Физиология человека, 2019, T. 45, № 3, стр. 92-98

МЕТОДИКА

Материалом для исследования служили мононуклеарные лейкоциты, выделенные из венозной крови, взятой из локтевой вены утром натощак с помощью стандартных вакуумных систем “BD VACUTAINER^TM” (“Greiner-bio-one”, Австрия) с гепарином (20 ед./мл) у 50 больных РА (38 женщин и 12 мужчин в возрасте 36.4 ± 7.2 лет) и 20 доноров без заболевания РА (10 женщин и 10 мужчин в возрасте 35.3 ± 8.9 лет). Верификацию диагноза и набор пациентов в группы исследования осуществляли зав. ревматологическим отделением, заслуженный врач РФ И.П. Малинина на базе областной клинической больницы г. Калининграда (главный врач – заслуженный врач РФ К.И. Поляков). Постановку диагноза РА выполняли согласно приказу № 21 “Об утверждении стандарта медицинской помощи больным ревматоидным артритом” от 13 января 2006 г.

Диагностические исследования включали опрос пациентов, рентгенографию, компьютерную и ядерно-магнитно-резонансную (ЯМР)-томографию суставов, выявление ревматоидного фактора и титра антител к циклическому цитрулин-содержащему пептиду, оценку скорости оседания эритроцитов и С-реактивного белка. На основании оценки анамнеза болезни в исследование включили пациентов, отвечающих следующим критериям:

– активность болезни – ремиссия (DAS28 (визуальный калькулятор оценки активности заболевания при РА) < 2.6) (10 чел.) или низкая (DAS28 – 2.6–3.2) (40 чел.);

– ревматоидный фактор – серопозитивный;

– антитела к циклическому цитрулин-содержащему пептиду – серопозитивный;

– отсутствие терапии стероидными и цитостатическими препаратами с момента манифестации заболевания (не менее 6 мес.);

– продолжительность заболевания – не более года с момента постановки диагноза.

Критерием исключения пациентов из исследования явилось получение медикаментозной терапии (в том числе терапия ГК препаратами) на момент взятия крови и наличие внесуставных осложнений заболевания. Со всеми обследованными лицами подписали добровольное информационное согласие на исследование. Разрешение на проведение исследования получили в локальном этическом комитете (№ 2 от 11 ноября 2014 г.).

Мононуклеарные клетки (МНК) получали методом центрифугирования в градиенте плотности (1.077 г/см³) фиколл-урографина (“Pharmacia”, Швеция) по стандартной методике. Культуры T-клеток (CD3⁺CD45RO⁺) получали из МНК методом иммуномагнитной сепарации с использованием технологии MACS® (MidiMACS Separator, LS Columns, “Miltenyi Biotec”, Германия) и моноклональных антител к CD14 и CD45RО с парамагнитными частицами (MicroBeads human, Miltenyi Biotec, Германия), согласно протоколу фирмы-изготовителя. Использовали клеточные культуры, чистота которых после магнитной сепарации составляла в среднем 97.5 ± 2.12% (фенотип CD3⁺CD45RO⁺CD14⁻CD19⁻) (далее, CD3+CD45RO⁺ клетки). Число живых клеток в культурах составляло не менее 98%. CD3⁺CD45RO⁺ клетки (10⁶ кл./мл) культивировали в 48-луночном планшете в бессывороточной среде Искова (“Sigma”, США), содержащей 0.5% сывороточного альбумина человека (Микроген, Россия), 5 × 10⁻⁵ M β-меркаптоэтанола (“Acros Organic”, США) и 30 мкг/мл гентамицина, в присутствии синтетического ГК (МП) (“Orion Pharma”, Россия) в разных концентрациях или без него (контроль) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СO₂ в течение 48 ч. В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (“Miltenyi Biotec”, Германия) – антибиотиновые частицы MACSiBead ^тм с биотинилированными антителами против CD2⁺, CD3⁺, CD28⁺ человека (далее Ac/Exp). Использовали следующие варианты культивирования: 1) интактная проба (без добавления Ac/Exp и синтетических ГК); 2) проба с добавлением Ac/Exp; 3) пробы с добавлением Ac/Exp и разных концентраций МП (10.6; 21.3; 46.2; 85.3; 170.7 мг). Дозы МП, используемые в эксперименте, определили, исходя из математической фармакокинетической двухкамерной модели, где учитывался расчетный объем распределения ГК в организме [7].

Число клеток, несущих поверхностные маркеры (CD3, CD4, CD25, CD28, CD71, CD45RO), определяли методом проточной лазерной цитометрии с помощью моноклональных антител, конъюгированных с Viablue (CD45RO), аллофикоцианином (APC) (CD3) (“Miltenyi Biotec”, Германия), флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) (CD25), фикоэритрином (PE) (СD4), (“Abcam”, Cambridge, UK); с конъюгатом РЕ с цианином (PE-Cy7) (CD71) или с пиридинхлорофиллом (PerCP) (CD28) “e-Bioscience”, США) согласно методикам производителя. Регистрацию результатов проводили на проточном цитофлюориметре MACSQuant (“Miltenyi Biotec”, Германия). Все результаты цитометрического анализа проанализировали с помощью программы “KALUZA Analysis Software” (“Beckman Coulter”, США).

После инкубации клеточных культур тотальную РНК выделяли с использованием водного раствора фенола и гуанидин-изотиоцианата (ExtractRNA kit “Евроген”, Россия) согласно протоколу производителя. Обратную – проводили с использованием набора реагентов MMLV RT kit (“Евроген”, Россия) согласно протоколу производителя. В качестве затравки использовали олигонуклеотидный праймер (oligo(dT23), 20 мкМ) (“Бигль”, Россия). Для определения уровней относительной экспрессии генов проводили мультиплексный анализ ПЦР с использованием специфичных зондов TaqMan (“Бигль”, Россия). ПЦР проводили с использованием реагентов qPCRmixHS (“Евроген”, Россия) и праймеров в концентрации 10 пМ. В качестве матрицы использовали 4 мкл кДНК, в качестве референсного гена – ген GAPDH. Предварительную оценку специфичности праймеров, ампликонов и зондов проводили с помощью on-line программы BLAST. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых в эксперименте, а также протоколы амплификации, описаны ранее [6].

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences). Статистическую обработку данных ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени осуществляли с помощью специализированной программы REST 2009 v. 2.0.12. Уровень экспрессии исследуемых генов в контрольной группе приняли за 1 усл. ед.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ эффектов активатора и МП на реакции, характеризующие процессы активации и дифференцировки TCR-стимулированных CD3⁺CD4⁺CD45RO⁺Т-клеток, проведенный нами с учетом гендерных различий доноров без заболевания РА и больных РА, не выявил статистически достоверных отличий тестируемых параметров. На наш взгляд, отсутствие различий по половому признаку в модели исследования in vitro обусловлено тем фактом, что иммунокомпетентные клетки, в частности, Т-лимфоциты женщин и мужчин по сути не отличаются по функциям и фенотипу, а их рецепторный репертуар определяется гормональным фоном организма [8, 9].

Культивирование CD3⁺CD45RO⁺ клеток в присутствии активатора приводило к достоверному повышению числа CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих молекулу CD25, напротив, содержание CD4⁺CD28⁺ Т-лимфоцитов снижалось по сравнению с интактной пробой (табл. 1). Известно, что молекула CD25 экспрессируется на ранних этапах Т-клеточной активации и свидетельствует о пролиферативном и дифференцировочном потенциале клетки [10]. Молекула костимуляции CD28, в свою очередь, опосредует функциональную активность Т-лимфоцитов, участвуя в формировании иммунного синапса с последующей клональной экспансией Т-клеток [11, 12].

Инкубация TCR-активированных CD3⁺CD45RO⁺ клеток с МП (весь ряд используемых концентраций) сопровождалась снижением (р < 0.05) числа СD4⁺ клеток, экспрессирующих молекулы активации (CD25) и костимуляции (CD28) в контроле и у больных РА (табл. 1). Полученные нами результаты не противоречат данным литературы, раскрывающим геномные противовоспалительные эффекты ГК [10, 13, 14]. Кроме того, потеря экспрессии молекулы коактивации (CD28) ТCR-активированными CD3⁺CD45RO⁺ Т-клетками может косвенно указывать на процессы созревания Т-лимфоцитов под действием МП [6, 15].

Известно, что в процессе антигенной стимуляции Т-лимфоциты претерпевают активационные изменения, затрагивающие экспрессию молекулы CD45, которая является критическим регулятором сигнализации, опосредованной Т-клеточным рецептором (TCR) [16, 17]. Как уже упоминалось, регуляция альтернативного сплайсинга гликопротеина CD45 осуществляется за счет совместного действия двух факторов: сплайсинга U2AF26 (U2 smallnuclear RNA auxiliary factor 1 like 4, U2af1l4) и транскрипции Gfi1 (growth factor independent 1), реципрокное действие которых определяет соотношение коротких и длинных сплайсо-форм CD45 [3]. Так, экспрессия продукта гена U2af1l4 приводит к образованию короткой молекулы CD45 (CD45RO), тогда как Gfi1 способствует формированию высокомолекулярной изоформы CD45 – CD45RА, характерной, преимущественно, для наивных Т-лимфоцитов [3, 4, 13]. В процессе терминальной дифференцировки эффекторные клетки памяти (TEM) (CD3⁺CD45RO⁺CD28^–) могут реэкспрессировать длинный сплайс-вариант CD45 (CD45RА), образуя пул терминально-дифференцированных клеток (TEMRA, CD3⁺CD45RO^–CD45RА⁺CD28^–) [15].

Согласно полученным результатам, культивирование CD3⁺CD45RO⁺ Т-клеток в присутствии Ас/Ехр сопровождалось повышением уровня экспрессии гена Gfi1 в Т-лимфоцитах в обеих исследуемых группах, по сравнению с интактными пробами (рис. 1).

Рис. 1.

Относительный уровень ($\overline X $ ± SD) экспрессии гена Gfi1 в культурах CD3⁺CD45RO⁺Т-лимфоцитов здоровых доноров (“а”, n = 20) и больных ревматоидным артритом (“б”, n = 50), инкубируемых с Т-клеточным активатором (Ас/Ехр) и разными концентрациями метилпреднизолона (МП). а – группа здоровых доноров, б – группа больных РА. kont/exp – отношение уровня экспрессии мРНК в контрольных образцах (без воздействия) и образцов с добавлением Т-клеточного активатора; exp/МП (10.6; 21.3; 46.2; 85.3; 170.7 мг) – отношение уровня экспрессии мРНК в образцах с добавлением Т-клеточного активатора и в образцах с добавлением МП. * – достоверность различий экспрессии гена Gfi1 по сравнению с пробой kont/exp; ^◊ – достоверность различий экспрессии гена Gfi1 в культурах Т-лимфоцитов от здоровых доноров и больных РА.

Интересно, что Ас/Ехр значимо угнетал экспрессию гена U2af1l4 (в 35.43 раза) в Т-клетках здоровых доноров, напротив, у больных РА данный показатель возрастал в 2.2 раза по отношению к пробам без активатора (рис. 2). Добавление в TCR-активированные CD3⁺CD45RO⁺ культуры здоровых доноров МП (10.6–46.2 мг) сопровождалось снижением экспрессии гена Gfi1, тогда как увеличение дозы МП (85.3; 170.7 мг) в среде приводило к возрастанию данного показателя (рис. 1).

Рис. 2.

Относительный уровень ($\overline X $ ± SD) экспрессии гена U2af1l4 в культурах CD3⁺CD45RO⁺ Т-лимфоцитов от здоровых доноров (n = 20) и больных РА (n = 50), инкубируемых с Т-клеточным активатором (Ас/Ехр) и разными концентрациями метилпреднизолона (МП). Обозначения см. рис. 1.

У больных РА изменения уровня экспрессии гена Gfi1 в CD3⁺CD45RO⁺ Т-клетках под влиянием МП носило аналогичный характер (рис. 1). МП (весь спектр концентраций) повышал экспрессию гена U2af1l4 в культурах группы контроля и больных РА (рис. 2). Следует отметить, что эффекты МП, оказываемые на культуры больных РА, в отношении экспрессии генов Gfi1 и U2af1l4 носили дозозависимый характер (коэффициент регрессии r ² = 0.446; r ² = 0.622, р < 0.05, соответственно).

Основываясь на предположении, что МП может оказывать влияние на процессы созревания и дифференцировки CD3⁺CD4⁺CD45RO⁺ Т-клеток памяти, нами была проведена оценка влияния МП на содержание СD4⁺CD28^–CD45RO^– лимфоцитов в культурах TCR-активированных CD3⁺CD45RO⁺ клеток. Было обнаружено, что инкубация CD3⁺CD45RO⁺ Т-клеток с активатором сопровождалась ростом числа СD4⁺CD28^–CD45RO^– Т-лимфоцитов (табл. 1). МП дозозависимым образом увеличивал число СD4⁺CD28^–CD45RO^– клеток в TCR-активированных культурах Т-лимфоцитов здоровых доноров (коэффициент регрессии r ² = 0.897; р < 0.05) и больных РА (r ² = 0.922; р < 0.05). Важно отметить, что количество клеток СD4⁺CD28^–CD45RO^– в культурах, полученных у больных РА, превосходило таковое в пробах здоровых доноров, индуцированное действием МП (≈ в 1.5–2.0 раза) (табл. 1).

Проведенный корреляционный анализ позволил выявить взаимосвязи между содержанием СD4⁺CD28^–CD45RO^– клеток и уровнем относительной экспрессии мРНК гена Gfi1 в CD3⁺CD45RO⁺ Т-клетках в культурах у больных РА (r = 0.874 – при действии активатора, r = = 0.463, r = 0.563, r = 0.374 – при действии активатора и МП (46.2; 85.3; 170.7 мг, р < 0.05), а также отрицательные ассоциации между числом CD3⁺CD4⁺CD45RO⁺CD28⁺Т-клеток и содержанием СD4⁺CD28^–CD45RO^– лимфоцитов как у здоровых доноров (r = 0.342 – при действии активатора, r = 0.298, r = 0.563, r = 0.301 – при действии активатора и МП (46.2; 170.7 мг) р < 0.05, соответственно), так и у больных РА (r = 0.562 – при действии активатора, r = 0.549, r = 0.672, r = 0.800 – при действии активатора и МП (46.2; 85.3; 170.7 мг) р < 0.05, соответственно), что подтверждает верность выдвинутой гипотезы и свидетельствует об МП-индуцированном созревании Т-клеток в терминальные эффекторы как в норме, так и при РА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно говорить о направленном влиянии МП в условиях in vitro на терминальные стадии дифференцировки CD4⁺ Т-клеток памяти в норме при РА, что способствует появлению пула TEMRA лимфоцитов. Последние, согласно данным литературы, обладают выраженными цитотоксическими свойствами (гранзимовые и перфориновые гранулы) и высоким провоспалительным потенциалом [15], утрачивая при этом пролиферативную активность [6].

Можно предположить, что на фоне системного супрессирующего эффекта ГК, у больных РА происходит формирование резистентной к их действию популяции эффекторных TEMRA лимфоцитов (CD4⁺CD45RO^–CD28^–), которая способствует прогрессии заболевания, в частности, за счет мощного выброса провоспалительных факторов. Ранее нами был продемонстрирован высокий провоспалительный потенциал эффекторной (TEM) популяции Т-клеток с фенотипом – CD4⁺CD28^–CD45RO⁺ у больных РА (но не у здоровых доноров), который сохранялся на фоне действия ГК в условиях in vitro [18]. Безусловно, дальнейшая работа в контексте изучаемой тематики, должна быть направлена на расшифровку спектра реакций эффекторных (потенциально аутореактивных/артритогенных) Т-клеток на глюкокортикоидную терапию, для расширения фундаментальных знаний о патогенезе РА (с точки зрения Т-клеточной парадигмы) и разработки методологических основ оптимального (патогенетически оправданного) персонализированного фармакологического лечения заболевания.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены этическим комитетом Балтийского федерального университета им. И. Канта (Калининград).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Работа выполнена в рамках субсидии “Организация проведения научных исследований 20.4986.2017/6.7” Балтийского федерального университета им. И. Канта (Калининград).

Благодарности. Выражаем благодарность зав. ревматологическим отделением, заслуженному врачу РФ И.П. Малининой областной клинической больницы г. Калининграда (главный врач – заслуженный врач РФ, К.И. Поляков) за помощь в верификации диагноза и наборе пациентов в группы исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.