаров). Были сформированы популяционные выборки семян внутривидовых форм (каждая – с 30–40 деревьев), выделенных по окраске микростробилов: краснопыльниковая (f. erythrantera Sanio) и желтопыльниковая (f. sulfurantera Kozubow) в происхождениях “Карыш” и “Шира” и окраске семенной кожуры: коричневосемянная (f. phaeo-sperma Kurdiani) и черносемянная (f. melanosperma Kurdiani) в происхождении “Смирновский бор”.

Семена проращивали в год их сбора в чашках Петри, проростки обрабатывали 1% р-ром колхицина в течение 4–6 часов, после промывания производили их фиксацию спиртово-уксусной смесью (3:1), хранили в холодильнике при постоянной температуре от +3 до +5°. Для исследования использовали меристематические ткани кончиков корешков проросших семян. Материал окрашивали 1% р-ром железоацетогематоксилина. Для просмотра использовали “давленые” препараты, приготовленные стандартным способом. Подсчет числа хромосом и анализ хромосомных перестроек производили на стадии метафазы митоза. Препараты просматривали под микроскопом Axiostar plus (Carl Zeiss) с применением системы формирования изображений AxioVision (окуляр ×10, объектив ×90).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявлено, что в диплоидном хромосомном наборе P. sylvestris, произрастающей в исследованных насаждениях, содержится 24 хромосомы (2n = 2x = 24). В семенном потомстве деревьев обнаружена миксоплоидия, при которой в клетках проростков, наряду с диплоидными, содержатся триплоидные (2n = 3x = 36) и тетраплоидные (2n = 4x = 48) клетки (рис. 1). Наиболее часто наблюдаются хромосомные расы, содержащие тетраплоидные клетки (2n = 24, 48), менее часто – триплоидные (2n = 24, 36), а также одновременно тетраплоидные и триплоидные (2n = 24, 36, 48). При этом уровень полиплоидизации диплоидных тканей проростков семян существенно варьирует (табл. 1).

Рис. 1.

Метафазные пластинки с различным числом хромосом в происхождениях P. sylvestris: a) 2n = 24 (“Балгазынский бор”), b) 2n = 24, 36 (“Балгазынский бор”), c) 2n = 24, 36 (“Пятиморск”), d) 2n = 36 (“Смирновский бор”, f. phaeosperma), e) 2n = 24, 48 (“Карыш”, f. erythranthera), f) 2n = 48 (“Калач-на-Дону”), g) 2n = 48 (“Пятиморск”), h) 2n = 48 (“Рюмино-Красноярский”), i) 2n = 48 (“Смирновский бор”, f. phaeosperma). Масштабная линейка – 10 µm.

Fig. 1. Metaphase plates with different chromosome numbers in provenances of P. sylvestris: a) 2n = 24 (“Balgazynskiy Bor”), b) 2n = 24, 36 (“Balgazynskiy Bor”), c) 2n = 24, 36 (“Pyatimorsk”), d) 2n = 36 (“Smirnovskiy Bor”, f. phaeosperma), e) 2n = = 24, 48 (“Karysh”, f. erythranthera), f) 2n = 48 (“Kalach-na-Donu”), g) 2n = 48 (“Pyatimorsk”), h) 2n = 48 (“Ryumino-Krasnoyarsk”), i) 2n = 48 (“Smirnovskiy Bor”, f. phaeosperma). Scale bar – 10 µm.

Встречаемость миксоплоидных проростков в семенном потомстве деревьев различна. Минимальное их количество выявлено в популяциях “Смирновский бор” и “Суровикино”, максимальное – в насаждениях “Карыш” и “Рюмино-Красноярский” (табл. 1). Насаждения сосны в происхождениях “Карыш” и “Рюмино-Красноярский” являются территориально и репродуктивно изолированными от смежных сосновых массивов и произрастают в жестких лесорастительных условиях, первое – на сухой каменистой почве, второе – в аридных условиях окрестностей Голубинских песков, представляющих собой фрагмент пустыни в сухой степи. Тот факт, что практически все проростки в насаждениях “Карыш” и “Рюмино-Красноярский” являются миксоплоидами, может свидетельствовать о влиянии экстремальных условий произрастания деревьев на повышение гетерогенности клеточных линий, что, вероятно, способствует лучшей выживаемости семенного потомства. Для происхождений “Рюмино-Красноярский” и особенно “Карыш” характерным является разнообразие морфологических типов деревьев и наличие особей, несущих “ведьмины метлы”, что также может обусловливать высокую частоту встречаемости миксоплоидии у таких растений.

Доля миксоплоидов в проростках семян внутривидовых форм деревьев также варьирует. В локалитете “Смирновский бор” у f. phaeosperma она значительно выше, чем у f. melanosperma, а у f. erythrantera и f. sulfurantera в происхождениях “Карыш” и “Шира” имеет близкие значения. При этом сохраняется сходный баланс уровня полиплоидизации корневых меристем как между экземплярами f. phaeosperma и f. melanosperma, так и между f. erythrantera и f. sulfurantera (табл. 1). Вероятно, в засушливых степных условиях в насаждениях P. sylvestris отдельные формы деревьев являются более адаптированными и имеют преимущество, определяемое, в том числе, количеством полиплоидных клеток в соматических тканях проростков семян.

По данным предыдущих лет, доля миксоплоидов среди проростков семян из насаждений в Волгоградской области не превышала 4.8% (Sedel’nikova, 2003). В степных борах Южной Сибири встречаемость миксоплоидов в семенном потомстве деревьев составляла 3.0–25.0%, возрастая у особей с аномалиями развития и в годы с сухой и жаркой погодой (Sosna…, 1988; Mashkina et al., 2012). Сопоставление полученных нами результатов с опубликованными ранее данными показывает, что в сосновых насаждениях Волгоградской области, Тывы и Хакасии количество миксоплоидов в семенном потомстве деревьев существенно выше. Очевидно, что миксоплоидия как общий феномен характерна для южных степных насаждений сосны обыкновенной.

Одновременное присутствие клеток разного уровня плоидности в тканях обусловливается соматической редукцией хромосом, их неразъединением, элиминацией, удвоением и другими причинами. Миксоплоидия рассматривается некоторыми авторами в качестве фактора, обеспечивающего устойчивость растений, в том числе древесных, к экстремальным условиям среды. Предполагается, что сочетание клеток разной плоидности усиливает пластичность растения в целом, обеспечивает генетическое и фенотипическое разнообразие потомства. У таких растений возникают формы хромосомного полиморфизма, связанного с повышенной геномной нестабильностью. Полиплоидные и миксоплоидные формы растений чаще встречаются в неблагоприятных эдафических условиях, высокогорьях, пустынях, арктической зоне и прибрежной Антарктике (Butorina, 1989; Kunakh, 2011; Navrotska et al., 2014).

Показано, что миксоплоиды преобладают в группе устойчивых форм вяза приземистого (Ulmus pumila L.), отобранных в массово усыхающих в условиях острого дефицита влаги насаждениях в Астраханской области и Калмыкии. Значительная доля миксоплоидов выявлена среди высоко смолопродуктивных форм деревьев сосны обыкновенной, отличающихся устойчивостью к вредителям и болезням (Butorina, 1989). Явления миксоплоидии и анеуплоидии наблюдаются в популяциях большинства видов хвойных, в том числе P. sylvestris, в условиях экологического экстремума. При этом прослеживается связь степени экстремальности условий произрастания с уровнем изменчивости хромосомных чисел в семенном потомстве деревьев (Sedel’nikova, 2016).

В корневых меристемах проростков семян в большинстве исследованных происхождений P. sylvestris обнаружены структурные перестройки хромосом (табл. 2). Количество проростков и число метафазных клеток с хромосомными мутациями минимально в популяции “Смирновский бор”, максимально – в популяции “Карыш”, где высокая встречаемость и широкий спектр хромосомных мутаций в семенном потомстве деревьев, вероятно, может объясняться эффектом инбридинга вследствие высокого уровня самоопыления, свойственного изолированным популяциям. Самоопыление выявлено практически у всех деревьев в изолированных борах Южной Сибири (Sosna…, 1988). В метонахождениях “Балгазынский бор” и “Рюмино-Красноярский” хромосомных перестроек в проростках не зафиксировано, что в последнем случае может быть связано с малым количеством семян, вовлеченных в исследование вследствие их крайне низкого качества. Установлено также, что частота возникновения хромосомных перестроек в семенном потомстве внутривидовых форм деревьев неодинакова (табл. 2). Если встречаемость мутаций в проростках f. erythrantera по сравнению с f. sulfurantera (“Карыш”) характеризуется близкими значениями, то в местонахождении “Шира” – различными. В обоих случаях частота встречаемости хромосомных перестроек в корневых меристемах f. erythrantera и f. sulfurantera также существенно различается. Встречаемость мутаций в проростках f. phaeosperma и f. melanosperma в популяции “Смирновский бор” имеет сходные значения.

Необходимо отметить, что встречаемость хромосомных перестроек в проростках семян P. sylvestris, расположенных в непосредственной близости от автотрассы, не повышается по сравнению с другими изученными местонахождениями. Вероятно, выхлопные газы автотранспорта не оказывают влияния на уровень мутабильности клеток семенного потомства P. sylvestris, поскольку рассеиваются в атмосфере вследствие постоянных сильных ветров, “продувающих” сосновые насаждения в данных районах. Исследование уровня цитогенетических нарушений у древесных растений, в том числе P. sylvestris, произрастающих в условиях антропогенного загрязнения, включающего фоновые выбросы автотранспорта, показало, что его существенное увеличение происходит лишь при высоких концентрациях поллютантов (Butorina, Kalaev, 2000; Butorina et al., 2000; Goryachkina, Sizykh, 2012).

Во всех проростках семян, содержащих клетки с хромосомными перестройками, наиболее часто выявляются кольцевые хромосомы, ацентрические кольца, а также кольцевые хромосомы, “надетые” на палочковидные хромосомы (рис. 2). В проростках из местонахождений “Суровикино”, “Шира” и “Карыш” обнаружены полицентрические хромосомы, имеющие несколько центромер – дицентрические и трицентрические. Некоторые полицентрические хромосомы имеют сдвиг центромеры, диагностирующий перицентрическую инверсию. В проростках популяции “Карыш” найдена терминальная ассоциация “конец в конец” двух хромосом с перицентрической инверсией. Хроматиновые фрагменты обнаружены в проростках из насаждений “Калач-на-Дону”, “Пятиморск” и “Карыш”. В популяциях “Шира” и, особенно, “Карыш” в корневых меристемах проростков выявлены множественные хромосомные нарушения, включающие одновременно несколько типов хромосомных перестроек, которые наблюдаются в одной клетке.

Рис. 2.

Метафазные пластинки или части метафазных пластинок с хромосомными перестройками в происхождениях P. sylvestris: a) кольцевая хромосома (“Шира”, f. sulfuranthera), b-c) кольцевые хромосомы, “надетые” на палочковидные хромосомы (“Шира”, f. erythranthera – b), “Калач-на-Дону” – c)), d) ацентрическое кольцо (“Карыш”, f. erythranthera), e) кольцевая хромосома и хроматиновый фрагмент (“Карыш”, f. sulfuranthera), f) дицентрическая хромосома с перицентрической инверсией и ацентрическое кольцо (“Карыш”, f. erythranthera), g) множественные мутации одной хромосомы: хромосома с укороченным плечом, разошедшиеся хроматиды и хроматиновый фрагмент (“Пятиморск”), h) терминальная ассоциация “конец в конец” двух хромосом с перицентрической инверсией и ацентрическое кольцо (“Карыш”, f. erythranthera), i) дицентрическая хромосома и хроматиновый фрагмент (“Шира”, f. sulfuranthera). Масштабная линейка – 10 µm. Хромосомные перестройки указаны стрелками.

Fig. 2. Metaphase plates or parts of metaphase plates with chromosomal rearrangements in the provenances of P. sylvestris: a) ring chromosome (“Shira”, f. sulfuranthera), b–c) ring chromosomes “clipped” on the rod ones (“Shira”, f. erythranthera – b, “Kalach-na-Donu” – c), d) acentric ring (“Karysh”, f. erythranthera), e) ring chromosome and chromatin fragment (“Karysh”, f. sulfuranthera), f) dicentric chromosome with pericentric inversion and acentric ring (“Karysh”, f. erythranthera), g) multiple mutations of one chromosome: the chromosome with a shortened arm, diverging chromatids and chromatin fragment (“Pyatimorsk”), h) terminal association “end-to-end” of two chromosomes with pericentric inversion and acentric ring (“Karysh”, f. erythranthera), i) dicentric chromosome and chromatin fragment (“Shira”, f. sulfuranthera). Scale bar – 10 µm. Chromosomal rearrangements are indicated by arrows.

Кольцевые хромосомы, имеющие центромеру, образуются в результате делеций теломерных участков и последующего соединения плеч хромосомы в кольцо. При этом формируются дистальные ацентрические фрагменты. Полицентрические хромосомы появляются в результате транслокаций, представляющих собой обмен участками между гомологичными и негомологичными хромосомами. Перицентрическая инверсия является поворотом участка хромосомы на 180° с захватом центромеры, с точками разрыва в разных плечах. Ассоциация “конец в конец” образуется при концевом соединении хромосом вследствие стремления к конъюгации терминальных гетерохроматиновых участков (Koryakov, Zhimulyov, 2009; Kartel’ et al., 2011).

Ранее у сосны обыкновенной из засушливых местопроизрастаний Нижнего Поволжья и Южной Сибири выявлялись аналогичные хромосомные нарушения, а также другие патологии митоза. При этом доля клеток с хромосомными перестройками в проростках семян, собранных в насаждениях в Волгоградской области, составляла 6.9%, Хакасии и Тывы – 2.0–7.7%, увеличиваясь до 10.3% у карликовых и полукарликовых деревьев и в годы с длительной засухой (Sedel’nikova, 2003; Sosna…, 1988; Mashkina et al., 2012). Сравнивая полученные нами результаты с опубликованными данными, можно заключить, что в исследованных насаждениях P. sylvestris уровень мутабильности клеток и разнообразие типов хромосомных перестроек в семенном потомстве деревьев достаточно высоки. Установлено, что экстремальные факторы среды, провоцирующие геномную нестабильность, приводят к усилению мутационных процессов в популяциях хвойных растений (Sedel´nikova, 2016). Возможно, что высокий уровень и широкий спектр хромосомных перестроек в семенном потомстве деревьев в степных насаждениях P. sylvestris связаны с фактором влияния засушливых условий произрастания.

ВЫВОДЫ

1. В естественных популяциях и искусственных насаждениях сосны обыкновенной, произрастающих на юге ареала в степной зоне Нижнего Поволжья (Волгоградская область) и Южной Сибири (Республика Тыва, Республика Хакасия), выявлен хромосомный полиморфизм, выражающийся в наличии изменчивости числа хромосом – миксоплоидии, а также хромосомных перестроек в семенном потомстве деревьев.

2. Миксоплоидия (2n = 24, 36; 2n = 24, 48; 2n = = 24, 36, 48) обнаружена в семенном потомстве деревьев из всех исследованных степных популяций P. sylvestris. Установлено, что уровень распространения миксоплоидии возрастает по мере усиления засушливости и ухудшения эдафических условий произрастания деревьев. Максимальный уровень встречаемости миксоплоидии отмечается в проростках семян из изолированных местонахождений P. sylvestris – каменистой степи Хакасии и участка пустыни в сухой степи в Волгоградской области. Встречаемость миксоплоидных проростков семян варьирует у семенного потомства внутривидовых форм деревьев.

3. Хромосомные перестройки обнаружены в семенном потомстве деревьев из Волгоградской области и Хакасии. Встречаемость хромосомных перестроек различается в проростках семян внутривидовых форм деревьев. Существенное увеличение уровня встречаемости хромосомных мутаций и расширение их спектра наблюдаются в проростках семян в изолированном местообитании P. sylvestris в каменистой степи Хакасии.

4. Выявленная цитологическая нестабильность семенного потомства деревьев в насаждениях P. sylvestris, произрастающих в засушливых условиях, вероятно, свидетельствует об активизации микроэволюционных процессов, что очевидно, сопровождается естественным отбором устойчивых генотипов и форм, адаптированных к засушливым лесорастительным условиям.