Ботанический журнал, 2021, T. 106, № 6, стр. 567-575

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились в течение ряда лет (1992–2004, 2010 и 2019 гг.) в разнотравных и крупнотравных группах типов леса в среднегорье Восточного Саяна (территория национального парка “Столбы”, 480–520 м над ур. м.), средне- и высокогорье Западного Саяна (хр. Арадан, 800 м над ур. м., хр. Ойский, 1420 м над ур. м.). Климат района исследований – резко континентальный (среднегодовая температура +0.5°С, среднегодовое количество осадков – 485 мм/год) (Spravochnik…, 1967, 1969). Погодно-климатические условия в период исследований оказались благоприятными для развития – положительные среднесуточные температуры воздуха, количество осадков в период развития пыльцы – 0–39.1 мм. Сумма эффективных температур рассчитывалась для среднегорья Восточного Саяна по данным ближайшей метеостанции – “Столбы” (600 м над ур. м.), для высокогорных экосистем Западного Саяна – метеостанции “Оленья речка” (1400 м над ур. м.).

В период заложения и развития генеративных почек (третья декада июня – первая декада октября, первая декада мая – первая декада июня) с верхней части крон здоровых средневозрастных (100–130 лет) деревьев периодически (два-три раза в неделю) проводился сбор женских почек и мегастробилов. Образцы фиксировались по Навашину, либо в смеси Карнуа (3 : 1) (Pausheva, 1980). Материал промывался при фиксировании по Навашину в проточной воде, по Карнуа – в 70% растворе этилового спирта, затем проводилось его обезвоживание в серии спиртов до 80%. Далее готовились постоянные препараты по общепринятым методикам (Prozina, 1960; Pausheva, 1980). Образцы пропитывались парафином, через промежуточную жидкость (ксилол), и заливались в “парафиновые пряники”, из которых готовились парафиновые блоки. Резка блоков проводилась на ротационных микротомах Mikrom (Германия) и М-2 (Россия). Срезы наклеивались на предметные стекла, высушивались, депарафинировались серией спиртово-ксилольных смесей и окрашивались. Окрашивание проводилось красителями синим (RS) и красным (2RS) (Ivanov, 1982), гематоксилином по Гейденгайну (Jensen, 1962), генцианвиолетом с подкраской эозином (Pausheva, 1980). Окрашенные срезы обезвоживались через серию спиртово-ксилольных растворов, заключались в канадский бальзам и высушивались. Материал просматривался на микроскопе Микромед-2 (Россия) с видеокамерой и выходом на монитор. Математическая обработка проводилась по общепринятым методикам с использованием пакета Microsoft Еxcel-2013.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование женских почек. Локализация и сроки заложения примордиев мегастробилов у хвойных различны даже в пределах одного семейства (Kozubov, 1974). У пихты сибирской женские почки закладываются в верхней части кроны на побегах текущего года по окончании их роста. Их заложение происходит субэпидермально в виде бугорка меристематической ткани (рис. 1а, b). Этот процесс осуществляется в конце июня-начале июля, при этом сроки несколько варьируют в зависимости от условий произрастания (табл. 1). Примордии мегастробилов у пихты сибирской закладываются исключительно на верхней стороне побега. Как правило, закладывается две почки – одна у основания побега, вторая – ближе к апексу. На первых этапах развития женские почки морфологически не отличаются от вегетативных почек. Крайне редко, при наличии благоприятных условий (хр. Арадан, 2019 г.) может закладываться и большее количество почек (рис. 1b). Кроме того, наблюдалась полимеризация, когда из одной почки, формировались два мегастробила (рис. 1d, e).

Рис. 1.

Женский генеративный побег пихты сибирской: а–b – женские почки на верхней стороне побега (стрелки, хвоя на побегах удалена), 1–5.07.2019; c – женская почка в период зимнего покоя (октябрь-март); d–е – две шишки, развившиеся из одной почки (e) и следы от них (d), 10.09.2019.

Fig. 1. Abies sibirica female generative shoot: a–b – seed-cone buds on the upper side of the shoot (arrows, needles removed), July 1–7, 2019; c – seed-cone bud during winter rest (from October till March); d–е – two seed-cones (e) and their traces (d) developed from one buds, September 10, 2019.

В начале июля (отмечено 01–05 июля в 1993, 1995, 1997, 2010 и 2019 гг.) женские почки, как правило, уже четко различимы на верхней стороне побега. В этот период почка представляет собой бугорок меристематической ткани размерами от 51.05 × 53.8 до 68.4 × 94.1 мкм, с развитой апикальной зоной, в субэпидермальных слоях которой идут деления клеток (рис. 2a). В апикальной зоне почки клетки более мелкие, интенсивно окрашиваются.

Рис. 2.

Развитие женских генеративных почек и семязачатка: а–b – апекс почки, 5.07.2019; c – мегастробил осенью первого года развития 27.08–1.10.95; d–h – весеннее развитие мегастробила: d – семенная чешуя в пазухе кроющей, вид сбоку, в основании семенной чешуи формируется семязачаток, в котором находится мегаспороцит на стадии лептотены, 12.05.95; e – апикальная часть семязачатка, в центре нуцеллуса виден мегаспороцит, стрелками показан интегумент, 12.05.04; f, h – то же на стадии пахитены (f), 17.05.95 и тетрады мегаспор (h), 25.05.95; g – верхняя часть семязачатка в период завершения опыления, сформирована “подушка” нуцеллуса, 02.06.95. Масштабная линейка: ab, d – 50 мкм, с – 100 мкм, e–f, h – 20 мкм, g – 70 мкм.

Fig. 2. Development of seed-cone generative buds and ovules: аb – seed-cone apex as they appear in June 1–5, 2019; c – seed-cone bud collected at late August (27th) – early October (1st), 1995; dh – seed-cone development at spring: d – ovuliferous scale in the bract axil. Side view. Ovule at the base of ovuliferous scale, megasporocyte at leptotene stage, May 12, 1995; e – ovule apex – megasporocyte at the center of nucellus, integument is shown by arrows, May 12, 2004; f, h – the same at pachytene stage (f), May 17, 1995 and megaspore tetrads stage (h), May 25, 1995; g – ovule top at the end of pollination period, nucellar depression is formed, June 2, 1995. Scale bars, µm: ab, d – 50, с – 100, ef, h – 20, g – 70.

Развитие мегастробилов. Примордии мегастробилов быстро растут – в первой-второй декадах июля на флангах апекса начинается дифференциация: отчленяются спирально расположенные бугорки – зачатки кроющих чешуй (брактей) (рис. 2b). В конце второй-начале третьей декады июля (18–23.07.2019) размер почек увеличивается более чем в два раза (до 96–124 × 112–125 мкм). В первой декаде августа в разрезе мегастробила насчитывается 7–8 кроющих чешуй, в основании которых выделяется зона (26 × 51 мкм, V = 4.5–9.8%) с активно делящимися клетками – формируется зачаток семенной чешуи. В конце первой декады августа мегастробилы достигают размеров 2.14 × 2.04 мм, при этом кроющие чешуи составляют около 0.37 × 0.35 мм. Однако, размеры значительно варьируют (коэффициент вариации – 31.3–52.1%). Аналогичная динамика развития наблюдается и в высокогорных экосистемах (Западный Саян, 1400 м над ур. м.) – в начале августа (4.08.2010 г.) мегастробилы достигают размеров 0.35 × 0.44 мм, в разрезе насчитывается 6–10 кроющих чешуй размерами около 0.50 × × 0.70 мкм. В течение всего августа идут активные деления и к концу третьей декады (28.08.1995 г.) мегастробилы увеличиваются до 7.50–8.72 мм, кроющие чешуи достигают размеров 2.1 × 0.45–0.55 мм (рис. 2с), в одном мегастробиле их насчитывается до 150 шт. (в разрезе – 20–25). Зачаток семенной чешуи – массивный, его размеры составляют 0.64 × 0.51 мм, отдельные клетки его внешнего слоя дают интенсивное ярко-голубое окрашивание (на белки). На этой стадии мегастробилы уходят в зимний покой. Внешне они выглядят засмоленной почкой диаметром 0.6–0.9 см (рис. 1с).

Развитие возобновляется в апреле (первая-вторая декады), когда уже при минимуме тепла (t_≥5°С = 0.9°С) и в семенной, и в кроющей чешуях наблюдаются активные деления клеток. Клетки эпидермального слоя делятся периклинально, а субэпидермального слоя и внутренних тканей семенной чешуи антиклинально и периклинально. Активные деления продолжаются до конца мая, при этом семенные чешуи значительно увеличиваются. В начале апреля на адаксиальной стороне семенных чешуй закладывается два семязачатка. В начале второй декады апреля (12.04.1995 и 1998 гг.), когда семенная чешуя превышает 1/3  высоты кроющей (рис. 2d), диаметр семязачатков в основании конуса нарастания составляет 252–300 мкм, в апикальной части – 131–206 мкм, высота – 324–346 мкм. В этот период клетки на халазальном полюсе семязачатка более плоские, плотные, тогда как на микропилярном – крупные, рыхлые, с крупными ядрами, в них идут активные деления. В центральной части семязачатка клетки также крупные и окрашиваются менее интенсивно. Клетки субэпидермального слоя нуцеллуса семязачатка делятся периклинально, формируя наружу париетальный слой, а внутрь – спорогенные клетки. В  конце первой декады мая (7–9.05.1995 г.) в семязачатке идентифицируются 1-слойный наружный эпидермис, ниже которого сформированы 4–8 слоев клеток париетальной ткани, в центре – мегаспороцит с довольно толстой клеточной стенкой и крупным ядром, в котором просматриваются 2–3 ядрышка (рис. 2е, f). Клетки внутреннего слоя париетальной тка-ни  – довольно крупные, угловатые, интенсивно окрашенные, 2–3-ядерные. У голосеменных (Singh, 1978) несколько клеток могут функционировать как материнские клетки мегаспор, но  у пихты сибирской четко выделяется одна клетка.

Мегаспорогенез. В конце первой–начале второй декад апреля (08–12.04.1995 и 2003 гг.) в мегаспорангиях видны археспориальные клетки. Мегаспороцит, окруженный концентрическими слоями клеток, четко идентифицировался лишь в конце первой – начале второй декад мая. Вo второй-третьей декадах мая (сумма t_≥5°С = 40–43.5°С, 2004 и 1995 гг.) мегаспороцит делится с образованием линейной тетрады мегаспор. На стадии профазы первого деления (пахитена) в ядре еще видны крупные ядрышки, цитокинез после первого деления не наблюдался. В середине третьей декады мая (25.05.1995 г.) у трех нижних клеток тетрады начинают закладываться клеточные перегородки по симультантному типу, верхняя мегаспора к этому времени уже дегенерировала (рис. 2h). Каждая мегаспора в тетраде представляет типичную гаплоидную клетку (n = 24). Функциональная халазальная мегаспора формирует мегагаметофит, остальные – быстро дегенерируют, возможно, обеспечивая ее питание. В конце мая (25.05.1995 г.) в отдельных семязачатках у микропилярного полюса еще видны дегенерирующие мегаспоры. Мейоз проходит до опыления, профаза первого деления начинается в период полного смыкания чешуй на стадии “закрытая шишка”.

Мейотические деления завершаются в течение 7–10 дней и идут асинхронно в разных семязачатках. В один срок (25.05.1995 г.) в мегастробилах одного дерева наблюдались и мегаспороциты на различных стадиях мейоза и вакуолизированная функциональная мегаспора. В разных семязачатках одного мегастробила можно наблюдать и стадии профазы (лептотена – пахитена) и метафазы второго деления (17.05.1995 г.). Динамика мегаспорогенеза определяется температурой воздуха. Как правило, мегаспороцит идентифицируется уже в начале мая при минимальной сумме эффективных температур t_≥5°С = 16.2–18.7°С (Восточный Саян, 1995 и 2003–2004 гг.). При этом в разновысотных популяциях среднегорья (520 и 640–720 м над ур. м.) темпы развития практически совпадают. В то же время, при затяжной и холодной весне (1998 и 2004 гг.), развитие шло медленнее, и мегаспороцит сформировался только во второй декаде мая (t_≥5°С = 24.9°С).

Клетки нуцеллуса, непосредственно прилегающие к мегаспороциту, становятся плоскими, лизируют и на стадии тетрад некоторые из них еще дают окрашивание. Следующие слои клеток – крупнее, с интенсивно окрашивающимися ядрами, некоторые клетки – 2-ядерные. Молодая функциональная мегаспора крупная, сферическая, с большим ядром в центре и достаточно толстой клеточной стенкой, быстро вакуолизируется. Вокруг мегаспоры идентифицирутся 2–5 слоев радиально расположенных клеток с плотной цитоплазмой и крупными ядрами. Клетки, непосредственно прилегающие к мегаспоре, плоские, некоторые – слабоокрашенные, в процессе развития они разрушаются, содержимое их, очевидно, используется на питание мегаспоры и развивающегося женского гаметофита. В период мегаспорогенеза в клетках нуцеллуса наблюдаются митозы.

Формирование интегумента. В период зимнего покоя мегастробилы пихты покрыты несколькими слоями покровных чешуй (рис. 1с). Дифференциация примордия семязачатка на нуцеллус и интегумент происходит осенью, но начинает интегумент оформляться во второй декаде апреля, когда размер достигает 312 × 314 мкм. К концу мейоза он обрастает нуцеллус со всех сторон, но на верхушке семязачатка не срастается. В период начала мейотических делений (вторая декада мая) интегумент может достигать половины высоты либо верхнего края нуцеллуса, а к моменту формирования функциональной мегаспоры он немного превышает верх нуцеллуса.

Клетки апикальной части нуцеллуса лизируют и формируют углубление (так называемую “подушку” для пыльцевых зерен) (рис. 2g). Развитый интегумент 3-слойный, дифференцирован на наружный эпидермис, с довольно крупными толстостенными клетками, интегументальную паренхиму, клетки которой несколько вытянуты радиально, и внутренний эпидермис с толстостенными удлиненными клетками, дающими интенсивное окрашивание на углеводы.

Знания о структурных особенностях элементов женских почек в процессе формирования обеспечивают понимание их функциональной роли в процессах половой репродукции. Развитие женских генеративных структур у пихты сибирской соответствует модели, характерной для многих хвойных видов (Kozubov, 1974; Tretyakova, 1990; Moshkovitch, 1992; Singh, 1978 и др.). Мегаспорогенез начинается на неделю-две позже микроспорогенеза (Bazhina et al., 2007) при большей сумме эффективных температур. Развитие проходит приблизительно в те же сроки, что и у пихты Салаира (Nekrasova, Ryabinkov, 1978), однако динамика определяется температурными условиями (табл. 1). В горных экосистемах Саян и хр. Хамар-Дабан (среднегорье и высокогорье), так же, как и в пихтачах Салаирского кряжа, женские почки у пихты визуально идентифицируются уже в начале июля, при этом сроки незначительно варьируют в зависимости от погодных условий года развития и высоты местности. Ранее было показано, что на южной границе равнинной части ареала пихты в низкогорных экосистемах (Кемеровская обл.) примордии мегастробилов в 1968 г. идентифицировались только 15 июля (Nekrasova, 1970), однако, автор не указывает сумму температур. Рассчитанная по методике Н.П. Поликарпова с соавторами (Polikarpov et al., 1986) по данным ближайшей метеостанции (Колпашево), сумма эффективных температур для 1968 г. на эту дату составила 190°С. Таким образом, сумма температур (t ≥ 5°C) на период заложения женских генеративных почек в горных экосистемах Саян и на южной границе ареала в Западной Сибири практически совпадают. Полагаем, что инициация женских генеративных почек проходит при сумме эффективных температур t_≥5°С около 200°С. На первых этапах развития женские почки визуально не отличаются от мужских и вегетативных. Однако, настоящие исследования показали, что, как и у видов Picea (Atlas…, 1980), для них характерно наличие развитой апикальной меристемы, которая отсутствует у почек иного типа.

Развитие мегастробилов у пихты сибирской проходит аналогично другим видам Abies – примордии семенных чешуй закладываются до периода зимнего покоя, а мейоз осуществляется весной (Singh, Owens, 1981, 1982, Owens, Molder, 1985). Показано (Singh, 1978), что у голосеменных в нуцеллусе одна или несколько гиподермальных археспориальных клеток делятся периклинально, формируя внутрь первичные спорогенные клетки и наружный первичный париетальный слой, который позже образует массивную париетальную ткань сверху первичной спорогенной ткани. Мегаспорангий у пихты крассинуцелятный (массивный).

Сроки формирования мегаспороцита у видов сем. Pinaceae различаются. Так, у Pinus laricio Poir. (syn. Pinus nigra Arn.) он обнаруживается за две недели до пыления (Chamberlain, 1935), у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и кедра сибирского (Pinus sibirica Do Tour) – после опыления (Sarvas, 1962; Kozubov, 1974; Tretyakova, 1990). У пихты сибирской, как и у других представителей Abies, мегаспороцит формируется до опыления (в низкогорье Восточного Саяна – первая декада мая, сумма t_≥5°С = 16.2–24.9) и во второй-третьей декадах мая (за неделю-две до опыления) – претерпевает мейоз. Таким образом, мейоз при мегаспорогенезе наблюдается на неделю-две позже, чем при микроспорогенезе (Bazhina et al., 2007). Он происходит при большей сумме эффективных температур, что снижает вероятность повреждения клеток поздневесенними заморозками; деления, как и при микроспорогенезе проходят асинхронно. Асинхронность развития объясняется отсутствием у голосеменных плазмодесм и цитоплазматических мостиков между микроспороцитами, которые характерны для покрытосеменных растений (Moitra, Bhatnagar, 1982). Наблюдаемые различия в темпах развития семязачатков квалифицируются как норма. Асинхронность наблюдается у различных видов сем. Pinaceae. Она может быть вызвана различиями в температурных условиях либо в питании развивающихся спор (Kozubov, 1974; Tretyakova, 1990; Moshkovitch, 1992). Возможно, значительная асинхронность развития генеративных органов у пихты является одним из механизмов устойчивости, определяющим надежность существования вида в резких градиентах среды (горные биоценозы).

Развитие мегаспор у пихты сибирской проходит достаточно динамично. В частности, показано, что у A. grandis Lindl. мегаспороцит может находиться на стадии пахитены около 3 недель, что, возможно, справедливо и для других видов рода (Singh, Owens, 1982). Однако у пихты сибирской в первой-второй декадах апреля идентифицировать мегаспороциты еще не представляется возможным. Они выделялись только в первой декаде мая и уже в середине третьей декады мая завершали мейоз. Аналогичные сроки развития для Кемеровской обл. указывает Т.П. Некрасова (Nekrasova, 1970), при этом автор отмечает, что расположение ядер тетраэдрическое, однако иллюстраций она не приводит. Настоящие исследования показали линейное расположение ядер в тетраде у пихты сибирской, как и у других представителей Abies (Owens, Molder, 1985).

Клеточные стенки при мегаспорогенезе у пихты сибирской закладываются по симультантному типу. Согласно Р. Martens (1966), наличие каллозы между спорами – реликтовый механизм. У некоторых других видов хвойных после первого деления образуется диада, а после второго – триада мегаспор (Khromova, 1986; Trenin, 1988; Tretyakova, 1990). Для Abies lasiocarpa (Hook.) Nutt. и A. amabilis (Dougl.) Forbes показано также, что две средние клетки не разделены клеточными стенками (формируется триада) (Singh, Owens, 1981, 1982). У пихты сибирской на стадии формирования тетрад оболочки четко идентифицируются у трех нижних клеток. Как и у большинства хвойных, функциональной мегаспорой является халазальная, остальные быстро дегенерируют, вероятно, обеспечивая до некоторой степени ее дополнительное питание. Протопласт молодых мегаспор содержит маленькие вакуоли, крахмалсодержащие пластиды, митохондрии и диктиосомы, значительную часть у микропилярного полюса клетки занимает эндоплазматический ретикулум. Во время роста функциональной мегаспоры специальная мембрана связывает ее с дегенерирующими клетками тетрады (Singh, 1978). Показано, что функциональная мегаспора, расположенная на халазальном конце, получает в наследство весь материнский митохондрион, а остальные, лишенные митохондрий, деградируют (Trenin, 1988).

Вокруг молодой мегаспоры четко выделяются несколько (4–5) слоев крупных угловатых рыхло расположенных клеток с большими межклетниками. Образование вокруг мегаспор губчатой ткани, состоящей из 2–5 слоев, с радиально расположенными клетками с плотной цитоплазмой и крупными ядрами характерно для представителей сем. Pinaceae (Moshkovitch, 1992). Прохождение мегаспорогенеза коррелирует с инициацией и формированием интегумента. Места инициации интегумента на примордии семязачатка голосеменных сильно различаются (Allen, 1963; Owens, Molder, 1974; Stanlake, Owens, 1974). У пихты сибирской, как и у видов Pseudotsuga и Tsuga, интегумент инициируется около верхушки примордия семязачатка, когда будущий нуцеллус уже содержит мегаспороцит.

Определить температурные условия развития мегаспор достаточно сложно, так как развитие спорогенной ткани у пихты проходит асинхронно. Динамика различается в разные годы. Так, в один срок (25.05.1995 г.) даже в одном мегастробиле наблюдались и тетрады мегаспор, и ранние функциональные, и уже вакуолизированные мегаспоры. Вероятно, поэтому не удалось зафиксировать период покоя после мегаспорогенеза, хотя известно, что у голосеменных функциональная мегаспора после формирования впадает в кратковременный покой, необходимый для подготовки дальнейшего развития и, только затем вакуолизируется и делится. Показано (Singh, 1978), что в этот период активизировавшиеся диктиосомы продуцируют множество пузырьков аппарата Гольджи, эндоплазматический ретикулум меняет первоначальную ориентацию и у вакуолей формируются радиальные шероховатые стенки, не связанные с мембраной. Очевидно, у пихты сибирской период покоя короткий и наступает неравномерно.

ВЫВОДЫ

1. Формирование женских эмбриональных структур у пихты происходит аналогично большинству видов хвойных умеренной зоны с однолетним циклом генеративного развития. Генеративные почки образуются в конце июня – начале июля, в год, предшествующий опылению, при этом в первый год развитие идет до формирования примордия семенной чешуи.

2. Мегаспорогенез и развитие гаметофита проходит весной следующего года и начинается на неделю-две недели позже микроспорогенеза при большей сумме эффективных температур. Тетрада мегаспор линейная, клеточные перегородки закладываются по симультантному типу.

3. Темпы развития определяются температурой воздуха, при этом сроки варьируют по годам в соответствии с локальными условиями произрастания. Процессы развития в мегастробиле проходят асинхронно, мейоз завершается до периода опыления.