Физиология человека, 2019, T. 45, № 3, стр. 99-106

МЕТОДИКА

Материалами исследования служили образцы сыворотки крови 52 спортсменов хоккеистов в возрасте от 18 до 24 лет со спортивной квалификацией от I-го разряда до мастера спорта. Участники эксперимента характеризовались отсутствием действующей спортивной дисквалификации, а также каждый из них дал письменное информированное согласие на участие в исследовании и прошел медицинское освидетельствование. Контрольную группу (n = 50) составили регулярно тренирующиеся спортсмены – мужчины-добровольцы одинакового возраста с обследуемыми хоккеистами, из фитнес-учреждения “Спорт Форум”. Забор образцов сыворотки крови для исследования проводили в соответствии с учебно-тренировочным процессом (УТП), запланированным тренером, до спортивной нагрузки и после ее окончания.

Для проведения иммунохимических исследований применяли следующие материалы и методы. Конъюгаты овечьих антител против иммуноглобулинов человека, меченых пероксидазой хрена, тетраметилбензидин, перекись водорода 30%, твин-20 “Sigma” (США). Иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли на полистирольных планшетах фирмы “Nunc” (Дания). Учет результатов ИФА осуществляли на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы “Thermo” (Финляндия) при длине волны 450 нм.

Твердофазный метод ИФА определения антител к серотонину, гистамину, дофамину, орфанину, β-эндорфину, ангиотензину, глутамату, γ-аминомасляной кислоте в сыворотке крови человека, включает в себя следующие этапы: иммобилизацию комплекса синтетического антигена, состоящего из коньюгата-гаптена производного β-эндорфина, орфанина, серотонина, дофамина, гистамина, ангиотензина, глутамата и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) с полимерным носителем на полистирольном планшете. Связывание указанного выше антигена со специфическими антителами анализируемого образца. Выявление образовавшегося иммунного комплекса с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Измерение ферментативной активности в образовавшемся иммунном комплексе. Результаты измерения в ИФА оптической плотности (ОП) выражают в условных единицах (KOD₄₅₀) и рассчитывают по формуле KOD₄₅₀ = = ОП анал. обр. – ОП контр. обр/ОП контр. обр. Для проведения иммунохимических исследований применяли “Набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови “АДИМУСТАТ®” (ФСР 2010/08813).

Синтез конъюгированных антигенов и условия проведения анализа выполняли в соответствии с разработанной нами ранее схемой [8].

Определение показателей формулы периферической крови и биохимические исследования проводили по унифицированным методам, принятым для обследования спортсменов [9]. Были проанализированы следующие показатели: биохимические (β-cross laps (нг/мл), тестостерон, витамин D (нмоль/л), железо (мкмоль/л), креатинфосфокиназа (КФК, ЕД/л), креатинин (мкмоль/л), глюкоза (ммоль/л)), гематологические (гемоглобин (г/л), гематокрит (об. %), лимфоциты (%)).

Применяли ступенчато-возрастающее нагрузочное тестирование на велоэргометре Sheller. Ступени рассчитываются с учетом массы тела спортсмена на первой ступени 1 Вт на кг с последующей нарастающей нагрузкой по 50 Вт до пульса 170 уд./мин.

Результаты исследований оценивали с использованием средней арифметической величины (М), их стандартного отклонения (s). Анализ различий показателей до и после нагрузки проводили при помощи парного критерия Стьюдента. Достоверность различий показателей у спортсменов и лицами из контрольной группы проводили, используя критерий Стьюдента. Связь между параметрами оценивали с помощью уравнения регрессии, силу связи и направление определяли вычислением коэффициента корреляции (r) по Пирсону. Зависимость между несколькими переменными величинами описывали уравнением множественной регрессии (коэффициент корреляции R). Для анализа данных использовали пакеты программ Биостат и Статистика 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В обследованной группе спортсменов-хоккеистов методом ИФА выявлены достоверные различия в уровне е-Ат к серотонину дофамину, орфанину, ГАМК и глутамату в состоянии покоя и после физической нагрузки. Средний уровень антител в группе с учетом стандартного отклонения и уровня значимости (p), представлены в табл. 1. При сравнении полученных данных ИФА для образцов хоккеистов с контрольной группой лиц, занимающихся физкультурой, числовые значения указанных выше антител также имели достоверные отличия.

Установлена достоверная связь изменения уровня антител к ЭБ после нагрузки c содержанием антител до тренировки. Коэффициенты корреляции составили от 0.72 до 0.88 при p < 0.05. Для антител серотонину r = 0.88, дофамину r = 0.82, орфанину r = 0.78, ГАМК r = 0.80, глутамату r = 0.72.

Проведенная статистическая обработка полученных данных позволила выявить некоторые закономерности содержания антител в индивидуальных сыворотках спортсменов-хоккеистов, отличающихся интенсивностью физической нагрузки. Пациентов можно условно подразделить на три категории в зависимости от характера изменения уровня антител к исследуемому антигену. Это группы с пониженным, повышенным и соответствующим норме содержанием антител. В табл. 2 представлено в процентах количество лиц из обследованной группы хоккеистов, у которых по результатам ИФА показатели е-Ат к исследуемым ЭБ достоверно отличаются на два стандартных отклонения от среднего значения контрольной группы (М ± 2σ).

Результаты анализа показали, что уровень антител к исследуемым антигенам у спортсменов достоверно отличается от нормы, установленной в группе контроля. Необходимо отметить, что наибольшее количество пациентов имеют отклонения в содержании е-Ат для ГАМК как в покое, так и при нагрузке. При нагрузке возрастает количество спортсменов, имеющих повышенный уровень е-Ат к глутамату.

В группе хоккеистов проведено стандартное биохимическое и гематологическое исследование образцов сыворотки крови. В результате выявлены спортсмены, имеющие отклонения показателей от нормы (рис. 1) [10].

Проведен анализ зависимости значения указанных на рис. 2 биохимических показателей, имеющих отклонения от нормы, с показателями е-Ат к диагностически значимым ЭБ (табл. 1). Достоверная взаимосвязь изменения содержания е-Ат к серотонину, глутамату и ГАМК после физической нагрузки обнаружена для ряда биохимических показателей. Так, установлена зависимость концентрацией КФК, глюкозы и железа до физической нагрузки с указанными выше диагностически значимыми е-Ат. Для зависимости между уровнем е-Ат к ГАМК и концентрацией глюкозы коэффициент корреляции составил r = 0.38 при p = 0.047, взаимосвязь уровня е-Ат к серотонину и концентрацией железа характеризовалась данными r = –0.45, p = 0.015. У лиц с повышенным содержанием КФК коэффициент корреляции для уровня е-Ат к глутамату составил r = 0.50, p = 0.048. Важным биохимическим показателем в оценке функционального состояния спортсмена является тестостерон. При анализе данных обследования хоккеистов выявлена прямая связь уровня тестостерона до тренировки и содержания естественных антител после физической нагрузки. В этом случае коэффициент корреляции для концентрации тестостерона и уровня антител к серотонину составил (r = 0.47, p = = 0.009), дофамину (r = 0.48, p = 0.016), глутамату (r = 0.45, p = 0.01).

При многофакторном анализе выявлена связь уровня антител к дофамину после нагрузки с содержанием антител к дофамину до тренировки и гематокрита (коэффициент корреляции R = 0.87, p < 0.001), а также гемоглобина (коэффициент корреляции R = 0.89, p < 0.001). На рис. 2 (А, Б) представлены графики регрессии.

Уравнение регрессии (рис. 2, А) имеет вид:

где Z – уровень антител к дофамину после нагрузки, Y – уровень антител к дофамину до нагрузки, X – значения гематокрита, уровни значимости для коэффициентов: a (p = 0.019), b (p = 0.0000), c (p = 0.006).

Уравнение регрессии (рис. 2, Б) имеет вид:

где Z – уровень антител к дофамину после нагрузки, Y – уровень антител к дофамину до нагрузки, X – значения гемоглобина, уровни значимости для коэффициентов: a (p = 0.023), b (p = 0.0000), c (p = 0.008).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Поддержание гомеостаза сопровождается активизацией и мобилизацией функциональных ресурсов организма, включением цепочки явлений, основанной на общих нейроиммунобиологических механизмах. Уровень эффективности деятельности человека в экстремальных условиях, сопряженных с физическими нагрузками, связан с его адаптационными возможностями, которые характеризуются состоянием целого ряда регуляторных систем. В первую очередь к ним относятся опиоидная, серотонинергическая и ГАМК-ергическая. Биохимическую функцию указанные системы реализуют с помощью ЭБ, активно взаимодействующих с иммунной системой через рецепторы на иммунокомпетентных клетках. В результате каскада реакций происходит специфическое изменение показателей гуморальных факторов иммунитета – е-Ат, отражающих состояние регуляторных систем. При спортивных тренировках важным является способность организма адаптироваться к нагрузкам. Анализ результатов определения е-Ат к перечисленным выше антигенам показал неоднородность полученных значений е-Ат и позволил установить диагностическую значимость их практического применения. Выявлено статистически значимое снижение уровня антител к дофамину, орфанину, ГАМК и глутамату после тренировочной нагрузки (табл. 1). Известно, что уровень е-Ат связан с изменением концентрации самих антигенов, которыми и являются указанные ЭБ. Поэтому одновременное увеличение по сравнению с контролем уровня антител к ЭБ торможения и возбуждения (ГАМК и глутамату) у спортсменов-хоккеистов свидетельствует о важности участия этих систем в адаптации к нагрузкам и их сбалансированности. У спортсменов после тренировки зарегистрировано снижение уровня е-Ат к орфанину. Изменение содержания антител к орфанину, характеризующее степень переносимости боли, показывает участие опиоидной системы в адаптивной реакции организма к физической нагрузке.

Проведено рассмотрение количественного распределения в группе обследованных спортсменов, имеющих отличия от контроля в содержании антител к исследуемым ЭБ в состоянии покоя и нагрузки (табл. 2). Отличительными показателями, установленными из средних по группе значений OD₄₅₀ ИФА для е-Ат к ЭБ, которые имеют достоверные для диагностики характеристики, являются серотонин, дофамин, орфанин, глутамат и ГАМК. Для серотонина в процентном соотношении не меняется количество спортсменов, имеющих отличия от контроля при нагрузке и покое. Для ГАМК зарегистрировано одновременное снижение количества хоккеистов с минимальными и максимальными показателями уровня е-Ат. В случае орфанина и глутамата, напротив возрастает количество спортсменов (10–15%) с пониженным содержанием антител при нагрузке. Для дофамина наблюдается обратная закономерность значительного снижения при нагрузке количества хоккеистов, имеющих как повышенный, так и пониженный уровень антител. Антитела к ЭБ отражают метаболизм антигенных мишеней, т.е. изменения в уровнях е-Ат косвенно свидетельствует о концентрации ЭБ и активности участия перечисленных выше биомолекул в регуляции биохимических реакций в процессе адаптации к физическим нагрузкам. Можно предположить, что незначительные колебания уровня е-Ат для серотонина и ГАМК у лиц обследованной группы свидетельствуют о сбалансированности и устойчивости указанных систем регуляции. В конечном итоге это приводит к стабильной физической форме, снижению уровня стресса, улучшению настроения, уменьшению беспокойства и способствуют спокойному сну. Напротив возрастание при физической нагрузке содержания е-Ат для орфанина и глутамата и снижение к дофамину у спортсменов предполагает их активное участие в адаптации. Доказано, что к повышению синтеза аминокислотных трансмиттеров после физических нагрузок, в том числе глутамата и ГАМК, приводит метаболизм углеводов без участия кислорода. Кроме того, физическая активность в течение предшествующей недели увеличивает уровень глутамата в крови [11]. Известно, что глутамат является основным нейромедиатором активации, а орфанин отвечает за развитие болевых ощущений. Можно предположить, что именно регуляторные качества этих систем важны для спортсменов, занимающихся хоккеем.

В проведенном исследовании установлена взаимосвязь биохимических показателей и уровня антител к ЭБ. Показана прямая связь концентрации глюкозы с уровнем антител ГАМК. Можно предположить, что превращение глюкозы в цикле Кребса приводит, в том числе и к образованию ГАМК. Содержание антител к серотонину имело обратную зависимость от концентрации железа в сыворотке крови, что вероятно связано с усталостью [12]. Серотонин оказывает вазоконстрикторный эффект и усиливает сократительные функции других вазоактивных веществ, например гистамина и ангиотензина, а также является регулятором периферического давления [13]. По литературным данным известно, что при адаптации к физической нагрузке спринтеров достоверно увеличивается значение КФК и креатинина [14]. В нашем исследовании установлен повышенный уровень КФК у 57% обследуемых спортсменов-хоккеистов до тренировки. Вероятно, более высокие показатели КФК связаны с высокой интенсивностью физической нагрузки, перенапряжением мышечной ткани и не полным восстановлением. Далее, для спортсменов с повышенной активностью КФК выявлена прямая связь с увеличением уровня антител к глутамату. Биохимические превращения глутамата происходят при участии аденозинфосфорной кислоты (АТФ), в образовании которого задействована КФК. Увеличение антител к глутамату косвенно может служить маркером креатинфосфокиназного механизма энергообразования (АТФ). Уровень тестостерона у мужчины оказывает анаболический эффект на мышечную ткань, влияет на биохимические показатели нейромедиаторов, участвующих в адаптации. Спортивные перегрузки могут снижать содержание тестостерона в крови [15]. В исследовании выявлена прямая связь концентрации тестостерона и уровня антител к серотонину, дофамину и глутамату, что может свидетельствовать о высокой интенсивности физической нагрузки, перенапряжением мышечной ткани и не полным восстановлением.

Полученные уравнения регрессии при многофакторном анализе (рис. 3 ) позволяют прогнозировать уровни антител к ЭБ после нагрузки от их содержания в покое до тренировки, а также проводить сопоставление с гематологическими и биохимическими показателями. Так, изменение содержания антител к дофамину после спортивной нагрузки было связано с их уровнем до тренировки и значениями гематокрита и гемоглобина. Иммунологические показатели (в данном случае антитела к ЭБ), полученные при анализе образцов до тренировки, позволят оценить адаптационные возможности организма спортсмена, сформировать тренировочную программу и выбрать дозированную нагрузку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено сравнительное исследование уровня антител к серотонину, гистамину, дофамину, глутамату, ГАМК, орфанину, β-эндорфину, ангиотензину в сыворотке крови спортсменов-хоккеистов. Выбор антигенных мишеней эндогенных биорегуляторов, входящих в указанную выше панель, связан с их участием в поддержании гомеостаза и адаптационного потенциала организма при физических нагрузках. Наиболее значимыми иммунологическими показателями для диагностики является е-Ат к орфанину, ГАМК и глутамату. Установлена взаимосвязь изменения уровня антител к серотонину, ГАМК и глутамату с биохимическими показателями КФК, глюкозы и железа. Проведен многофакторный анализ, позволяющий прогнозировать по уровню антител к ЭБ тренировочную нагрузку. Таким образом, определение статуса антител к ЭБ, наряду с биохимическими показателями, позволит дифференцировать типы и профиль ответа организма на физические нагрузки, определить степень усталости и возможность восстановления организма, определить стратегию коррекции измененных показателей.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены локальным биоэтическим комитетом Института физиологически активных веществ РАН (Черноголовка, Московская область).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Работа выполнена в соответствии с исследованием, согласно Госрегистрации № 01 200 952 666.

Благодарности. Авторы благодарят профессора А.А. Спасского и научного сотрудника Е.Д. Другову за предоставление материала при подготовке статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.